孫亞娟，周樂波，項(xiàng) 志，姚 靜，劉 晗，滕軍放

1)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科 鄭州 450052 2)河南省高等學(xué)校臨床醫(yī)學(xué)重點(diǎn)學(xué)科開放實(shí)驗(yàn)室 鄭州 450052

單純自主神經(jīng)功能衰竭(pure autonomic failure，PAF)是一種罕見的散發(fā)性神經(jīng)退行性疾病，成年期起病，疾病進(jìn)展緩慢，缺乏有效治療辦法[1]。該病最初由Bradbury和Eggleston于1925年報(bào)道，病損選擇性累及自主神經(jīng)系統(tǒng)，且在外周自主神經(jīng)系統(tǒng)累及更為嚴(yán)重，其他系統(tǒng)不受影響，臨床主要表現(xiàn)為體位性低血壓、無汗、便秘、性功能障礙等[2]。大量尸檢結(jié)果發(fā)現(xiàn)，PAF患者以神經(jīng)元或膠質(zhì)細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)不溶性α-突觸核蛋白(α-synuclein，α-syn)沉積形成路易小體為特征性病理表現(xiàn)，主要累及藍(lán)斑、黑質(zhì)、交感神經(jīng)節(jié)和副交感神經(jīng)節(jié)以及節(jié)前、節(jié)后自主神經(jīng)元[3-8]。目前PAF的診斷主要依靠臨床癥狀，缺乏簡(jiǎn)便易行的病理活檢部位及有效的生物標(biāo)志物，誤診率高。本研究檢測(cè)了PAF患者皮膚、胃小彎及膀胱組織內(nèi)磷酸化α-syn(phosphorylated α-syn, pα-syn)的表達(dá)，為PAF診斷提供可能的生物標(biāo)志物。

1 對(duì)象與方法

1.1研究對(duì)象收集自2016年6月至2019年3月在鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科就診的PAF患者17例，均符合1996年P(guān)AF診斷共識(shí)[9]，排除帕金森病、多系統(tǒng)萎縮、路易體癡呆，且未合并其他神經(jīng)系統(tǒng)疾病。17例患者中男10例，女7例，年齡53～72(63.4±5.9)歲，病程5～16 a；17例均有直立性低血壓，15例有胃腸功能障礙，12例有泌汗障礙，男性多有性功能障礙或夜尿增多，部分女性有尿失禁或夜尿增多。對(duì)照組12例，為本院外科手術(shù)患者，排除神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病以及其他慢性疾病。對(duì)照組男7例，女5例，年齡49～67(61.8±4.8)歲。對(duì)所有受試者進(jìn)行全面的病史采集，包括年齡、性別、起病時(shí)間、起病癥狀、病情進(jìn)展程度、家族史、生活環(huán)境、吸煙飲酒史、藥物及中毒史、其他慢性疾病史等；由我院兩位神經(jīng)內(nèi)科專業(yè)醫(yī)師進(jìn)行SCOPA-AUT量表評(píng)分[10]。本研究經(jīng)過鄭州大學(xué)及鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，獲得所有受試者和(或)其家屬知情同意并簽署組織活檢知情同意書。

1.2組織取材17例PAF患者和12例對(duì)照均進(jìn)行皮膚活檢；其中PAF組中完成胃小彎活檢6例、膀胱活檢5例，對(duì)照組中完成胃小彎活檢4例、膀胱活檢3例。

1.2.1 皮膚活檢 選取受試者近端和遠(yuǎn)端皮膚部位(有毛發(fā))，使用孔徑3 mm×3 mm的皮膚鉆孔活檢器行皮膚活檢。近端部位包括頸7椎旁區(qū)域，遠(yuǎn)端部位包括大腿(髕骨上方15 cm)和小腿(外踝上方10 cm)。取皮過程嚴(yán)格按照無菌操作要求進(jìn)行，取皮后創(chuàng)口消毒、壓迫止血，用無菌紗布加壓包扎。

1.2.2 胃小彎、膀胱活檢 在全麻及持續(xù)心電監(jiān)護(hù)狀態(tài)下分別使用電子胃鏡、膀胱鏡及活檢鉗留取受試者胃小彎組織標(biāo)本(含黏膜下層)、膀胱組織標(biāo)本(含肌層)，大小約2.5 mm×2.5 mm。術(shù)后注意觀察患者生命體征及一般狀況。

1.3不同組織pα-syn表達(dá)的檢測(cè)組織標(biāo)本置于40 g/L多聚甲醛溶液(pH 7.4)中，4 ℃固定24 h，常規(guī)脫水、透明、浸潤(rùn)，石蠟包埋后，應(yīng)用組織切片機(jī)連續(xù)切片，片厚4 μm。置于80 ℃恒溫干燥箱烘烤，二甲苯脫蠟，梯度乙醇脫水，H2O2去離子水消除內(nèi)源性過氧化物酶活性，然后置于枸櫞酸鈉緩沖液進(jìn)行高溫高壓抗原修復(fù)5 min，PBS洗滌。滴加正常山羊血清封閉液，隨后滴加稀釋的一抗工作液(鼠抗pα-syn抗體，購自Abcam公司，1∶500稀釋)，4 ℃環(huán)境下過夜。室溫下復(fù)溫，PBS洗滌3次。滴加辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗工作液(羊抗鼠IgG，購自博奧森公司，1∶1 500稀釋)，孵育30 min，PBS洗滌3遍。DAB顯色,蘇木精復(fù)染，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，甘油封片。Olympus IX51顯微鏡下觀察組織細(xì)胞免疫顯色情況。拍照，每張切片選取3個(gè)視野，使用Image J v1.51軟件分別統(tǒng)計(jì)皮膚、胃小彎、膀胱壁組織內(nèi)pα-syn免疫陽性染色面積百分比(pα-syn免疫染色陽性為胞質(zhì)和胞核中棕黃色、棕褐色粗糙顆粒狀或團(tuán)塊狀聚集)。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 23.0處理數(shù)據(jù)。應(yīng)用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)或確切概率法比較PAF組和對(duì)照組年齡、SCOPA-AUT總分及性別的差異，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1兩組臨床資料比較結(jié)果見表1。

表1 兩組臨床資料比較

2.2兩組不同樣本組織中pα-syn的表達(dá)12例對(duì)照皮膚、胃小彎及膀胱組織中均未檢出pα-syn免疫反應(yīng)陽性細(xì)胞(圖1A1、A2、A3)；PAF患者皮膚、胃小彎黏膜下層及膀胱壁肌層中可見彌漫分布的pα-syn免疫反應(yīng)陽性細(xì)胞(圖1B1、B2、B3)，免疫陽性染色面積百分比分別為(11.90±0.35)%、(16.27±0.80)%、(15.88±0.89)%。

A：對(duì)照組；B：PAF組；1：皮膚真皮層；2：胃小彎黏膜下層；3：膀胱壁肌層

3 討論

PAF是一種主要累及自主神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)退行性疾病，常于成年發(fā)病，緩慢進(jìn)展，可嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量[9]。其特征為交感和副交感神經(jīng)節(jié)及節(jié)前和節(jié)后自主神經(jīng)元內(nèi)大量α-syn沉積[6-8]，交感神經(jīng)末梢合成和釋放去甲腎上腺素不足進(jìn)而導(dǎo)致交感神經(jīng)功能障礙[7]。臨床主要表現(xiàn)為直立性低血壓、泌汗障礙、便秘、尿失禁、性功能障礙、快動(dòng)眼睡眠障礙等[2]。迄今為止，尚缺乏診斷PAF的生物標(biāo)記物，阻礙了對(duì)PAF的明確診斷和預(yù)后評(píng)估。

α-syn是分布在神經(jīng)突觸前末梢和核周的可溶性蛋白質(zhì)，其正常水平取決于α-syn的合成和清除之間的平衡；α-syn主要通過泛素-蛋白酶體系統(tǒng)降解，其清除功能障礙可能導(dǎo)致病理性α-syn在細(xì)胞內(nèi)積聚形成包涵體，進(jìn)而導(dǎo)致高爾基體、線粒體等細(xì)胞器功能障礙、影響突觸間遞質(zhì)釋放及信號(hào)傳遞，最終引發(fā)毒性反應(yīng)，導(dǎo)致細(xì)胞變性死亡[11-12]。

既往研究[13-16]表明，PAF患者的胸髓和骶髓的中間側(cè)柱是最常見和最嚴(yán)重的受累區(qū)域，PAF可致周圍腎上腺素能神經(jīng)纖維支配受損，其中，脊髓中間外側(cè)柱細(xì)胞變性丟失與直立性低血壓癥狀有關(guān)。目前認(rèn)為，其病理機(jī)制是交感神經(jīng)末梢合成和釋放去甲腎上腺素較少，導(dǎo)致周圍血管阻力降低，靜脈回心血量減少，且心率變異性減低，使患者從臥位轉(zhuǎn)為站立位時(shí)血壓迅速降低且不能反射性升高[7, 17-19]。

皮膚活檢術(shù)是臨床常用的病理檢測(cè)手段之一，其具有創(chuàng)傷性小、操作簡(jiǎn)單的優(yōu)勢(shì)，且皮膚真皮層內(nèi)含有支配血管和汗腺的無髓腎上腺素能和膽堿能交感神經(jīng)纖維。2010年Shishido等[20]對(duì)1例PAF患者的踝部皮膚活檢，首次報(bào)道了PAF患者皮膚交感神經(jīng)纖維中的pα-syn沉積，提示皮膚交感神經(jīng)纖維的功能障礙可能是PAF患者少汗癥的基礎(chǔ)。隨后Donadio等[4]對(duì)9例PAF患者進(jìn)行皮膚活檢，發(fā)現(xiàn)其皮膚交感神經(jīng)纖維中均存在pα-syn沉積，推測(cè)皮膚活檢或可作為PAF早期診斷的手段。本研究通過免疫組化法對(duì)17例PAF患者進(jìn)行皮膚活檢發(fā)現(xiàn)，在皮膚汗腺和血管周圍細(xì)胞內(nèi)可見大量棕黃色、棕褐色粗糙顆粒狀或團(tuán)塊狀聚集物，與以上研究相符。除了直立性低血壓、泌汗障礙，PAF患者還常合并尿失禁、便秘等癥狀。尸檢發(fā)現(xiàn)，PAF患者的結(jié)腸肌間神經(jīng)叢、膀胱壁的自主神經(jīng)遠(yuǎn)端軸突中均可發(fā)現(xiàn)pα-syn沉積[3,6,21]，這可能與PAF患者便秘、尿失禁等癥狀密切相關(guān)。但既往病理研究多在患者死后進(jìn)行，不利于PAF的早期診斷與治療。2014年Masuda等[22]首次對(duì)1例合并便秘的PAF患者行纖維結(jié)腸鏡檢查并活檢，發(fā)現(xiàn)其結(jié)腸肌間神經(jīng)叢中存在pα-syn沉積。本研究對(duì)5例PAF患者的胃小彎、膀胱活檢發(fā)現(xiàn)，胃小彎黏膜下層、膀胱壁肌層可見pα-syn沉積，推測(cè)與胃腸道功能障礙及泌尿功能障礙有關(guān)。周圍器官及組織的pα-syn沉積在PAF的發(fā)病機(jī)制及臨床表現(xiàn)中可能有重要作用。

值得注意的是，PAF與多系統(tǒng)萎縮(multiple system atrophy,MSA)均可出現(xiàn)自主神經(jīng)功能障礙癥狀，且都?xì)w屬于α突觸核蛋白病，憑借臨床癥狀常難以鑒別。前者自主神經(jīng)功能障礙癥狀可持續(xù)數(shù)十年幾乎沒有進(jìn)展，預(yù)后良好，后者確診后的平均生存時(shí)間為9 a，預(yù)后較差。研究[1，8]發(fā)現(xiàn)，MSA患者體位性低血壓是由于心血管自主神經(jīng)中樞通路受損所致，累及節(jié)前自主神經(jīng)元，節(jié)后自主神經(jīng)元及神經(jīng)纖維保持完整，而PAF患者體位性低血壓主要是因?yàn)橹車灾魃窠?jīng)系統(tǒng)受損，自主神經(jīng)節(jié)前及節(jié)后纖維均受累，交感神經(jīng)末梢去甲腎上腺素的合成和釋放缺乏。Donadio等[23]通過半定量評(píng)分，對(duì)手指、大腿、小腿皮膚真皮附件自主神經(jīng)支配評(píng)估發(fā)現(xiàn)， MSA患者皮膚自主神經(jīng)普遍保存完整，得分高于PAF患者，后者表現(xiàn)為明顯的節(jié)后交感神經(jīng)去支配。因此，皮膚自主神經(jīng)病理研究可能是鑒別MSA和PAF的一種可靠的方法。

綜上所述，PAF患者的皮膚、胃腸道、膀胱組織中均可發(fā)現(xiàn)pα-syn沉積，pα-syn或可作為PAF診斷的生物標(biāo)志物。但由于本項(xiàng)研究臨床數(shù)據(jù)較少，尚不能確定pα-syn沉積程度與疾病病程的關(guān)系，或者組織活檢能否應(yīng)用于PAF的早期診斷，還需要擴(kuò)大樣本量，更進(jìn)一步研究和探索。