高佳兒 魏文娟 黃建振 彭俊 張靜 陸云燕

難治性高血壓是一種特殊類型的高血壓，是多種遺傳因素和環(huán)境因素共同作用引起的復(fù)雜性疾病。相對于血壓控制的高血壓患者，難治性高血壓患者有著更明顯的靶器官損害，并且心血管事件發(fā)生風(fēng)險明顯增加[1-2]。目前國內(nèi)外對于原發(fā)性高血壓致病基因的研究有了較多發(fā)現(xiàn)[3-6]，但對于難治性高血壓相關(guān)基因多態(tài)性的研究卻較少。Lynch 等[7]發(fā)現(xiàn)血管緊張素原（angiotensinogen，AGT）基因兩個單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，SNP）位點變異與歐洲裔美國人難治性高血壓相關(guān)，與非洲裔美國人卻無相關(guān)性，提示該基因多態(tài)性與難治性高血壓的關(guān)系可能存在人種差異。國內(nèi)目前鮮有相關(guān)研究。本研究選取高血壓最重要的發(fā)病機(jī)制之一的腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)中2 個重要的高血壓候選基因：AGT 基因兩個SNP 位點rs699 與rs5051、血管緊張素Ⅱ1 型受體（angiotensin Ⅱtype 1 receptor，AGTR1）基因1 個SNP 位點rs5186 及國外研究較多的質(zhì)膜Ca2+-ATP 酶1（plasma membrane calcium ATPase isoform 1，ATP2B1）基因1 個SNP 位點rs12817819 為研究目標(biāo)，旨在發(fā)現(xiàn)難治性高血壓患者的基因多態(tài)性，以及基因多態(tài)性與環(huán)境危險因素交互作用對難治性高血壓形成的影響，現(xiàn)報道如下。

1 對象和方法

1.1 對象 選擇2016 年10 月至2018 年12 月在本院就診的難治性高血壓患者（RH 組）59 例，其中男39 例，女20 例，年齡32～84（57.26±13.29）歲；非難治性高血壓患者（非RH 組）77 例，其中男41例，女36 例，年齡36～86（58.36±12.70）歲。RH 組納入標(biāo)準(zhǔn)：服用包括利尿劑在內(nèi)的3 種降壓藥物，收縮壓仍持續(xù)＞140mmHg，和（或）舒張壓＞90mmHg，或需要4 種及以上降壓藥物才能控制血壓的患者[8-9]。排除標(biāo)準(zhǔn)：繼發(fā)性高血壓患者，高血壓合并急性腦血管意外患者，高血壓合并妊娠患者，高血壓合并惡性腫瘤患者。

1.2 方法

1.2.1 一般資料采集 兩組患者均留取清晨空腹肘靜脈血樣，30min 內(nèi)分離血漿并于-20℃保存。測量身高、體重、腰圍和血壓等，計算體重指數(shù)（BMI），采集吸煙、飲酒史。所有生化指標(biāo)由本院檢驗科同批次專人檢測，包括空腹血糖、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）、總膽固醇（TC）、甘油三酯（TG）、尿酸、血肌酐、同型半胱氨酸（Hcy）等。

1.2.2 基因多態(tài)性位點的檢測及分析 抽取空腹EDTA 抗凝的靜脈血300μl，應(yīng)用血液基因組DNA抽提試劑盒（美國Axygen 公司生產(chǎn)）提取基因組DNA，嚴(yán)格按試劑盒說明書操作。采用直接測序法對所有研究對象的目標(biāo)SNP 位點進(jìn)行基因型檢測。將需要檢測的SNP 位點作為靶序列，根據(jù)SNP 位點兩側(cè)的保守序列設(shè)計引物，引物設(shè)計合成以后（由上海派森諾生物科技股份有限公司合成），確認(rèn)DNA 模板質(zhì)量合格的情況下，使用BI-2720 PCR 擴(kuò)增儀進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增條件按試劑盒說明書設(shè)定，PCR 產(chǎn)物純化后應(yīng)用美國ABI 3730XL DNA 自動測序儀進(jìn)行基因分型（由上海派森諾生物科技股份有限公司協(xié)助完成）。比較兩組患者基因多態(tài)性位點，與并Hap Map 數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比較。1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 19.0 統(tǒng)計軟件，符合正態(tài)分布的計量資料以表示，比較采用t檢驗，偏態(tài)分布的以M（1Q1，Q3）表示，比較采用非參數(shù)檢驗。計數(shù)資料以百分率表示，比較采用χ2檢驗。兩組的基因頻率分布是否符合哈迪-溫伯格（Hardy-Weinberg，H-W）遺傳平衡定律采用χ2檢驗進(jìn)行分析。采用logistic 回歸模型分析難治性高血壓的獨立相關(guān)因素及基因多態(tài)性與其他相關(guān)因素交互作用對難治性高血壓的影響。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組患者一般資料比較 見表1。

由表1 可見，兩組腰圍、BMI、空腹血糖、尿酸比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05 或0.01）；其余指標(biāo)比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05）。

表1 兩組患者一般資料比較

2.2 兩組患者AGT、AGTR1、ATP2B1 基因代表性SNP 位點最小等位基因頻率的比較 見表2。

由表2 可見，兩組AGT、AGTR1、ATP2B1 基因代表性SNP 位點最小等位基因頻率與國際人類基因組單體型圖（HapMap）中國人群分布的特點相符合。兩組AGT、AGTR1、ATP2B1 基因代表性SNP 位點基因型頻率分布符合H-W 遺傳平衡定律（P＞0.05），樣本具有群體代表性。

2.3 兩組患者各SNP 位點基因型分布的差異比較見表3。

表2 兩組患者AGT、AGTR1、ATP2B1 基因代表性SNP 位點最小等位基因頻率的比較

表3 兩組患者各SNP 位點基因型分布的差異比較[n（%）]

由表3 可見，兩組AGT 基因位點rs699、rs5051基因型頻率比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05），AGTR1、ATP2B1 基因SNP 位點差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05）。

2.4 基因多態(tài)性及環(huán)境因素與難治性高血壓的關(guān)系分析 見表4。

表4 基因多態(tài)性及環(huán)境因素與難治性高血壓的關(guān)系分析

由表4 可見，經(jīng)logistic 回歸校正性別、年齡、腰圍、空腹血糖、血脂、血肌酐、血Hcy 水平后顯示，尿酸、BMI、rs699（CC）基因型、rs5051 基因型（TT）基因型是難治性高血壓均的獨立危險因素（P＜0.05 或0.01）。

2.5 rs699、rs5051 位點基因多態(tài)性與環(huán)境因素交互作用對難治性高血壓的影響 logistic 回歸分析顯示rs699、rs5051 單核苷酸多態(tài)性與空腹血糖交互作用對難治性高血壓的影響有統(tǒng)計學(xué)意義（OR=1.143，95%CI：1.014～1.288，P＜0.05），但校正性別性別、年齡、吸煙、腰圍、BMI、血脂、血肌酐、血Hcy 水平、尿酸等因素后，上述影響不再有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05）。

3 討論

隨著人口老齡化以及肥胖、睡眠呼吸暫停低通氣綜合征的增多，難治性高血壓人群日益龐大，已成為影響國民健康的棘手問題。美國的高血壓患者中，難治性高血壓比例占15%～18%[10-11]，而我國高血壓患者將近2.7 億[12]，血壓達(dá)標(biāo)率卻不足10%。

難治性高血壓的發(fā)病機(jī)制目前尚未完全明確，既往研究提示與多種因素相關(guān)，如交感神經(jīng)過度激活、腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)激活、炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激和內(nèi)皮細(xì)胞功能紊亂等相關(guān)[13-14]。到目前為止，關(guān)于遺傳方面的研究有限，Givens 等[15]研究發(fā)現(xiàn)一種特殊的細(xì)胞色素P450 CYP3A4 基因，該基因與美國非裔難治性高血壓的發(fā)生有關(guān)。另外一項關(guān)于歐洲裔美國人及西班牙人的研究發(fā)現(xiàn)，ATP2B1基因位點rs12817819 的A 等位基因與難治性高血壓顯著相關(guān)[16]。本研究未發(fā)現(xiàn)位點rs12817819 與難治性高血壓存在相關(guān)性。提示該基因多態(tài)性與難治性高血壓的關(guān)聯(lián)性存在人種或種族間的差異。這與前文Lynch 的研究結(jié)果相似。本研究結(jié)果顯示，AGT基因位點rs699、rs5051 基因型頻率在RH 組和非RH 組間的比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。經(jīng)logistic 回歸校正性別、年齡、BMI、空腹血糖、血肌酐等因素后顯示，rs699（CC）基因型、rs5051（TT）基因型是難治性高血壓的獨立危險因素。

難治性高血壓的發(fā)生是遺傳基因與環(huán)境因素相互作用的結(jié)果，具有病因的多元性和復(fù)雜性，很可能受到多個基因位點及環(huán)境危險因素的共同影響[17]。本研究顯示，RH 組腰圍、BMI、空腹血糖、尿酸與非RH組的差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。logistic 回歸分析顯示尿酸、BMI 是難治性高血壓的獨立危險因素。此外本研究采用交互作用模型理論，探討AGT 基因位點rs699、rs5051 分別與腰圍、BMI、空腹血糖、尿酸交互作用對難治性高血壓的影響。logistic 回歸分析結(jié)果顯示，AGT 基因位點rs699 及rs5051 與空腹血糖交互作用對難治性高血壓產(chǎn)生的影響有統(tǒng)計學(xué)意義，但校正性別、年齡、腰圍、BMI 等因素后，上述影響不再有統(tǒng)計學(xué)意義。

綜上所述，AGT 基因位點rs699（CC）基因型、rs5051（TT）基因型是難治性高血壓發(fā)病的一個重要因素，另外尿酸、BMI 亦是難治性高血壓的危險因素，但未發(fā)現(xiàn)基因多態(tài)性與環(huán)境因素的交互作用對難治性高血壓形成產(chǎn)生影響。本研究為難治性高血壓遺傳學(xué)研究提供了相關(guān)信息，但由于樣本量較小，會產(chǎn)生一定的局限性，未來有待于更大樣本量更多基因位點的研究來揭示難治性高血壓遺傳學(xué)方面的病因。