羅雨晴，盛 浩，袁 紅，周 清，張 亮1，*

(1. 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)東方科技學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410128；2. 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)資源環(huán)境學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410128)

【研究意義】瓜類疫霉菌(Phytophthoramelonis)是一種嚴(yán)重威脅蔬菜產(chǎn)量與品質(zhì)的惡劣土傳病原真菌，能夠侵染黃瓜、土豆以及茄科等多種寄主，防治難度大。因此，研究該菌種的致病機(jī)理對(duì)于防止作物土傳病害有著重要的意義。【前人研究進(jìn)展】隨著綠色生物防治研究的興起，根際促生菌等有益微生物逐漸被證實(shí)為土傳病原菌的天然克星，更是提高植物抗逆性與土壤生態(tài)修復(fù)的綠色好伙伴[1-2]?，F(xiàn)有生防菌作用機(jī)理研究結(jié)果證實(shí)在“植物-病原菌-促生菌”互作模式下部分生防菌具有誘導(dǎo)植物系統(tǒng)性抗性(ISR)，能夠作為受非致病微生物誘導(dǎo)寄主植株產(chǎn)生一系列系統(tǒng)性抗性，從而協(xié)助寄主作物防御致病微生物的侵害[3-5]?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】苯丙烷類代謝途徑是植物次生代謝產(chǎn)物合成的重要途徑，其下游分支途徑中的木質(zhì)素與黃酮類合成途徑所生成的多種代謝產(chǎn)物在植物抵抗病害方面具有非常重要的作用[6-8]。多粘性芽孢桿菌LRS-1篩選于酸性水稻土壤，前期溫室試驗(yàn)證實(shí)該菌株對(duì)包括疫霉病等土傳病害具有良好的防治效果和生防潛力[9]?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】為深入探究該菌株在“植物-病原菌-促生菌”互作模式中是否具有ISR機(jī)制，筆者運(yùn)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)對(duì)“黃瓜-疫霉菌-LRS-1”互作進(jìn)程中黃瓜根內(nèi)苯丙烷類代謝基因及其關(guān)鍵性的路徑調(diào)控基因的表達(dá)進(jìn)行了分析，以期從誘導(dǎo)植物系統(tǒng)抗性的角度揭示LRS-1的生防作用機(jī)制，從而為該生防菌后續(xù)的深入研究與利用提供必要的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試誘導(dǎo)菌株為多粘類芽孢桿菌(Paenibacilluspolymyxa)LRS-1，保存于本實(shí)驗(yàn)室；病原菌為疫霉菌PhytophthoramelonisTX-8 (P.m)，由湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院提供；所有菌株均保存于-80 ℃。

供試黃瓜品種：蔬研十號(hào)(長(zhǎng)沙興蔬種業(yè)有效公司)。

供試土壤：水稻土，有機(jī)質(zhì)含量為15.4 g·kg-1，pH 5.4。

1.2 培養(yǎng)基、引物、PCR試劑與試劑盒

NBY培養(yǎng)基：營(yíng)養(yǎng)肉湯粉8 g，酵母提取物2 g，磷酸氫二鉀2 g， 磷酸二氫鉀0.5 g，葡萄糖2.5 g，1M七水合硫酸鎂 1 mL，去離子水1 L，瓊脂18 g；PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，去離子水1 L，瓊脂18 g。液體培養(yǎng)時(shí)均不添加瓊脂。

試劑：SYBRTMSafe DNA染料(Invitrogen公司)，SYBR green master mix (SsoFast公司)，DEPC水(Invitrogen公司)。

試劑盒：RNeasy Plant Mini植物總RNA提取試劑盒，RNeasy純化試劑盒以及SuperScript?RIII反轉(zhuǎn)錄試劑盒，均購(gòu)自于江蘇康為世紀(jì)生物科技有限公司。

引物：見(jiàn)表1(武漢奧科鼎盛生物科技有限公司合成)。

表1 黃瓜苯丙烷類代謝關(guān)鍵基因與調(diào)控路徑基因表達(dá)RT-PCR檢測(cè)引物

1.3 誘導(dǎo)試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)共布置4個(gè)處理，分別為清水陰性對(duì)照(CK)、黃瓜疫霉病陽(yáng)性對(duì)照(P.m)、疫霉菌+多粘芽孢桿菌誘導(dǎo)(LRS-1+P.c)、多粘芽孢桿菌誘導(dǎo)(LRS-1)。

誘導(dǎo)劑制備[10]：挑取純化后的LRS-1單菌落并接種于液體NBY培養(yǎng)基中，于180 r·min-1、室溫條件下振蕩培養(yǎng)48 h，離心，生理鹽水懸浮(109CFU·mL-1)后與滅菌泥炭粉按1∶10比例(V∶M)混合均勻作為誘導(dǎo)劑(108CFU·mL-1)，備用。

感病土壤配制：接種病原菌(P.m)于PDB培養(yǎng)基，于24 ℃、180 r·min-1條件下振蕩培養(yǎng)120 h，雙層滅菌紗布過(guò)濾，無(wú)菌水稀釋至106CFU·mL-1，與健康壤土按1∶10(V∶M)比例混合，備用。

盆栽誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)：每盆(直徑10 cm)含200 g感病土壤并移栽3葉1心黃瓜幼苗1株，每株根部包裹3 g相應(yīng)處理的誘導(dǎo)劑，以清水無(wú)菌泥炭包裹處理為對(duì)照。每個(gè)處理設(shè)24盆。日常管理。

1.4 樣品采集

分別于試驗(yàn)第12、24、48、72小時(shí)(相同時(shí)間點(diǎn))后，各處理隨機(jī)挑選3盆，輕輕拔離植株根部周?chē)馏w，自來(lái)水快速?zèng)_洗，無(wú)菌紙吸干，置于液氮運(yùn)輸并轉(zhuǎn)-80 ℃冰箱保存、備用。

1.5 RT-PCR基因表達(dá)監(jiān)測(cè)

模板制備：稱取0.1 g黃瓜根部樣品，試劑盒法提取植物總RNA，純化，分別進(jìn)行核酸儀濃度監(jiān)測(cè)與1 %瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

反轉(zhuǎn)錄：分別以0.5 μg RNA為模板與oligo (dT 12-18) 引物按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒操作步驟配制20 μl反應(yīng)體系，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，備用。

RT-PCR檢測(cè)：經(jīng)CFX96實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀檢測(cè)完成。10 μl PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系為：3 μl(1/10稀釋)cDNA, 1 μl 0.5 μΜ引物(F/R), 5 μl SYBR green master mix。反應(yīng)條件為：95 ℃ 30 s，95 ℃ 15 s, 60 ℃ 30 s, 72 ℃延長(zhǎng)30 s，40個(gè)循環(huán)。每次檢測(cè)均在反應(yīng)完成后再進(jìn)行一個(gè)72～95 ℃的反應(yīng)溶解曲線對(duì)檢測(cè)基因的擴(kuò)增進(jìn)行單峰特異性檢驗(yàn)。每個(gè)樣品的定量PCR反應(yīng)重復(fù)3次。以Actin內(nèi)參基因表達(dá)值作參比，計(jì)算各樣品目的基因的相對(duì)表達(dá)量[11]。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

數(shù)據(jù)采用Excel 2010、DPS軟件進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 多粘芽孢桿菌LRS-1誘導(dǎo)黃瓜苯丙烷類代謝關(guān)鍵基因表達(dá)

通過(guò)數(shù)據(jù)分析可以看出，與清水陰性對(duì)照相比，各處理黃瓜根系的苯丙烷類代謝關(guān)鍵基因都能被誘導(dǎo)表達(dá)，其基因表達(dá)情況因處理及誘導(dǎo)時(shí)間的不同而存在差異(圖1～3)。

就PAL基因情況而言，與對(duì)照相比，各接種處理的PAL基因均隨時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸表達(dá)上調(diào)；病原菌陽(yáng)性對(duì)照處理(P.m)在72 h時(shí)達(dá)到最高，其相對(duì)基因表達(dá)量為對(duì)照基因表達(dá)量的2.65倍；P.m+LRS-1誘導(dǎo)處理與單獨(dú)LRS-1誘導(dǎo)處理的PAL基因的相對(duì)表達(dá)量則在48 h時(shí)出現(xiàn)峰值，此時(shí)的相對(duì)基因表達(dá)量分別為對(duì)照的2.60和1.82倍(圖1)。

圖1 黃瓜疫霉菌脅迫下接種多粘類芽孢桿菌LRS-1對(duì)黃瓜PAL基因表達(dá)的影響Fig.1 Expression of the PAL gene on cucumber inoculated with P.b LRS-1 under P.m stress

對(duì)C4H基因研究發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照相比，各接種處理的C4H基因均隨時(shí)間的延長(zhǎng)而呈現(xiàn)出遞增表達(dá)趨勢(shì)；即72 h的相對(duì)基因表達(dá)量最高，其中病原菌陽(yáng)性對(duì)照處理(P.m)在72 h的相對(duì)基因表達(dá)量為對(duì)照的2.00倍，而P.m+LRS-1誘導(dǎo)處理與單獨(dú)LRS-1誘導(dǎo)處理的C4H基因的相對(duì)表達(dá)量則分別為對(duì)照的3.18和1.55倍(圖2)。

圖2 黃瓜疫霉菌脅迫下接種多粘類芽孢桿菌LRS-1對(duì)黃瓜C4H基因表達(dá)的影響Fig.2 Expression of the C4H gene on cucumber inoculated with P.b LRS-1 under P.m stress

如圖3所示，與對(duì)照相比，24 h內(nèi)黃瓜CHS基因均能倍誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá)，但12 與24 h時(shí)的相對(duì)表達(dá)量變化不大，而24 h后的相對(duì)表達(dá)量則明顯增加，并在72 h時(shí)最高，其中病原菌陽(yáng)性對(duì)照處理(P.m)在第72小時(shí)的相對(duì)基因表達(dá)量為對(duì)照的2.59倍，而P.m+LRS-1誘導(dǎo)處理與單獨(dú)LRS-1誘導(dǎo)處理的CHS基因的相對(duì)表達(dá)量則分別為對(duì)照的2.76和1.63倍。

圖3 黃瓜疫霉菌脅迫下接種多粘類芽孢桿菌LRS-1對(duì)黃瓜CHS基因表達(dá)的影響Fig.3 Expression of the CHS gene on cucumber inoculated with P.b LRS-1 under P.m stress

2.2 多粘芽孢桿菌LRS-1誘導(dǎo)黃瓜系統(tǒng)性抗性信號(hào)調(diào)控路徑監(jiān)測(cè)

如圖4所示，與對(duì)照相比，第12小時(shí)起，各接種處理根系的LOX1基因均受到誘導(dǎo)而上調(diào)表達(dá)量，且峰值均出現(xiàn)于第24小時(shí)，然后增幅逐漸降低；就峰值水平而言，不同接種處理的LOX1相對(duì)基因表達(dá)量表現(xiàn)為P.m+LRS-1>LRS-1>P.m，分別為對(duì)照相對(duì)表達(dá)量的1.60、2.33、2.13倍。

圖4 黃瓜疫霉菌脅迫下接種多粘類芽孢桿菌LRS-1對(duì)黃瓜茉莉酸信號(hào)調(diào)控路徑基因LOX1表達(dá)的影響Fig.4 Expression of the jasmonic acid (JA) pathway regulated gene LOX1 on cucumber inoculated with P.b LRS-1 under P.m stress

如圖5所示，與對(duì)照相比，接種了多粘芽孢桿菌LRS-1的2個(gè)處理(P.m+LRS-1與LRS-1)的ETR1基因表達(dá)均隨時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸上調(diào)，且在72 h時(shí)表現(xiàn)最高，其相對(duì)表達(dá)量分別為對(duì)照的4.53和4.30倍；病原菌處理(P.m)根系的ETR1基因表達(dá)雖然略有上調(diào)，但增幅不大，且表現(xiàn)較為波動(dòng)。

圖5 黃瓜疫霉菌脅迫下接種多粘類芽孢桿菌LRS-1對(duì)黃瓜乙烯信號(hào)調(diào)控路徑基因ETR1表達(dá)的影響Fig.5 Expression of the ethylene (ET) pathway regulated gene ETR1 on cucumber inoculated with P.b LRS-1 under P.m stress

3 討 論

苯丙烷類代謝已被證實(shí)在類黃酮素和木質(zhì)素等合成中具有關(guān)鍵作用，其代謝強(qiáng)弱是表征植物抵御病原菌侵染能力的重要體現(xiàn)。有關(guān)植物苯丙烷類代謝研究的相關(guān)報(bào)道顯示，采用接種水楊酸、檸檬酸、苯丙噻重氮(BTH)、殼聚糖、茉莉酸甲酯等化學(xué)物質(zhì)以及尖鐮孢、鐮刀菌等微生物后能夠誘導(dǎo)植物產(chǎn)生并獲得抗性[16-21]。本文結(jié)合根部接種誘導(dǎo)盆栽試驗(yàn)與熒光定量PCR檢測(cè)技術(shù)對(duì)多粘類芽孢桿菌LRS-1誘導(dǎo)黃瓜寄主根系苯丙烷類代謝基因PAL、C4H、CHS等關(guān)鍵基因以及乙烯、茉莉酸等誘導(dǎo)信號(hào)調(diào)控路徑關(guān)鍵基因的表達(dá)予以了研究。試驗(yàn)結(jié)果表明單獨(dú)接種疫霉菌能夠誘導(dǎo)黃瓜寄主根系獲得SAR抗性反應(yīng)，單獨(dú)接種多粘性芽孢桿菌LRS-1可誘導(dǎo)黃瓜根系產(chǎn)生ISR抗性反應(yīng)，而疫霉病原菌脅迫條件下的黃瓜根系相關(guān)防御基因的表達(dá)則受SAR和ISR共同作用的影響。與陰性對(duì)照相比，無(wú)論是接種疫霉菌或多粘性芽孢桿菌LRS-1均可誘導(dǎo)黃瓜根系組織的PAL、C4H、CHS等苯丙烷類代謝關(guān)鍵基因的表達(dá)進(jìn)行上調(diào)，各基因的誘導(dǎo)表達(dá)效果與規(guī)律與SAR和ISR抗性誘導(dǎo)生物源類型及誘導(dǎo)時(shí)間有關(guān)，證實(shí)了多粘芽孢桿菌LRS-1對(duì)苯丙烷類代謝基因具有誘導(dǎo)效應(yīng)。接種疫霉菌后，黃瓜根系的茉莉酸調(diào)控路徑關(guān)鍵基因LOX1的相對(duì)表達(dá)量在第1天時(shí)就已達(dá)到最高水平，暗示了疫霉菌對(duì)黃瓜植株的SAR抗性誘導(dǎo)主要依賴于茉莉酸調(diào)控途徑；接種多粘類芽孢桿菌LRS-1第1天，黃瓜植株的茉莉酸調(diào)控路徑關(guān)鍵基因LOX1的相對(duì)表達(dá)量也達(dá)到最高水平，且乙烯傳導(dǎo)路徑關(guān)鍵調(diào)控基因的相對(duì)表達(dá)量隨誘導(dǎo)時(shí)間的延長(zhǎng)而明顯上調(diào)，表明該生防菌對(duì)黃瓜寄主具有ISR抗性誘導(dǎo)且該防御機(jī)制主要依賴茉莉酸和乙烯調(diào)控路徑。Pieterse等研究發(fā)現(xiàn)受茉莉酸和乙烯信號(hào)傳導(dǎo)路徑調(diào)控的誘導(dǎo)植物系統(tǒng)性抗性(ISR)是根際促生菌防控植物病原菌侵染的重要機(jī)制之一[22]。本研究結(jié)果即證實(shí)了多粘芽孢桿菌類生防微生物能夠誘導(dǎo)植物ISR抗性反應(yīng)，佐證了相關(guān)報(bào)道，也為完善生防菌在誘導(dǎo)寄主植物苯丙烷類代謝途徑抗性表達(dá)方面提供了理論依據(jù)。

4 結(jié) 論

(1)單獨(dú)接種疫霉菌可誘導(dǎo)黃瓜獲得SAR抗性，單獨(dú)接種多粘性芽孢桿菌LRS-1可誘導(dǎo)黃瓜產(chǎn)生ISR抗性，而疫霉病原菌脅迫條件下黃瓜相關(guān)防御基因的表達(dá)受SAR和ISR共同影響。

(2)黃瓜PAL、C4H、CHS等苯丙烷類代謝關(guān)鍵基因接受誘導(dǎo)表達(dá)的效果和規(guī)律與誘導(dǎo)源類型及誘導(dǎo)時(shí)間有關(guān)。

(3)疫霉菌對(duì)黃瓜SAR抗性誘導(dǎo)主要依賴于茉莉酸調(diào)控途徑，而多粘類芽孢桿菌LRS-1對(duì)黃瓜ISR抗性誘導(dǎo)主要依賴茉莉酸和乙烯調(diào)控路徑。