王 騰，孫華磊，葛惠娜，劉欣欣，李 星，李文杰

鄭州大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院營養(yǎng)與食品衛(wèi)生學(xué)教研室 鄭州 450001

肥胖是一種復(fù)雜的多因素疾病，它是由脂肪過度堆積所引起，而隨著經(jīng)濟(jì)發(fā)展和生活方式的改變，全球肥胖和超重人口已經(jīng)從1980年的8.6億上漲至2013年的21億[1]，國內(nèi)情況也不容樂觀[2]。目前所使用的治療肥胖的藥物，都存在一定的不良反應(yīng)[3]。紫檀芪(pterostilbene，PTE)是一種天然多酚化合物，主要存在于藍(lán)莓、葡萄等漿果中，具有抗炎、抗氧化、抑制腫瘤細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移等多種功能，有研究[4]證實(shí)PTE能夠抑制前脂肪細(xì)胞增殖和脂質(zhì)的堆積，從而減少脂肪組織，但PTE干預(yù)是否能夠影響前脂肪細(xì)胞分化尚未明確。因此，本研究通過建立3T3-L1前脂肪細(xì)胞分化模型，在細(xì)胞分化過程中進(jìn)行PTE干預(yù)，探討PTE對前脂肪細(xì)胞分化的影響以及可能的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1試劑和儀器PTE(純度98%，上海士鋒生物科技有限公司)，DMEM培養(yǎng)液(美國HyClone公司)，胎牛血清(美國Gibco公司)，羧甲基纖維素鈉、青霉素、鏈霉素、胰蛋白酶、3-異丁基-1-甲基-黃嘌呤(IBMX)、地塞米松、胰島素、油紅O(北京索萊寶生物科技有限公司)，全細(xì)胞蛋白提取裂解液、BCA蛋白濃度測定試劑盒(武漢賽維爾生物科技有限公司)，SDS-PAGE凝膠配制試劑盒(北京鼎國昌盛生物科技有限公司)，葡萄糖檢測試劑盒、游離脂肪酸測定試劑盒(南京建成生物工程研究所)，β-actin、過氧化物酶體增殖物激活受體(PPAR)γ、CCAAT增強(qiáng)子結(jié)合蛋白(C/EBP)α多克隆抗體(武漢三鷹生物技術(shù)有限公司)，恒溫CO2培養(yǎng)箱(日本SANYO公司)，超凈工作臺(tái)(山東博科生物產(chǎn)業(yè)有限公司)，酶標(biāo)儀(美國BioTek公司)，蛋白凝膠成像儀(美國通用電氣儀器公司)。

1.2培養(yǎng)基配制基礎(chǔ)培養(yǎng)基：量取DMEM培養(yǎng)液90 mL、胎牛血清10 mL于容量瓶中，加入1 mL青鏈霉素混合液(含青霉素10 kU/mL、鏈霉素10 g/L)，混勻后用0.22 μm微孔過濾器過濾，4 ℃儲(chǔ)存待用。

誘導(dǎo)培養(yǎng)基A：準(zhǔn)確量取2 mmol/L地塞米松貯存液50 μL、2 g/L胰島素貯存液0.5 mL、50 mmol/L IBMX貯存液1 mL，溶入98.5 mL基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，混勻?，F(xiàn)用現(xiàn)配。

誘導(dǎo)培養(yǎng)基B：準(zhǔn)確量取2 g/L胰島素貯存液0.5 mL，溶入99.5 mL基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，混勻。現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.3細(xì)胞分化及干預(yù)3T3-L1前脂肪細(xì)胞購自中科院上海細(xì)胞庫。①細(xì)胞分化：待細(xì)胞在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中生長至90%～100%融合時(shí)，更換新的培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)。48 h后更換為誘導(dǎo)培養(yǎng)基A，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后更換為誘導(dǎo)培養(yǎng)基B，48 h后更換為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，后每2 d更換1次基礎(chǔ)培養(yǎng)基，10～12 d后3T3-L1前脂肪細(xì)胞即可分化為成熟脂肪細(xì)胞。②干預(yù)：實(shí)驗(yàn)設(shè)置PTE低(15 μmol/L)、中(30 μmol/L)、高(60 μmol/L)劑量組[4-5]和對照組。細(xì)胞分化過程中，在更換誘導(dǎo)培養(yǎng)基A的同時(shí)，干預(yù)組分別加入相應(yīng)濃度的PTE溶液，對照組加入等體積溶劑羧甲基纖維素鈉，48 h后停止干預(yù)，并按照誘導(dǎo)細(xì)胞分化步驟繼續(xù)誘導(dǎo)細(xì)胞分化。

1.4細(xì)胞分化程度和脂質(zhì)堆積測定誘導(dǎo)細(xì)胞分化成熟后，吸棄培養(yǎng)基，加入100 g/L多聚甲醛固定細(xì)胞20 min，加入適量新配制的油紅O染液室溫染色20 min，洗去背景色，顯微鏡下觀察細(xì)胞染色情況。然后使用異丙醇洗去油紅O染液，收集洗脫染液的異丙醇，使用酶標(biāo)儀在510 nm處測量光密度(OD)值，以此間接反映細(xì)胞的分化程度。每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5細(xì)胞糖消耗量測定細(xì)胞誘導(dǎo)分化后，吸棄舊的培養(yǎng)基，用新的基礎(chǔ)培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。24 h后收集各組細(xì)胞的培養(yǎng)基，使用葡萄糖檢測試劑盒采用葡萄糖氧化酶-過氧化物酶法測定其中葡萄糖含量，操作步驟嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。后用無細(xì)胞培養(yǎng)基中葡萄糖含量減去所測的葡萄糖含量，即為細(xì)胞的糖消耗量。每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.6游離脂肪酸生成量測定細(xì)胞誘導(dǎo)分化后，更換新的基礎(chǔ)培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。24 h后收集各組細(xì)胞的培養(yǎng)基，使用游離脂肪酸測定試劑盒測定其中游離脂肪酸含量，測量過程嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.7細(xì)胞中PPARγ、C/EBPα蛋白表達(dá)的Western blot測定誘導(dǎo)細(xì)胞分化成功后，細(xì)胞裂解液處理細(xì)胞3～5 min，提取細(xì)胞蛋白，采用BCA試劑盒測定蛋白濃度，調(diào)整上樣蛋白量，并加入上樣緩沖液。60 V電壓電泳30 min，然后120 V電泳至溴酚藍(lán)指示劑距分離膠底部 1 cm，300 mA恒流2 h轉(zhuǎn)移蛋白印跡至PVDF膜上，50 g/L脫脂奶粉液封閉90 min，加入一抗(PPARγ 抗體1∶3 000、C/EBPα 抗體1∶1 000稀釋)，4 ℃封閉過夜。洗滌后，與二抗室溫?fù)u床孵育2 h，ECL顯色。使用Alpha軟件進(jìn)行灰度值分析，以β-actin(1∶3 000稀釋)為內(nèi)參，目的蛋白與內(nèi)參蛋白條帶灰度值的比值即為目的蛋白的相對表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 21.0對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。不同組間油紅O染色OD值、糖消耗量、游離脂肪酸以及PPARγ、C/EBPα蛋白相對表達(dá)量的比較均采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1PTE對3T3-L1前脂肪細(xì)胞分化的影響結(jié)果見圖1、表1。鏡下可見未分化的3T3-L1前脂肪細(xì)胞呈梭形，分化后的成熟脂肪細(xì)胞則變?yōu)閳A形或者近似圓形，且胞質(zhì)內(nèi)有脂滴聚集，經(jīng)油紅O染色可以觀察到成熟脂肪細(xì)胞內(nèi)的脂滴被染色。

A：前脂肪細(xì)胞(×100)；B：誘導(dǎo)分化12 d后的脂肪細(xì)胞(×200)；C：油紅O染色的脂肪細(xì)胞，箭頭所示為脂滴堆積(×200)

2.2各組細(xì)胞糖脂代謝的比較結(jié)果見表1。與對照組相比，各PTE劑量組細(xì)胞糖消耗量升高；高劑量組細(xì)胞的糖消耗量高于PTE低和中劑量組。與對照組相比，各PTE劑量組細(xì)胞游離脂肪酸生成量均降低，并且PTE高劑量組低于低和中劑量組。

2.3各組細(xì)胞中PPARγ和C/EBPα蛋白表達(dá)的比較結(jié)果見圖2、表2。除PTE低劑量組C/EBPα外，與對照組相比，各PTE劑量組的PPARγ和C/EBPα蛋白表達(dá)水平均下降，并且PTE高劑量組降低最明顯。

1：對照組；2：PTE低劑量組；3：PTE中劑量組；4：PTE高劑量組

表2 各組細(xì)胞中PPARγ、C/EBPα蛋白相對表達(dá)量的比較(n=3)

3 討論

正常脂肪細(xì)胞分化過程為多功能干細(xì)胞→脂肪母細(xì)胞→前脂肪細(xì)胞→成熟脂肪細(xì)胞[6]，前脂肪細(xì)胞儲(chǔ)存在人體各個(gè)脂肪庫中，能夠吸收、聚集脂質(zhì)，從而分化為成熟脂肪細(xì)胞，成熟脂肪細(xì)胞中脂質(zhì)的過度堆積會(huì)導(dǎo)致肥胖。有研究[7]證實(shí)前脂肪細(xì)胞的過度分化與肥胖的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，因此抑制前脂肪細(xì)胞分化可能會(huì)成為肥胖控制和治療的有效手段。本研究通過“經(jīng)典雞尾酒法”誘導(dǎo)3T3-L1前脂肪細(xì)胞向成熟脂肪細(xì)胞分化[8]，并在細(xì)胞分化的過程中進(jìn)行PTE干預(yù)，探討PTE對前脂肪細(xì)胞分化的影響。

前脂肪細(xì)胞分化為成熟脂肪細(xì)胞后，有兩個(gè)主要的特征：一是細(xì)胞形態(tài)的變化，由梭形轉(zhuǎn)變?yōu)閳A形或橢圓形；二是成熟脂肪細(xì)胞開始合成甘油三酯，以脂滴的形式儲(chǔ)存在胞質(zhì)內(nèi)，并且脂滴的數(shù)量和大小能夠間接反映脂肪細(xì)胞的分化程度[9]。本研究通過雞尾酒法誘導(dǎo)細(xì)胞分化后，細(xì)胞形態(tài)變化符合以上描述，表明誘導(dǎo)細(xì)胞分化成功。油紅O染液可對成熟脂肪細(xì)胞中的甘油三酯進(jìn)行特異性染色，OD值檢測結(jié)果提示PTE干預(yù)能夠減少脂肪細(xì)胞分化過程中脂質(zhì)的堆積，從而間接表明PTE干預(yù)能夠抑制前脂肪細(xì)胞分化。

肥胖會(huì)引起機(jī)體糖脂代謝紊亂，而糖、脂毒性往往相互影響，相互促進(jìn)，形成惡性循環(huán)。脂代謝異常會(huì)抑制細(xì)胞中糖原的合成，促進(jìn)糖異生，引起脂肪氧化缺陷，過量游離脂肪酸會(huì)抑制胰島素的分泌，導(dǎo)致糖代謝紊亂；同時(shí)長期的糖脂代謝紊亂會(huì)刺激脂肪細(xì)胞釋放多種炎性因子，妨礙胰島信號(hào)的傳導(dǎo)，進(jìn)而加重了脂肪細(xì)胞對葡萄糖的轉(zhuǎn)運(yùn)和利用障礙[10]。本研究結(jié)果顯示，PTE干預(yù)能提高脂肪細(xì)胞的糖消耗能力，同時(shí)減少游離脂肪酸的生成，提示PTE能夠改善脂肪細(xì)胞的糖脂代謝。

前脂肪細(xì)胞分化需要多種核轉(zhuǎn)錄因子的參與，其中C/EBP家族和PPAR家族是目前公認(rèn)最重要的轉(zhuǎn)錄因子[11]。PPARγ是PPAR家族中最具有脂肪細(xì)胞專一性的成員，主要在脂肪細(xì)胞中表達(dá)，PPARγ在前脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)分化的第2天開始轉(zhuǎn)錄，目前已有研究[12]證實(shí)PPARγ能夠調(diào)控前脂肪細(xì)胞分化，并且PPARγ基因敲除的前脂肪細(xì)胞會(huì)喪失分化能力；C/EBPα在前脂肪細(xì)胞分化過程中與PPARγ具有協(xié)同作用[13]，C/EBPα在誘導(dǎo)分化的第2天開始表達(dá)，但C/EBPα的表達(dá)較PPARγ晚，能使前脂肪細(xì)胞進(jìn)入分化的終末階段，誘導(dǎo)細(xì)胞中脂滴的形成[14-15]。本研究結(jié)果提示，在一定濃度范圍內(nèi)，PTE干預(yù)能夠抑制前脂肪細(xì)胞分化過程中PPARγ和C/EBPα蛋白的表達(dá)，表明PTE能夠抑制前脂肪細(xì)胞的分化。

綜上所述，PTE能夠抑制3T3-L1前脂肪細(xì)胞分化，減少分化過程中的脂質(zhì)堆積，并改善脂肪細(xì)胞的糖脂代謝，其機(jī)制可能與抑制PPARγ和C/EBPα蛋白表達(dá)有關(guān)。該研究結(jié)果為肥胖的控制和預(yù)防提供了新的思路和理論依據(jù)。