馮姍姍，鄭 洪，王 凱

遵義醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院病理科 貴州遵義 563000

卵巢癌是女性生殖道常見腫瘤之一，惡性程度高，極易發(fā)生浸潤和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，5 a生存率低，且近些年的發(fā)病率和死亡率呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，嚴(yán)重威脅女性的生命健康[1]。腫瘤形成與原癌基因異常表達(dá)或擴(kuò)增、抑癌基因丟失等有關(guān)。賴氨酰氧化酶樣蛋白2(lysine oxidase-like protein 2，LOXL2)是LOX家族成員之一，定位于8p21.2-p21.3，目前多項(xiàng)研究[2-3]顯示，LOXL2在胰腺癌、肝癌等多種腫瘤中表達(dá)明顯升高，可影響腫瘤細(xì)胞的增殖、凋亡、侵襲、遷移等生物學(xué)過程。有研究[4]表明，抑制LOXL2可降低卵巢癌細(xì)胞侵襲和遷移能力，但LOXL2對(duì)卵巢癌細(xì)胞凋亡的影響尚未明確。Wnt/β-catenin信號(hào)通路為經(jīng)典Wnt信號(hào)通路，其異?；罨驯蛔C實(shí)參與多種人類惡性腫瘤進(jìn)程，抑制卵巢癌細(xì)胞中Wnt/β-catenin信號(hào)通路可抑制癌細(xì)胞生長[5]。因此，本研究旨在探討沉默卵巢癌細(xì)胞LOXL2基因表達(dá)對(duì)癌細(xì)胞生長及Wnt/β-catenin信號(hào)通路的影響。

1 材料與方法

1.1主要試劑和儀器RPMI 1640培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)、胰蛋白酶均購自美國Hyclone公司；CCK-8試劑盒購自上海東仁化學(xué)科技有限公司；細(xì)胞凋亡試劑盒及流式細(xì)胞儀均購自美國BD公司；BCA蛋白濃度檢測(cè)試劑盒購自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司；ECL顯色液購自美國Thermo Fisher Scientific公司；LOXL2、β-catenin、Cyclin D1、Bax和GAPDH抗體均購自美國Abcam公司；酶標(biāo)儀購自美國BioTek公司。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)、分組及轉(zhuǎn)染正常卵巢上皮細(xì)胞IOSE80及人卵巢癌細(xì)胞SKOV3、A2780、8910和OVCAR3均購自美國ATCC公司。所有細(xì)胞用含體積分?jǐn)?shù)10% FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基在體積分?jǐn)?shù)5% CO2、37 ℃恒溫濕化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每1～2 d換液1次，倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)和融合度，當(dāng)細(xì)胞達(dá)90%融合度時(shí)傳代培養(yǎng)。采用Western blot法檢測(cè)不同卵巢細(xì)胞系中LOXL2蛋白表達(dá)水平，選擇LOXL2蛋白表達(dá)量最高的SKOV3細(xì)胞用于后續(xù)試驗(yàn)。

將SKOV3細(xì)胞分為空白對(duì)照組(未作任何處理的SKOV3細(xì)胞)、NC組(轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照siRNA)及干擾組(轉(zhuǎn)染LOXL2特異性siRNA)。依據(jù)siRNA設(shè)計(jì)原則設(shè)計(jì)siRNA序列(LOXL2序列：5’-CAGU CUAUUAUAGUCACAU-3’；陰性對(duì)照序列：5’-UU CUCCGAACGUGUCACGU-3’)，由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司合成。將處于對(duì)數(shù)生長期的SKOV3細(xì)胞用含血清培養(yǎng)基制備成單細(xì)胞懸液，接種于6孔板，每孔2 mL細(xì)胞懸液(約1×105個(gè)細(xì)胞)，待細(xì)胞達(dá)90%以上融合度時(shí)，按照Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑盒(美國Invitrogen公司)推薦比例制備siRNA與脂質(zhì)體共轉(zhuǎn)染體系，混勻后室溫靜置20 min，加入6孔板中，6 h后，換為含血清的完全培養(yǎng)基。每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，轉(zhuǎn)染48 h后觀察細(xì)胞生長狀態(tài)，Western blot法檢測(cè)3組細(xì)胞中LOXL2蛋白表達(dá)水平，判定轉(zhuǎn)染效率。

1.3各組SKOV3細(xì)胞活力的CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)及分組同1.2。各組SKOV3細(xì)胞用無血清培養(yǎng)基處理48 h后，以胰蛋白酶消化，行細(xì)胞計(jì)數(shù)，并調(diào)整細(xì)胞密度為2.0×104個(gè)/mL，以每孔100 μL細(xì)胞懸液(約2 000個(gè)細(xì)胞)接種于96孔板，4～6 h后細(xì)胞貼壁，計(jì)時(shí)為0 h，此時(shí)在每孔中加入CCK-8溶液10 μL，37 ℃避光孵育1.5 h，酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀測(cè)定450 nm波長各孔的吸光度值(A)。吸取細(xì)胞中反應(yīng)液，加新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h、48 h和72 h時(shí)，重復(fù)上述方法，測(cè)定A值。每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，并設(shè)置空白孔，取均值繪制生長曲線。

1.4各組SKOV3細(xì)胞凋亡的雙染法檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)及分組同1.2。各組SKOV3細(xì)胞用無血清培養(yǎng)基處理48 h。收集細(xì)胞懸液，離心，棄掉上清液，用冷的PBS重懸細(xì)胞，離心，再用結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞，分別加5 μL的 Annexin V-FITC和PI，避光染色15 min，1 h內(nèi)上流式細(xì)胞儀檢測(cè)。每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。

1.5各組SKOV3細(xì)胞中LOXL2、β-catenin、Cyclin D1及Bax蛋白表達(dá)的Western blot法檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)及分組同1.2。收集3組細(xì)胞，加入適量預(yù)冷細(xì)胞裂解液，于冰上放置30 min，離心，吸取上清。采用BCA試劑盒測(cè)定蛋白濃度。制備50 g/L濃縮膠和120 g/L的分離膠，蛋白樣品與5×上樣緩沖液按照1∶3比例混勻，100 ℃煮沸變性5 min，冷卻后按照30 μg/孔上樣，經(jīng)SDS-PAGE、轉(zhuǎn)膜、封閉后，將膜放于塑封膜密封，加一抗(β-catenin、Cyclin D1、Bax和GAPDH抗體，均按1∶1 000稀釋)，4 ℃搖床平緩搖動(dòng)過夜，TBST洗膜，加稀釋的HRP標(biāo)記的二抗(按1∶2 000稀釋)，室溫孵育1～2 h。加ECL發(fā)光液，暗盒中用X光膠片曝光，拍照。采用Image J圖像分析軟件進(jìn)行條帶灰度值分析。蛋白相對(duì)表達(dá)量=目的蛋白條帶灰度值/內(nèi)參GAPDH條帶灰度值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 21.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，應(yīng)用單因素方差分析和SNK-q檢驗(yàn)比較不同類型卵巢細(xì)胞中LOXL2蛋白、各組SKOV3細(xì)胞的活力及凋亡、Wnt/β-catenin信號(hào)通路蛋白表達(dá)的差異，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1不同類型卵巢細(xì)胞中LOXL2蛋白的表達(dá)見圖1。Western blot法檢測(cè)結(jié)果顯示，卵巢癌SKOV3(0.352±0.036)、A2780(0.096±0.010)、8910(0.153±0.018)和OVCAR3(0.267±0.031)細(xì)胞中LOXL2蛋白表達(dá)均高于正常卵巢上皮細(xì)胞IOSE80(0.045±0.006)(F=87.131，P<0.001)；SKOV3細(xì)胞中LOXL2蛋白表達(dá)量最高。

圖1 不同類型卵巢細(xì)胞中LOXL2蛋白的表達(dá)

2.2SKOV3細(xì)胞中LOXL2siRNA轉(zhuǎn)染效率的檢測(cè)結(jié)果見圖2。干擾組LOXL2蛋白表達(dá)(0.036±0.006)低于空白對(duì)照組(0.402±0.038)和NC組(0.415±0.042)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=128.437，P<0.001)。

圖2 各組SKOV3細(xì)胞中LOXL2蛋白的表達(dá)

2.3各組SKOV3細(xì)胞活力及細(xì)胞凋亡率的比較各組SKOV3細(xì)胞的生長曲線見圖3。由圖3可知，3組細(xì)胞在接種后24、48和72 h，干擾組細(xì)胞增殖活力降低，與空白對(duì)照組和NC組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05 )。干擾組細(xì)胞凋亡率[ (23.84±2.39)% ]高于空白對(duì)照組[ (3.14±0.22) %]和NC組[ (3.06±0.21)% ](F=222.316，P<0.001)。

圖3 各組SKOV3細(xì)胞的生長曲線

2.4各組SKOV3細(xì)胞中Wnt/β-catenin信號(hào)通路蛋白的表達(dá)見圖4和表1。與空白對(duì)照組和NC組相比，干擾組 β-catenin和Cyclin D1表達(dá)降低，Bax表達(dá)升高(P<0.05)。

圖4 各組SKOV3細(xì)胞中Wnt/β-catenin信號(hào)通路蛋白的表達(dá)

表1 各組SKOV3細(xì)胞中Wnt/β-catenin信號(hào)通路蛋白表達(dá)的比較

3 討論

對(duì)于卵巢癌的治療，除了常規(guī)的放化療治療、激素治療、手術(shù)等，基因靶向治療，特別是RNA干擾技術(shù)成為近些年來的研究熱點(diǎn)，且取得了一定的效果[6]。RNA干擾是近些年發(fā)展起來的一項(xiàng)沉默基因表達(dá)的新技術(shù)，具有可同時(shí)抑制多個(gè)基因、抑制效果好、特異性強(qiáng)等優(yōu)勢(shì)，在腫瘤基因治療領(lǐng)域有廣闊應(yīng)用前景[7-8]。

LOXL2是LOX家族成員之一。有研究[9]發(fā)現(xiàn)，LOXL2在胎盤組織、子宮、前列腺中高表達(dá)，而在心、腎、肺等其他組織呈現(xiàn)低表達(dá)。有關(guān)LOXL2的研究[10]表明，LOXL2基因是腫瘤抑制的候選基因。然而，越來越多的研究[11-12]顯示，LOXL2在多種腫瘤中呈現(xiàn)高表達(dá)，可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲遷移、血管生成及抑制凋亡，因此，更應(yīng)該作為腫瘤促進(jìn)因子。近些年的多項(xiàng)研究[4，13]也表明，抑制LOXL2的表達(dá)可降低腫瘤細(xì)胞生長：如抑制LOXL2的表達(dá)可降低卵巢癌細(xì)胞的侵襲和遷移能力；LOXL2 siRNA可通過下調(diào)MMP-2和MMP-9的表達(dá)來抑制胃癌細(xì)胞的侵襲能力。本研究首先檢測(cè)了不同卵巢癌細(xì)胞及正常卵巢上皮細(xì)胞中LOXL2蛋白的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)卵巢癌中LOXL2蛋白的表達(dá)均高于正常卵巢上皮細(xì)胞，且SKOV3細(xì)胞中LOXL2蛋白表達(dá)最高；將設(shè)計(jì)合成的LOXL2 siRNA轉(zhuǎn)染SKOV3細(xì)胞后，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞增殖能力降低、凋亡率升高，提示LOXL2可能是卵巢癌治療潛在的分子靶點(diǎn)之一。

Wnt/β-catenin信號(hào)通路是調(diào)控細(xì)胞增殖、分化的關(guān)鍵信號(hào)途徑，在腫瘤發(fā)生發(fā)展、轉(zhuǎn)移及胚胎發(fā)育等過程中有關(guān)鍵作用，研究[14-15]表明，Wnt/β-catenin信號(hào)通路在卵巢上皮性癌和前列腺癌中呈現(xiàn)高表達(dá)，因此尋找抑制該信號(hào)途徑的有效方法已成為研究熱點(diǎn)。Wnt信號(hào)通路被激活可抑制β-catenin-AXIN-APC-GSK3復(fù)合物形成，從而抑制β-catenin磷酸化，未發(fā)生磷酸化的β-catenin轉(zhuǎn)位入核，促進(jìn)LEF/TCF激活Cyclin D1、Survivin、Bax等下游靶基因表達(dá)，從而在腫瘤形成及發(fā)展中發(fā)揮作用[16-17]。多項(xiàng)研究[18-19]顯示：抑制Wnt/β-catenin信號(hào)通路可抑制卵巢癌細(xì)胞生長或促進(jìn)其凋亡，如丹皮酚可抑制人卵巢癌細(xì)胞增殖并促進(jìn)其凋亡，其機(jī)制可能與抑制Wnt/β-catenin信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路有關(guān)；miR-218可通過抑制Wnt/β-catenin信號(hào)通路促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞凋亡。本研究結(jié)果顯示，沉默LOXL2表達(dá)可下調(diào)卵巢癌細(xì)胞β-catenin和Cyclin D1表達(dá)，上調(diào)促凋亡基因Bax表達(dá)。提示LOXL2可能通過抑制Wnt/β-catenin信號(hào)通路影響卵巢癌細(xì)胞生長。

綜上所述，沉默LOXL2表達(dá)可抑制卵巢癌細(xì)胞活力，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，其機(jī)制可能與抑制Wnt/β-catenin信號(hào)通路有關(guān)，提示在卵巢癌診療中LOXL2可能是有效靶點(diǎn)之一，但目前本研究及以往的相關(guān)研究有限，還需更多理論及臨床試驗(yàn)支持。