徐本玲，陳廣玉，袁 龍，杜雪相，高全立

1)鄭州大學附屬腫瘤醫(yī)院免疫治療科 鄭州 450008 2)惡性腫瘤免疫細胞治療河南省工程實驗室 鄭州 450008 3)鄭州大學附屬腫瘤醫(yī)院普外科 鄭州 450008

近年來，腫瘤免疫治療特別是以抗PD-1抗體為代表的免疫檢查點抑制劑已成為腫瘤研究的熱點?？筆D-1抗體因其特異性強、副作用小、作用時間長等優(yōu)點，現(xiàn)已被臨床應用于淋巴瘤、非小細胞肺癌和結直腸癌等多種實體腫瘤的治療[1-5]。但抗PD-1抗體在不同癌種或同一癌種不同患者之間的有效率存在較大差異，甚至有些患者治療后出現(xiàn)腫瘤假性進展[6]。抗PD-1抗體對腫瘤微環(huán)境中免疫細胞的影響是否與其抗腫瘤療效有關尚未見相關報道。因此，本研究通過評估抗PD-1抗體對小鼠結直腸癌移植瘤的抑制作用，探討腫瘤微環(huán)境中免疫細胞在抗PD-1抗體抗腫瘤中的可能作用。

1 材料與方法

1.1實驗動物與腫瘤細胞系16只8周齡SPF級雌性BALB/c小鼠購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，許可證號SCXK：(京)2016-0006。實驗期間可自由進食、飲水，實驗過程中對動物的處置符合動物倫理學標準。 小鼠結直腸癌CT26細胞系、小鼠抗PD-1抗體(G4)由中科院生物物理研究所感染與免疫重點實驗室提供。動物實驗經(jīng)鄭州大學附屬腫瘤醫(yī)院實驗動物管理與倫理委員會審核通過。

1.2細胞培養(yǎng)CT26細胞用含體積分數(shù)10%胎牛血清(美國Genial公司)的RPMI 1640培養(yǎng)液(美國Sigma公司)在37 ℃、體積分數(shù)5%CO2孵箱中培養(yǎng)。每2 d傳代1次。

1.3小鼠結直腸癌模型的建立及分組取對數(shù)生長期CT26細胞，胰蛋白酶(美國Sigma公司)消化后制成單細胞懸液，2×106個/只(125 μL)，小鼠右前肢腋下皮下注射荷瘤。隨機分為抗PD-1抗體治療組(PD-1組)和PBS組。PD-1組(8只)，小鼠在荷瘤后第6、9天[7-8]分別給予抗PD-1抗體(G4)0.2 mg腹腔注射，PBS組(8只)小鼠給予等量的PBS腹腔注射。荷瘤后第7天開始采用游標卡尺每隔1 d對腫瘤進行測量、記錄，計算腫瘤體積(體積=長×寬×寬/2)。末次給藥后2周根據(jù)治療效果和腫瘤體積大小將PD-1組小鼠分為有效組(n=3)和無效組(n=5)。

1.4流式抗體及檢測荷瘤后25 d，頸椎脫臼法處死小鼠，無菌條件下取小鼠脾臟和移植瘤組織，充分剪碎研磨，100 μm尼龍細胞篩過濾，制成單細胞懸液(1×106個/管)，300×g離心5 min，洗滌棄上清后重懸至終體積100 μL，按抗體說明書要求進行染色。染色完成后1 h內(nèi)上機檢測。所用流式抗體FITC-CD4(GK1.5)、FITC-Ly-6G/Ly-6C(Gr-1)、PE-CD3e(500A2)、PE-CD11b(M1/70)、PercpCy5.5-CD25(PC61.5)、PercpCy5.5-CD62L(MEL-14)、PECy7-CD8a(53-6.7)、APC-CD45(30-F11)、APC-CD44(15-2C11)、APC-FOXP3(FJK-16s)、APC-PD-L1(MIH5)、APC-IgG2a(eBR2a)和7-AAD等購自eBioscience或Biolegend公司。核內(nèi)染色所用破膜液為True-Nuclear Transcription Factor Buffer Set，購自Biolegend公司。

1.5統(tǒng)計學處理采用SPSS 17.0對實驗數(shù)據(jù)進行分析。應用單因素方差分析和LSD-t檢驗比較抗PD-1抗體治療后腫瘤體積的變化；應用t檢驗比較抗PD-1抗體治療有效組和無效組小鼠脾臟、腫瘤組織中T細胞(CD3、CD4、CD8)、髓源性抑制細胞(MDSC)、調(diào)節(jié)T細胞(Tregs)等細胞比例的差異，應用Pearson相關分析法分析腫瘤組織中PD-L1的表達與浸潤的T細胞的相關性。檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1抗PD-1抗體在小鼠結直腸癌模型中的抑瘤效果治療有效組小鼠移植瘤生長緩慢，無效組移植瘤生長較快?？筆D-1抗體治療2周后，有效組小鼠的腫瘤體積[( 119.82±20.27)mm3)]小于無效組[(3 580.25±781.08)mm3]和PBS組[(4 250.55±828.87)mm3)]，差異有統(tǒng)計學意義(F=34.020，P<0.001)。無效組小鼠腫瘤體積雖略小于PBS組，但兩者差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

2.2抗PD-1抗體治療有效組和無效組小鼠脾臟中各淋巴細胞亞群比例的比較結果見表1?？筆D-1抗體治療有效組小鼠脾臟中CD3+、CD4+和CD8+T細胞占總細胞的比例高于無效組(P<0.05)?？筆D-1抗體治療有效組小鼠脾臟中MDSC的比例低于無效組(P<0.05)。

2.3抗PD-1抗體治療有效組和無效組小鼠腫瘤組織中各淋巴細胞亞群比例的比較結果見表2?？筆D-1抗體治療有效組小鼠腫瘤組織中CD3+、CD4+和CD8+T細胞占總細胞比例均高于無效組(P<0.05)。抗PD-1抗體治療有效組小鼠腫瘤組織中MDSC細胞的比例低于無效組(P<0.05)。

表1 抗PD-1抗體治療無效組和有效組小鼠脾臟中各淋巴細胞亞群比例的比較 %

表2 抗PD-1抗體治療無效組和有效組小鼠腫瘤組織中各淋巴細胞亞群比例的比較 %

2.4抗PD-1抗體治療有效組和無效組小鼠腫瘤組織中PD-L1的表達及其與T細胞的相關性抗PD-1抗體治療有效組小鼠腫瘤組織中PD-L1的表達高于無效組[(30.55±3.83)%vs(11.91±3.01)%；t=3.826，P=0.009)?？筆D-1抗體治療后腫瘤組織中PD-L1的表達與腫瘤組織中浸潤的CD3+T細胞的比例(r=0.901，P=0.002)、CD4+T細胞的比例(r=0.849，P=0.008)、CD8+T細胞的比例(r=0.862，P=0.006)均呈正相關。

3 討論

雖然免疫檢查點抑制劑特別是抗PD-1/PD-L1抗體在臨床應用中顯示出不凡的抗腫瘤效果，但其在腫瘤治療中依然存在諸多問題。當腫瘤抗原減弱時，腫瘤易對免疫治療產(chǎn)生獲得性免疫耐受而導致治療失敗[3]。最近一項名為KEYNOTE-012(Clinical Trials.gov登記號NCT01848834)的臨床試驗系列[3-5]報道了抗PD-1抗體在乳腺癌、頭頸癌和胃癌中的臨床效果，結果顯示抗PD-1抗體在乳腺癌中總體有效率為18.5%，在頭頸癌中為19%，在胃癌中為22%；表明在許多實體瘤中仍有超過70%的患者抗PD-1抗體治療無效。因此，如何精確預測抗PD-1抗體治療效果，提高有效率，使更多腫瘤患者在治療中受益成為該領域亟待解決的一大難題。

越來越多的研究[9-10]表明免疫檢查點抑制劑治療腫瘤的療效除與腫瘤細胞免疫抑制信號的解除有關外, 還與腫瘤微環(huán)境中免疫刺激信號強弱，免疫效應細胞浸潤數(shù)量的多少、功能的發(fā)揮及其他免疫抑制性細胞和抑制性信號途徑的激活等有關。Limagne等[11-12]研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)移性結直腸癌的預后和療效與患者外周血中MDSC有關,MDSC浸潤是影響免疫檢查點抑制劑療效的因素之一。本研究結果表明，抗 PD-1抗體治療有效小鼠腫瘤出現(xiàn)生長停滯或消退時伴隨有脾臟和腫瘤組織微環(huán)境中MDSC的下降，治療無效小鼠脾臟和腫瘤組織內(nèi)依然維持著較高比例的MDSC，提示抗 PD-1抗體的療效與腫瘤組織中MDSC的浸潤有關。有效組MDSC比例的下降可能與抗PD-1抗體的使用解除了T細胞上的免疫抑制信號，恢復了T細胞的功能，腫瘤微環(huán)境中免疫抑制信號減弱，免疫抑制因子的分泌減少有關，也可能與有效組小鼠自身免疫及精神狀態(tài)有關。

以往的臨床研究[13-14]表明，在非小細胞肺癌組織中高表達PD-L1的患者相比于不表達的患者擁有更長的無進展生存期和總生存期；組織中PD-L1 的表達可用于評估晚期食管鱗癌患者的預后。作者在小鼠CT26結直腸癌模型中發(fā)現(xiàn)抗 PD-1抗體的治療效果不僅與腫瘤組織的PD-L1表達高度相關，還與腫瘤中淋巴細胞的浸潤多少有關。而腫瘤組織PD-L1的高表達也與腫瘤微環(huán)境中腫瘤浸潤淋巴細胞(TIL)的增多有關，特別是CD8+T細胞增多。另外，Tregs作為一群免疫調(diào)節(jié)性細胞，在免疫抑制性腫瘤微環(huán)境中也扮演著非常重要的角色，它能夠分泌抑制性細胞因子，削弱TIL的抗腫瘤作用。本研究結果顯示，在CT26結直腸癌模型中抗PD-1抗體的療效與脾臟和腫瘤組織中Tregs細胞的比例無關，提示Tregs細胞可能不是影響抗PD-1抗體療效敏感的因素。

近期發(fā)表在《Nature Medicine》上的一項研究結果表明：小鼠社交失敗導致的焦慮樣行為會影響抗腫瘤效果，壓力通過上調(diào)血漿中糖皮質(zhì)激素誘導因子Tsc22d3表達，阻斷樹突狀細胞對Ⅰ型干擾素的反應，阻止IFN-γ+T細胞激活[15]，進而影響抗腫瘤效果。本研究結果也顯示，遺傳背景相似甚至相同的小鼠在接種同一種腫瘤細胞構建成模型后，給予相同的治療藥物，療效存在差異，其原因是否與環(huán)境壓力、每籠中的老鼠在長期養(yǎng)育的過程中出現(xiàn)的等級差別、焦慮情緒等有關，有待進一步研究。

本研究結果顯示，抗PD-1抗體治療有效組小鼠脾臟和腫瘤組織中CD3+、CD4+和CD8+T細胞的比例均高于無效組，MDSC細胞的比例均低于無效組；抗PD-1抗體治療后腫瘤組織中PD-L1的表達與腫瘤組織中浸潤的CD3+、CD4+和CD8+T細胞的比例均呈正相關。實驗結果表明腫瘤組織中T細胞浸潤數(shù)量多少、MDSC細胞的比例及PD-L1的表達高低可能是預測抗PD-1抗體療效的良好指標。如果在進行抗 PD-1抗體治療時能夠聯(lián)合其他治療手段降低腫瘤微環(huán)境中的MDSC等抑制性細胞的比例，誘導腫瘤組織PD-L1的高表達，增加腫瘤微環(huán)境中CD8+CTL細胞浸潤的數(shù)量和比例，將可能大大提高抗 PD-1抗體的抑瘤作用，使更多原本無效的腫瘤患者在治療中受益。

總之，本研究結果表明，抗PD-1抗體治療效果與腫瘤微環(huán)境之間存在著密切聯(lián)系，這為下一步積極探索“新輔助免疫治療”和“免疫治療+”的聯(lián)合治療方案奠定了基礎。