李 楠,吳文慧,許 瑩,魏子琰

1)華北理工大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院 河北唐山 063000 2)華北理工大學(xué)材料與工程學(xué)院 河北唐山 063000

鈦合金具有密度小、比強(qiáng)度高、生物及力學(xué)相容性較好及易加工成型等特點(diǎn)，已發(fā)展成為一類量大面廣的中高端外科植入物的主要原材料[1]。生物醫(yī)用鈦合金在應(yīng)用過程中主要經(jīng)歷了三次變革，各方面性能逐步優(yōu)化，但是臨床上常因其彈性模量與骨不匹配產(chǎn)生應(yīng)力屏蔽效應(yīng)以及生物相容性差，導(dǎo)致植入失敗。因此研究如何降低鈦合金彈性模量，提高生物相容性具有重要的臨床意義。大量研究[2-4]表明，多孔鈦合金的彈性模量更接近人骨，其孔隙結(jié)構(gòu)有利于骨組織的長入。鉭作為整形外科應(yīng)用的生物材料，在臨床實(shí)踐中獲得了相當(dāng)大的關(guān)注。它具有優(yōu)異的化學(xué)穩(wěn)定性和生物相容性，并且比鈦或鈷-鉻合金更具骨傳導(dǎo)性[5]。作者為提高鈦合金在口腔外科植入手術(shù)的成功率，設(shè)計制備了以多孔鈦合金為基底，表面噴涂鉭活性涂層的新型醫(yī)用鈦合金梯度復(fù)合材料，并應(yīng)用MTT法評價低彈性模量醫(yī)用鈦合金梯度復(fù)合材料的細(xì)胞毒性，為其應(yīng)用于臨床提供生物學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1細(xì)胞與主要試劑L929小鼠成纖維細(xì)胞(華北理工大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院實(shí)驗室提供)。純氫化鈦粉、純鋯粉、純鈮粉、純鉬粉、純鉭粉、無水乙醇、硬質(zhì)酸鈉、RPMI 1640(美國Corning公司)，PBS和胰蛋白酶(以色列BI公司)，胎牛血清(德國Cegrogen公司)，MTT和DMSO(日本TCI公司)，酶標(biāo)儀SM600(上海永創(chuàng)醫(yī)療器械有限公司)，倒置相差顯微鏡Primovert(德國ZEISS公司)，場發(fā)射掃描電子顯微鏡S-4800(日本Hitach公司)。

1.2試件制備利用合金團(tuán)簇模型理論設(shè)計合金成分。采用粉末冶金法在1 400 ℃燒結(jié)2 h制備出Ti-27Nb-6Zr-5Mo合金(鈦合金試件)；采用陽極氧化法在鈦合金表面原位構(gòu)建納米氧化層(氧化層試件)；在構(gòu)建氧化層的基礎(chǔ)上采用等離子噴涂法在鈦合金表面制備鉭涂層，形成以鈦合金為基底，納米氧化層為過渡層，表面覆蓋鉭活性涂層的新型醫(yī)用鈦合金梯度復(fù)合材料(鉭涂層試件)。試件均制備成直徑10 mm、厚2 mm的圓柱體(由華北理工大學(xué)材料與工程學(xué)院實(shí)驗室提供)，置于掃描電鏡下觀察表面形態(tài)。

1.3試件浸提液制備每組取8個試件，用無水乙醇浸泡30 min，超聲波清洗器清洗15 min，去離子水沖洗，121 ℃高壓蒸汽滅菌30 min。經(jīng)過以上處理的試件置于24孔板中，以含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基為浸提介質(zhì)，在37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2培養(yǎng)箱中浸提72 h，試件表面積與培養(yǎng)基體積比為1.25 cm2∶1 mL[6]。浸提液經(jīng) 0.22 μm 濾膜過濾除菌備用。

1.4MTT檢測細(xì)胞增殖取對數(shù)生長期L929細(xì)胞，按每孔2 000個接種于96孔板中，分為5組，每組4孔，每孔加100 μL細(xì)胞懸液培養(yǎng)24 h。待細(xì)胞貼壁后，鈦合金組、氧化層組和鉭涂層組用相應(yīng)試件浸提液置換舊培養(yǎng)基，陰性對照組用含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基置換，陽性對照組用體積分?jǐn)?shù)0.6%的苯酚溶液置換。將細(xì)胞置37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2孵箱中培養(yǎng)，第1、3、5天取出，倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)。每孔加20 μL MTT(5 g/L)，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后棄舊培養(yǎng)基，每孔加150 μL DMSO。室溫下振蕩15 min，調(diào)節(jié)酶標(biāo)儀設(shè)置波長為490 nm，檢測吸光度(A)值。實(shí)驗重復(fù)3次。

1.5毒性分析細(xì)胞相對增殖率(RGR) = (實(shí)驗組A值均值/陰性對照組A值均值)×100%。根據(jù)RGR分5級：>99%為0級；75%～為1級；50%～為 2 級； 25%～為3級；1%～為4級；<1%為5級。0級或1級表示材料毒性低；2級則應(yīng)結(jié)合細(xì)胞形態(tài)進(jìn)行綜合毒性分析；3～5級表示材料毒性大。

1.6統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSS 17.0進(jìn)行分析，同一時間點(diǎn)各組間和各組不同時間點(diǎn)A值比較采用單因素方差分析和LSD-t檢驗，檢驗水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.13種試件掃描電鏡結(jié)果見圖1。

A：鈦合金組(×500)；B：氧化層組(×1 000)；C：鉭涂層組(×5 000)

2.2各組細(xì)胞增殖情況第1、3、5天，鈦合金組、氧化層組和鉭涂層組細(xì)胞形態(tài)正常，呈多角形，核質(zhì)清晰，數(shù)目逐漸增多；陰性對照組細(xì)胞形態(tài)良好，呈多角形，核質(zhì)清晰，數(shù)目逐漸增多；陽性對照組細(xì)胞數(shù)目減少，細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則，可見細(xì)胞碎片，未見明顯細(xì)胞核(圖2)。各組細(xì)胞A值比較見表1。

A:鈦合金組；B：氧化層組；C：鉭涂層組；D：陰性對照組；E：陽性對照組；1～3：分別為第1、3、5天

表1 各組細(xì)胞A值 (n=3)

2.3毒性分析結(jié)果鈦合金、氧化層和鉭涂層第1天毒級均為1級，第3、5天均為0級；陰性對照毒級均為0級；陽性對照第1天毒級為2級，第3天為3級，第5天為4級(表2)。

表2 各組細(xì)胞的RGR %

3 討論

植入材料主要用于恢復(fù)骨組織缺損和修復(fù)破碎的骨組織，由于這些材料與周圍組織的密切接觸，因此它們應(yīng)該無毒且具有良好的生物相容性。細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)被廣泛用于評價醫(yī)用材料的生物相容性。本研究應(yīng)用MTT法測定低彈性模量醫(yī)用鈦合金梯度復(fù)合材料對L929細(xì)胞增殖的影響，并分析其細(xì)胞毒性。多項研究[7]結(jié)果證實(shí)MTT法是一種安全、簡便、快速、可靠的細(xì)胞活性定量方法。該方法用于體外生物相容性評價，因為它提供了有關(guān)細(xì)胞活力的信息。

近年來復(fù)合材料逐漸得到廣泛的關(guān)注，為了彌補(bǔ)單種材料的不足，將兩種甚至多種材料結(jié)合起來，可使其優(yōu)點(diǎn)最大化。很多人體組織具有復(fù)雜奇特的結(jié)構(gòu)，例如骨組織，其內(nèi)部為松質(zhì)骨，疏松多孔彈性大，而外部為密質(zhì)骨，致密堅硬耐壓性強(qiáng)，表層附以堅韌的骨膜為其提供營養(yǎng)物質(zhì)。為模仿天然組織結(jié)構(gòu)，各種雙相[8-10]、多相[11-13]和梯度[14-16]復(fù)合材料已被開發(fā)。實(shí)際上骨組織可被認(rèn)為是一種梯度組織，我們設(shè)計的這個仿生梯度復(fù)合材料，用鈦、鈮、鋯、鉬無毒元素?zé)Y(jié)出近β型的低彈性模量多孔鈦合金，在其表面等離子噴涂高生物活性金屬鉭。為加強(qiáng)兩種金屬的結(jié)合力，在多孔鈦合金表面原位構(gòu)建納米氧化層，這樣的結(jié)構(gòu)不僅可以使鉭涂層更牢固，也可以結(jié)合更多的鉭金屬。這種低彈性模量醫(yī)用鈦合金梯度復(fù)合材料改善了傳統(tǒng)鈦合金彈性模量與骨不匹配、含潛在有毒元素、低生物活性等缺點(diǎn)。

本實(shí)驗采用MTT法檢測低彈性模量醫(yī)用鈦合金梯度復(fù)合材料對小鼠成纖維細(xì)胞L929形態(tài)及增殖率的影響，結(jié)果表明，鈦合金、氧化層和鉭涂層組細(xì)胞形態(tài)良好，呈多角形，胞核清晰，胞質(zhì)均勻，隨著培養(yǎng)時間的延長，細(xì)胞數(shù)量增長迅速；細(xì)胞毒性檢測第1天3種材料均為1級，第3、5天均為0級，說明低彈性模量醫(yī)用鈦合金梯度復(fù)合材料生物安全性良好，無短期細(xì)胞毒性。Xu等[17]研究表明，無論孔隙率百分比如何，多孔設(shè)計有利于細(xì)胞向內(nèi)生長、營養(yǎng)供應(yīng)和細(xì)胞廢物排出，所有多孔Ti-25Nb合金都顯示出良好的生物相容性。于曉明等[18]研究表明，鉭涂層可以沉積在多孔基體的外表面及內(nèi)表面，細(xì)胞黏附實(shí)驗表明鉭涂層表面的細(xì)胞融合情況良好，細(xì)胞分泌基質(zhì)情況均優(yōu)于鈦合金。國外學(xué)者[19]用細(xì)胞黏附劑RGD肽功能化鉭表面，增強(qiáng)了成骨細(xì)胞樣細(xì)胞的附著和擴(kuò)散。鈦合金、氧化層和鉭涂層組的細(xì)胞增殖率均隨著培養(yǎng)時間的延長而增加，第3、5天的細(xì)胞增殖率較第1天明顯提高，并高于陰性對照組，說明構(gòu)建納米氧化層與鉭涂層均可以促進(jìn)細(xì)胞增殖。

本實(shí)驗研究結(jié)果初步表明低彈性模量醫(yī)用鈦合金梯度復(fù)合材料在短期內(nèi)無細(xì)胞毒性，應(yīng)繼續(xù)進(jìn)行更為全面的生物學(xué)實(shí)驗研究。