許雅娟，班彥杰，冉利敏，余艷茹，翟閃閃，孫宗宗，張 淼，張婧?jiǎn)?，?騰，任利單，胡璐璐，王 彪，侯曉峰，石 瑛

1)鄭州大學(xué)第三附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科 鄭州 450052 2)鄭州大學(xué)第三附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科 鄭州 450052

復(fù)發(fā)性流產(chǎn)(recurrent spontaneous abortion，RSA)是指2次或2次以上發(fā)生在20周之內(nèi)的妊娠失敗[1-2]，發(fā)生率高達(dá)3%～5%[3]。RSA病因復(fù)雜多樣， 且50%的RSA病因不明[4]，稱為不明原因的復(fù)發(fā)性流產(chǎn)(unexplained recurrent spontaneous abortion，URSA)。近年來(lái)血栓前狀態(tài)與自然流產(chǎn)的關(guān)系受到廣泛關(guān)注，認(rèn)為胎盤部位的血栓形成可導(dǎo)致流產(chǎn)的發(fā)生[5]。研究[6]表明亞甲基四氫葉酸還原酶(methylene tetrahydrofolate reductase，MTHFR)基因 C677T、A1298C多態(tài)性與血栓栓塞性疾病有關(guān)。盡管有研究[7]發(fā)現(xiàn)MTHFR C677T和A1298C多態(tài)性與URSA有關(guān)，但仍有研究[8]認(rèn)為兩者關(guān)系不明確。本研究采用較大的樣本量進(jìn)一步分析MTHFR基因多態(tài)性與URSA的關(guān)系，期望發(fā)現(xiàn)URSA的遺傳因素，為URSA的預(yù)防和治療提供依據(jù)。

1 對(duì)象與方法

1.1研究對(duì)象選取2016年9月至2018年6月于鄭州大學(xué)第三附屬醫(yī)院進(jìn)行圍產(chǎn)保健的URSA患者230例、正常育齡期女性(對(duì)照)264例。對(duì)照組：至少有過(guò)1次正常妊娠，且無(wú)自然流產(chǎn)病史；URSA組：有2次及以上的不明原因自然流產(chǎn)病史。排除標(biāo)準(zhǔn)：經(jīng)婦科、B超、子宮輸卵管造影等檢查確診生殖器解剖學(xué)畸形；夫婦雙方或胚胎染色體異常；孕早期服用致畸藥物史；胃腸手術(shù)史及嚴(yán)重的消化系統(tǒng)疾病、肝腎功能不全病史；冠心病、糖尿病、甲狀腺疾病、惡性腫瘤、血液系統(tǒng)或免疫系統(tǒng)疾病史；生殖道病原微生物感染；多囊卵巢綜合征、子宮內(nèi)膜異位癥、子宮肌瘤、宮腔粘連等婦科疾病；精神、心理疾?。徊涣辑h(huán)境因素。本研究獲得本院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)， 所有參與者均簽署知情同意書。

1.2一般資料的收集收集2組研究對(duì)象的基本臨床信息，包括最近一次自然流產(chǎn)的年齡、孕前體質(zhì)指數(shù)(BMI)、不良生活習(xí)慣(吸煙、飲酒)情況。

1.3MTHFR 基因C677T、A1298C多態(tài)性的檢測(cè)受檢者漱口后，利用拭子在其一側(cè)口腔頰黏膜反復(fù)刷取數(shù)次，以采集受檢者的口腔黏膜上皮脫落細(xì)胞，然后利用柱式抽提試劑盒抽提樣本DNA。采用熒光定量PCR檢測(cè)多態(tài)性，所用探針信息見表1，相關(guān)儀器、試劑均購(gòu)自美國(guó)ABI公司。PCR反應(yīng)體系10 μL，其中20 mg/L的DNA模板1 μL、2×Taqman Universal Master Mix 5 μL、20×Taqman-MGB探針0.5 μL、去離子水3.5 μL。反應(yīng)條件為95 ℃10 min，隨后依次進(jìn)行20個(gè)循環(huán)的擴(kuò)增(92 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min)和30個(gè)循環(huán)的擴(kuò)增(89 ℃ 15 s，60 ℃ 90 s)，72 ℃延伸10 min后4 ℃保存。反應(yīng)結(jié)束后在PCR儀上讀取樣品孔中的終點(diǎn)熒光，利用SDS 2.4軟件將不同熒光轉(zhuǎn)變?yōu)镈NA序列，從而確定各樣品的基因分型。

表1 Taqman-MGB探針序列

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 21.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2組民族、吸煙、飲酒等情況的比較采用χ2檢驗(yàn)或Fisher精確概率法，孕前BMI、年齡等的比較采用兩獨(dú)立樣本的t檢驗(yàn)。對(duì)對(duì)照組基因型頻率進(jìn)行Hardy-Weinberg 遺傳平衡檢驗(yàn), 基因型和等位基因的分布采用χ2檢驗(yàn)進(jìn)行分析, 并計(jì)算OR及95%CI。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.12組臨床特征比較見表2。

表2 2組臨床特征比較

2.2MTHFR C677T、A1298C位點(diǎn)的等位基因和基因型頻率對(duì)照組MTHFR C677T(χ2=1.113,P=0.573)、A1298C(χ2<0.001，P>0.999)基因型分布均符合Hardy-Weinberg平衡。URSA組和對(duì)照組MTHFR C677T、A1298C等位基因及基因型頻率的比較見表3、4。

表3 2組MTHFRC677T等位基因及基因型頻率的比較 例(%)

表4 2組MTHFR A1298C等位基因及基因型頻率的比較 例(%)

2.3MTHFR C677T 和 A1298C 基因連鎖分析結(jié)果2組MTHFR C677T/A1298C 復(fù)合基因型分布的比較見表5。

表5 2組MTHFR C677T/A1298C復(fù)合基因型的比較 例(%)

3 討論

RSA是多因素作用的結(jié)果。MTHFR基因位于1p36.3[9]，C677T和A1298C是MTHFR基因的2個(gè)重要多態(tài)性，突變后可使MTHFR酶活性降低，從而導(dǎo)致血液中同型半胱氨酸水平升高[10]，造成血管內(nèi)皮損傷，導(dǎo)致血栓形成，而胎盤動(dòng)脈栓塞可致胚胎血供不足，胚胎或胎兒缺血缺氧，最終導(dǎo)致流產(chǎn)發(fā)生[11]。

目前，對(duì)MTHFR C677T多態(tài)性與URSA的關(guān)系[7-8，12]仍存在爭(zhēng)議。有研究[8]表明，MTHFR 677 T等位基因和純合基因型TT均增加了URSA發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)。本研究結(jié)果表明URSA組MTHFR 677位點(diǎn)T等位基因頻率高于對(duì)照組，這與上述研究[8]結(jié)果一致。盡管有研究[7,12]提示MTHFR A1298C多態(tài)性與URSA無(wú)明顯相關(guān)性，但更多的研究[8,13]表明MTHFR 1298C等位基因是URSA的危險(xiǎn)因素。研究[14]發(fā)現(xiàn)，攜帶純合突變基因型(CC)的女性URSA發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)增加。Klai等[13]也發(fā)現(xiàn)攜帶突變基因C的女性發(fā)生流產(chǎn)的風(fēng)險(xiǎn)增加。本研究中，URSA組患者M(jìn)THFR 1298位點(diǎn)C等位基因頻率高于對(duì)照組，提示MTHFR 1298C等位基因是URSA發(fā)生的一個(gè)危險(xiǎn)因素。

有學(xué)者[15]發(fā)現(xiàn)，與677T突變不同的是，1298C突變位于MTHFR基因的調(diào)節(jié)區(qū)域內(nèi)，雜合性(1298AC)和純合性(1298CC)突變不增加同型半胱氨酸的含量，但連鎖基因型677CT/1298AC可顯著增加外周血中同型半胱氨酸的含量。研究[8]表明攜帶復(fù)合雜合子(677CT/1298AC)基因型的患者相對(duì)于具有野生型(677CC/1298AA)基因型的個(gè)體發(fā)生URSA的風(fēng)險(xiǎn)增加4.86倍。本研究中，攜帶MTHFR 677CT/1298AC復(fù)合基因型的女性發(fā)生流產(chǎn)的風(fēng)險(xiǎn)是具有野生型(677CC/1298AA)基因型個(gè)體的7.875倍。這說(shuō)明復(fù)合雜合子基因型與URSA關(guān)系更密切，聯(lián)合檢測(cè)C677T和A1298C位點(diǎn)對(duì)預(yù)測(cè)URPL的意義更大。另外，本研究尚未觀察到同時(shí)攜帶3個(gè)或4個(gè)突變基因的女性，這與以往報(bào)道[8]結(jié)果一致，可能攜帶3個(gè)或4個(gè)突變基因的個(gè)體因嚴(yán)重的表型而早期被自然選擇淘汰。

綜上所述，本研究結(jié)果表明MTHFR C677T和A1298C基因多態(tài)性與URSA有關(guān)，攜帶MTHFR 677CT/1298AC復(fù)合基因型的女性URSA的發(fā)生率將升高。