郭冬陽 洪秀芳 沈靈芝 毛根祥 楊舟鑫

內(nèi)毒素，即脂多糖（lipopolysaccharide，LPS），是革蘭陰性菌細(xì)胞壁的主要成分，它作為一種重要的病原相關(guān)分子模式（pathogen-associated molecular pattern，PAMPs）被免疫細(xì)胞表面的模式識(shí)別受體（pattern recognition receptor，PRRs）識(shí)別后，會(huì)激活下游信號(hào)通路，引起宿主細(xì)胞炎癥因子的產(chǎn)生和釋放，過量的炎癥因子釋放會(huì)導(dǎo)致一系列炎癥性疾病的發(fā)生，甚至膿毒癥或膿毒癥休克[1-2]。心臟微血管內(nèi)皮細(xì)胞（cardiac microvascular endothelial cells，CMECs）與體內(nèi)其他組織的內(nèi)皮細(xì)胞類似，具有屏障、物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)、抗凝、促凝、調(diào)節(jié)血管收縮等作用，其功能障礙導(dǎo)致的血管通透性改變被認(rèn)為是LPS 感染引起心肌損傷的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一[3-4]。人參屬傘形目五加科，作為傳統(tǒng)中藥材，自古就被譽(yù)為“百草之王”，有研究證明人參的肉質(zhì)根可用于調(diào)整血壓、恢復(fù)心臟功能、神經(jīng)衰弱及身體虛弱等癥。人參二醇（20 R-panaxadiol，PD）是人參、三七、西洋參、絞股藍(lán)等藥用植物中皂苷類物質(zhì)的主要苷元，其分子量極小，更利于機(jī)體吸收發(fā)揮藥理活性[5]。有研究表明，PD 能夠有效抑制腫瘤細(xì)胞增殖，被認(rèn)為是極具前景的抗癌藥物[6-7]。但是它在內(nèi)毒素引起的CMECs 損傷中是否發(fā)揮一定作用及其相關(guān)分子機(jī)制還鮮有報(bào)道。本研究中采用LPS 和LPS 聯(lián)合PD 處理大鼠CMECs，利用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序（RNA-seq）技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組變化，并采用定量PCR 對(duì)部分差異基因進(jìn)行驗(yàn)證，旨在研究LPS 感染狀態(tài)下，PD 對(duì)CMECs 基因表達(dá)的影響，篩選出差異表達(dá)基因和相關(guān)信號(hào)通路，探討PD 在LPS 引起的心血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷中的作用，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和試劑 SD 大鼠購買并飼養(yǎng)于浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，月齡1～2 個(gè)月，體重100～150g。DMEM 培養(yǎng)基、胎牛血清購自美國Gibco公司；Ⅱ型膠原酶、0.25%胰蛋白酶購自美國Sigma公司；內(nèi)皮生長因子購自美國PeproTech 公司。實(shí)驗(yàn)操作均得到浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞分離及培養(yǎng) SD 大鼠麻醉后通過腹腔注射肝素抗凝20min，消毒后取出心臟組織，用D-Hanks 液洗滌數(shù)次；去除左右心房、室間隔和右心室，浸入75%乙醇中20～30s，之后剪除左心室游離壁外部約1/4 及心內(nèi)膜，剩余心肌組織充分減碎至約1mm3小塊，D-Hanks 洗滌2 次后，加入約1ml 0.2%Ⅱ型膠原酶，置于37℃水浴中孵育30min；再加入等體積的0.02%胰酶，輕輕吹打后37℃震蕩孵育20min，至大部分組織塊消化完全。最后，加入含20%血清的培養(yǎng)液終止消化，經(jīng)200 目篩網(wǎng)過濾，4℃條件下，1 000r/min 離心5min，D-Hanks 洗滌后收集細(xì)胞。收集的CMECs 用完全培養(yǎng)基（含20%胎牛血清及生長因子）重懸后接種于10cm 培養(yǎng)皿中，4h 后棄去未貼壁細(xì)胞。貼壁的CMECs 用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 RNA 提取和測(cè)序 原代CMECs 接種于6 孔板中，分別用LPS（100ng/ml）（LPS 組） 或LPS（100ng/ml）+PD（10μg/ml）處理（LPS+PD 組），每組3個(gè)復(fù)孔，6h 后收集細(xì)胞，Trizol 法提取總RNA，并進(jìn)行質(zhì)量控制。按照美國Illumina 生物技術(shù)公司RNA-seq 樣本制備試劑盒（mRNA-Seq sample preparation kit）說明構(gòu)建cDNA 文庫。對(duì)照大鼠的基因組信息和完整的轉(zhuǎn)錄組信息，將測(cè)序出的reads比對(duì)到參考基因組上，進(jìn)而對(duì)基因或轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行注釋和定量。將reads 比對(duì)到基因組后，采用StringTie（2016）對(duì)表達(dá)進(jìn)行注釋和定量。StringTie 應(yīng)用網(wǎng)絡(luò)流算法和可選的denovo 組裝，將復(fù)雜的數(shù)據(jù)集組裝成轉(zhuǎn)錄本。進(jìn)一步計(jì)算基因和轉(zhuǎn)錄本的FPKM 值（每百萬外顯子片段堿基映射獲得的基因表達(dá)）。

1.2.3 差異轉(zhuǎn)錄本分析 利用Ballgown 對(duì)兩個(gè)不同處理組進(jìn)行比較，得到P值、Q值和轉(zhuǎn)錄本間的差異倍數(shù)（fold-change）；本研究中將兩組進(jìn)行比較，進(jìn)行差異基因篩選，篩選條件為P＜0.05 和Fold change＞1.5 倍及＜0.66667 倍。

1.2.4 GO 功能類別及通路富集分析 GO 數(shù)據(jù)庫用樹狀分層的方式對(duì)基因及蛋白功能進(jìn)行詳細(xì)描述，闡明了基因功能之間的層次關(guān)系。并將基因功能分為：分子功能（molecular function）、生物學(xué)過程（biological pathway）和細(xì)胞成分（cellular component）3 個(gè)類別。KEGG（kyoto encyclopedia of genes and genomes）是系統(tǒng)分析基因及其編碼產(chǎn)物間關(guān)系、基因功能、基因組信息的數(shù)據(jù)庫，信號(hào)通路分析（Pathway 分析）是基于KEGG 數(shù)據(jù)庫，對(duì)差異基因利用Fisher 精確檢驗(yàn)和χ2檢驗(yàn)，將目標(biāo)基因參與的通路進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，按照P＜0.05 進(jìn)行篩選，篩選出顯著性差異的信號(hào)通路。

1.2.5 定量PCR 驗(yàn)證 將測(cè)序的RNA 樣本逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，對(duì)趨化因子配體（chemokine ligand，CCL）-11、白介素（interleukin，IL）-22、IL-17、基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）-9 和表皮生長因子（epidermal growth factor，EGF）5 個(gè)基因進(jìn)行定量PCR驗(yàn)證，定量PCR 使用SYBR R Premix ExTaq 進(jìn)行分析，目的基因的mRNA 表達(dá)量均以β-actin 作為內(nèi)參，用2-△△CT最小二乘法進(jìn)行計(jì)算。每個(gè)樣本重復(fù)3 個(gè)復(fù)孔，每次實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3 次以上，以保證結(jié)果的穩(wěn)定性。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用Graphpad7.0 統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以表示，組間比較采用配對(duì)t檢驗(yàn)。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 RNA-seq 聚類分析結(jié)果見插頁圖1。

由插頁圖1 可見，不同處理組能夠完整分開，兩者對(duì)應(yīng)的轉(zhuǎn)錄本表達(dá)差異較大，其中，紅色代表差異轉(zhuǎn)錄本在分組樣本中表達(dá)值高，綠色代表差異轉(zhuǎn)錄本在分組樣本中表達(dá)值低。通過對(duì)兩個(gè)處理組進(jìn)行比較，得到2 256 個(gè)差異表達(dá)基因，其中上調(diào)表達(dá)基因845 個(gè)，下調(diào)表達(dá)基因1 411 個(gè)。

2.2 差異基因顯著富集的GO 分析結(jié)果見圖2。

根據(jù)2.1 分析結(jié)果中下調(diào)表達(dá)的差異基因的顯著性水平構(gòu)建分布圖，可見在分子功能、生物學(xué)過程和細(xì)胞成分3 個(gè)類別基因中，顯著下調(diào)的功能基因主要富集于：細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)和離子通道相關(guān)蛋白（離子轉(zhuǎn)運(yùn)體、鈣離子、氯離子、金屬離子跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)等）、轉(zhuǎn)錄活性調(diào)節(jié)以及表觀遺傳修飾（組蛋白H3-K4 三甲基化修飾、表觀遺傳的負(fù)調(diào)控）等。

2.3 差異表達(dá)基因的通路顯著性富集分析結(jié)果見插頁圖3。

由插頁圖3 可見，通過KEGG 數(shù)據(jù)庫分析，下調(diào)基因明顯富集于炎癥相關(guān)的信號(hào)通路：PI3K-Akt 信號(hào)通路、MAPK 信號(hào)通路、IL-17 信號(hào)通路、趨化因子信號(hào)通路、cAMP 信號(hào)通路、補(bǔ)體相關(guān)通路等，此外還有一些代謝相關(guān)信號(hào)通路（甘油磷脂代謝和膽堿代謝等）。說明PD 主要影響炎癥信號(hào)通路表達(dá)。

2.4 定量PCR 驗(yàn)證結(jié)果見圖4。

由圖4 可見，通過對(duì)測(cè)序結(jié)果中差異表達(dá)的5個(gè)基因（CCL-11、IL-22、IL-17、MMP-9 和EGF）進(jìn)行定量PCR 驗(yàn)證，證明這5 個(gè)基因的表達(dá)趨勢(shì)與測(cè)序結(jié)果一致，PD 處理后能顯著抑制CCL-11、IL-22、IL-17、MMP-9 和EGF 基因的表達(dá)，且差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），其中MMP-9 基因在PD 處理后差異顯著（P＜0.01）。

3 討論

革蘭陰性菌感染過程中，機(jī)體會(huì)產(chǎn)生一系列免疫應(yīng)答反應(yīng)以清除病原，而免疫應(yīng)答失控會(huì)導(dǎo)致疾病的發(fā)生，甚至膿毒癥或膿毒癥休克這類危及生命的重癥[8-9]。LPS 感染引發(fā)的炎癥反應(yīng)甚至膿毒癥及膿毒癥休克過程中，心臟組織的受損不可避免，而內(nèi)皮細(xì)胞在其中扮演著重要角色[10]。很多研究揭示了LPS 感染與心肌損傷的關(guān)系：LPS 感染首先被免疫細(xì)胞識(shí)別并引發(fā)炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞骨架重構(gòu)、VE-鈣黏附素的變化引起CMECs 間黏附連接結(jié)構(gòu)解體，結(jié)構(gòu)改變，血管通透性增加，大量液體滲入心臟組織間隙，加重組織浮腫與細(xì)胞缺氧；炎性細(xì)胞大量吸附與浸潤心肌，造成心肌細(xì)胞損傷[11-12]。本研究探討了中藥單體——PD 對(duì)LPS 引發(fā)的CMECs 細(xì)胞基因表達(dá)變化的影響，旨在探討PD 對(duì)LPS 引起的CMECs 基因表達(dá)變化的影響及分子機(jī)制。

圖2 差異基因顯著富集的GO 分析結(jié)果（縱坐標(biāo)為差異基因的功能名稱，橫坐標(biāo)為P 值的負(fù)對(duì)數(shù)（-LgP），其值越大表明P 值越小，亦即該差異基因功能顯著性水平越高）

圖4 熒光定量PCR 驗(yàn)證相關(guān)基因的表達(dá)差異（與LPS 組比較，*P＜0.05，**P＜0.01）

人參是一種傳統(tǒng)的中藥材，對(duì)其有效成分人參皂苷（Rb1、Rb2、Rb3、Rc、Rd、Rh2 及Rg3 等）的藥理作用已經(jīng)有了廣泛的研究，它們被證明在心血管疾病方面發(fā)揮一定的保護(hù)作用，能夠拮抗鈣離子通道在心肌缺血和再灌注中發(fā)揮保護(hù)作用；并能調(diào)整心肌細(xì)胞的能量代謝、抵抗心肌炎癥等。Rb1 能夠改善炎癥誘導(dǎo)的動(dòng)脈粥樣硬化[13]，抑制腫瘤壞死因子α（tumour necrosis factor-α，TNF-α）、IL-6 等炎癥因子的表達(dá)；此外，在心肌缺血再灌注損傷中，Rb1、Rb3 和Rd 均能夠減少心臟的梗死面積，降低血清中的肌酸激酶（creatine kinase，CK）、乳酸脫氫酶（lactic dehydrogenase，LDH）和心肌肌鈣蛋白Ⅰ（troponinI，cTnI）的水平，從而提高缺血再灌注后的心肌功能[14-16]。PD 分子量極小，更利于機(jī)體吸收發(fā)揮藥理活性。但是其在LPS 引起的CMECs 損傷中是否發(fā)揮一定作用及其相關(guān)分子機(jī)制研究還較少。我們的研究通過RNA-seq 高通量測(cè)序技術(shù)在CMECs 中系統(tǒng)檢測(cè)了PD 對(duì)LPS 引起的基因表達(dá)改變的影響，根據(jù)RNA-seq 結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)，PD 處理能夠顯著降低LPS 感染引起的部分基因表達(dá)改變，包括一些轉(zhuǎn)錄因子活性基因、離子通道相關(guān)基因、表觀遺傳調(diào)節(jié)基因等，其中表達(dá)顯著降低的基因主要集中在免疫相關(guān)信號(hào)通路（IL-17、PI3K-Akt、MAPK 信號(hào)通路等）、表觀遺傳通路以及CMECs 細(xì)胞代謝相關(guān)通路（膽堿、甘油磷脂代謝等），說明PD 可以抑制炎癥反應(yīng)，可能對(duì)LPS 引起的CMECs 炎癥反應(yīng)發(fā)揮抑制效應(yīng)。此外，PD 能夠顯著改變表觀遺傳相關(guān)基因的表達(dá)，如組蛋白H3-K4 三甲基化修飾酶等，我們推測(cè)它可能通過影響表觀遺傳酶，調(diào)控轉(zhuǎn)錄活性影響炎癥等相關(guān)基因的表達(dá)。

本研究結(jié)果對(duì)于揭示PD 的作用機(jī)制和作用靶點(diǎn)，以及對(duì)心血管內(nèi)皮細(xì)胞基因表達(dá)的影響提供了系統(tǒng)性的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，可能為臨床上革蘭陰性菌感染的治療提供一定的理論依據(jù)。