鄧 潔，王 帥，鄭火青

（浙江大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，浙江 杭州310058）

2019年國內(nèi)外發(fā)表關(guān)于蜜蜂病毒的研究論文共198篇（包括SCI收錄論文167篇），專利文獻(xiàn)共9篇。這些針對(duì)病毒的研究中，大部分涉及了2種或更多種病毒，且與2018年一致：蜜蜂殘翅病毒（Deformed wing virus,DWV）是國外研究的熱點(diǎn)，而囊狀幼蟲病毒（Sacbrood virus,SBV）是國內(nèi)研究熱點(diǎn)。

167篇SCI收錄論文的主要作者共計(jì)來自23個(gè)國家和地區(qū)，發(fā)表論文數(shù)量最多的國家為中國（39篇），其次為美國（38篇）和英國（12篇）。這些文章涉及60種刊物，其中發(fā)表論文數(shù)大于5篇的分別是Viruses（13篇）、Scientific Reports（12篇）、Journal of Apicultural Research（10篇）、Insects（8篇）、PLoS One（7篇）、Journal of Invertebrate Pathology（5篇）和Berliner und Munchener Tierarztliche Wochenschrift（5篇）。

1 病毒流行病學(xué)

流行病學(xué)是蜜蜂病毒學(xué)深入研究的基礎(chǔ)。2019年關(guān)于蜜蜂病毒的流行病學(xué)調(diào)查覆蓋全球多個(gè)國家和地區(qū)，所涉及的病毒宿主也更加多樣化。

1.1 國外研究新進(jìn)展

Kevill等在2016年對(duì)英國的英格蘭和威爾士地區(qū)以及美國32個(gè)州蜂群內(nèi)3種類型DWV（即A型、B型和C型）的流行情況和病毒載量進(jìn)行了季節(jié)性調(diào)查，同時(shí)提供了A型DWV在蜂群水平上比B型DWV的毒力更強(qiáng)的證據(jù)[1]。

Rustemoglu和Sipahioglu對(duì)土耳其多個(gè)地區(qū)共90個(gè)蜂場(chǎng)的蜜蜂進(jìn)行了蜜蜂病毒的定性檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)蜂群被黑蜂王臺(tái)病毒（Black queen cell virus,BQCV）、DWV、SBV和慢性蜜蜂麻痹病毒（Chronic bee paralysis virus,CBPV）感染，其中BQCV的感染率最高（32%）。在該調(diào)查中，蜜蜂樣本中均未檢測(cè)到KBV和IAPV的存在，且被檢測(cè)到的病毒（BQCV、DWV、SBV和CBPV）的總流行率較低[2]。

de Souza等對(duì)巴西的蜜蜂和與蜜蜂緊密接觸的無刺蜂（Melipona subnitida）進(jìn)行了DWV的感染率和病毒量的檢測(cè)，表明DWV可在不同物種間進(jìn)行交叉感染[3]。

D'Alvise等對(duì)德國西南部16個(gè)無患病癥狀蜂場(chǎng)的1 000多只蜜蜂單只定量檢測(cè)了11種病毒、4種寄生蟲和3種病原菌，結(jié)果表明，檢出率最高的病毒是BQCV（占84%），微孢子蟲檢出率達(dá)到96%；所有病毒均顯示季節(jié)性變化，且蜜蜂的低水平感染較為普遍。此外，該研究還表明常見的病原體之間可能存在協(xié)同作用，特別是涉及BQCV時(shí)[4]。

在墨西哥，研究者定量分析了狄斯瓦螨寄生對(duì)當(dāng)?shù)胤侵藁鄯洌ˋfricanized honeybee）羽化、血細(xì)胞濃度、翅完整性和壽命的影響，結(jié)果表明在非洲化蜜蜂發(fā)育過程中，狄斯瓦螨寄生和DWV感染會(huì)導(dǎo)致蜜蜂的死亡、個(gè)體發(fā)生畸形和細(xì)胞免疫被抑制，并能顯著縮短成年蜜蜂的壽命，且非洲化蜜蜂成年個(gè)體對(duì)狄斯瓦螨的耐受性與其自身的免疫機(jī)制有關(guān)[5]。

Li等報(bào)道了美國2株SBV毒株的全基因組序列。低溫脅迫實(shí)驗(yàn)表明，低溫對(duì)感染SBV蜜蜂的健康有顯著影響，直觀表現(xiàn)為幼蟲死亡率的升高，說明SBV在春季的高流行率可能和溫度的波動(dòng)有關(guān)[6]。

1.2 國內(nèi)研究新進(jìn)展

2019年有4篇論文針對(duì)國內(nèi)出現(xiàn)的患病蜂群進(jìn)行了病毒流行病學(xué)分析。王欣欣等對(duì)山東省意大利蜜蜂蜂場(chǎng)的CBPV感染情況進(jìn)行了調(diào)查[7]。遼寧錦州醫(yī)學(xué)院團(tuán)隊(duì)針對(duì)錦州市的SBV和CBPV患病蜂群進(jìn)行了診斷并提出了防治方案[8,9]。董捷等對(duì)浙江省淳安縣的患病中蜂進(jìn)行了SBV的流行病學(xué)調(diào)查[10]。

此外，本年度對(duì)中蜂病毒流行情況的關(guān)注較多。通過對(duì)福建多個(gè)地區(qū)共80個(gè)中蜂樣本進(jìn)行檢測(cè)表明，SBV檢出率達(dá)到90%，DWV檢出率為81.25%，以色列急性麻痹病毒（Israeli acute paralysis virus,IAPV）檢 出 率 為26.25%，而BQCV、CBPV、蜜蜂急性麻痹病毒（Acute bee paralysis virus,ABPV）和克什米爾蜜蜂病毒（Kashmir bee virus,KBV）在所有樣本中均未檢測(cè)到[11]。對(duì)2017年1月至2018年7月間臺(tái)灣北部中蜂和意蜂的SBV流行率的調(diào)查表明，SBV在中蜂和意蜂中的平均感染率分別為72%和53%；在中蜂和意蜂同場(chǎng)飼養(yǎng)的情況下，二者SBV患病率逐漸同步，但SBV對(duì)意蜂的毒力作用較弱[12]。

近年來關(guān)于蜜蜂絲狀病毒（Apis mellifera filamentousvirus,AmFV）的研究不斷推進(jìn)。在2019年，阿根廷和匈牙利蜂群內(nèi)AmFV的流行情況首次通過分子檢測(cè)手段得到確認(rèn)[13,14]。在國內(nèi)，楊大賀等對(duì)意蜂群內(nèi)AmFV的感染情況進(jìn)行了調(diào)查，并解析了AmFV的基因組信息和蛋白質(zhì)組成。AmFV病毒粒子大小約為200×450 nm，絲狀核衣殼長(zhǎng)約40×3 100 nm，經(jīng)過3次疊套，形成“8”字型狀態(tài)。AmFV中國株序列全長(zhǎng)為493 265 bp，GC含量為50.96%，編碼253個(gè)開放閱讀框。病毒關(guān)鍵蛋白共83個(gè)，在囊膜組分中存在的有31個(gè)，在核衣殼組分中存在的有50個(gè)[15]。此外，Wang等的結(jié)果表明東方蜜蜂群內(nèi)的寄生螨上也能檢測(cè)到AmFV[16]。

2 病毒與其他因子的協(xié)同作用

2.1 病毒與寄生螨

2016年3月至2019年6月，Wang等對(duì)國內(nèi)東方蜜蜂群內(nèi)的2種寄生螨（狄斯瓦螨和恩氏瓦螨）的蜜蜂病毒流行情況進(jìn)行了跟蹤調(diào)查，發(fā)現(xiàn)在2種瓦螨上都能檢測(cè)到多種蜜蜂病毒的存在，其中DWV的流行率最高[16]。Sabahi等從伊朗多個(gè)省份的12個(gè)蜂場(chǎng)采集狄斯瓦螨樣本進(jìn)行了ABPV、BQCV、DWV、IAPV和KBV5種病毒的檢測(cè)，ABPV、IAPV和KBV均未檢出，部分狄斯瓦螨有DWV和BQCV[17]。

Barroso-Arevalo等研究了西班牙南部蜂群內(nèi)4種蜜蜂病毒（DWV、BQCV、SBV和IAPV）的感染與狄斯瓦螨的寄生情況，發(fā)現(xiàn)狄斯瓦螨和DWV是影響蜂群健康的主要因素。為了探討免疫基因的表達(dá)量是否可以作為蜂群健康的生物標(biāo)記，作者比較了部分蜂群Relish,Defensin,Domeless和Dorsal 4種免疫系統(tǒng)基因的表達(dá)水平。結(jié)果顯示，Relish可以作為判斷DWV/狄斯瓦螨感染的指標(biāo)，Defensin的表達(dá)量可以衡量一個(gè)蜂群抵抗現(xiàn)有的DVW/狄斯瓦螨感染的能力。作者認(rèn)為，利用免疫基因作為生物標(biāo)志物，對(duì)這些基因進(jìn)行監(jiān)測(cè)有助于更好地了解蜜蜂免疫系統(tǒng)的復(fù)雜生理機(jī)制，可以為控制蜂群內(nèi)DWV和狄斯瓦螨感染提供新的策略和方法[18,19]。

Zhao等對(duì)感染了DWV病毒的狄斯瓦螨和蜜蜂進(jìn)行了RNA干擾（RNA interference,RNAi）、免疫、創(chuàng)傷反應(yīng)、DWV病毒滴度及轉(zhuǎn)錄組等相關(guān)研究。感染早期，DWV病毒滴度較低，Toll通路的Dorsal轉(zhuǎn)錄因子水平及其下游免疫效應(yīng)分子膜肽、蜜蜂抗菌肽和防御素水平較高。狄斯瓦螨和蜜蜂被DWV感染2天后，病毒滴度顯著升高，同時(shí)相應(yīng)的免疫效應(yīng)分子和類泛素蛋白修飾分子（small ubiquitin-like modifier,SUMO）降低。類似的表達(dá)模式也存在于RNA干擾、創(chuàng)面/穩(wěn)態(tài)和組織生長(zhǎng)通路的基因。研究結(jié)果表明，蜜蜂能夠?qū)Φ宜雇唑虳WV感染產(chǎn)生即時(shí)的、短暫的、有限的免疫和穩(wěn)態(tài)反應(yīng)，但之后這些途徑的下調(diào)使蜜蜂容易受到廣泛的病毒復(fù)制的影響[20]。

Wagoner等對(duì)蜜蜂的開蓋清巢行為及其機(jī)理進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)狄斯瓦螨和DWV能引發(fā)蜜蜂的衛(wèi)生行為反應(yīng)。而引起衛(wèi)生行為的化學(xué)信號(hào)在狄斯瓦螨感染的幼蟲提取物中也存在，通過對(duì)10種碳?xì)浠衔锏暮Y選發(fā)現(xiàn)其中2種（Hentriacontene和Tritriacontene）與蜜蜂的衛(wèi)生行為有關(guān)[21]。

Giuffre等對(duì)200只狄斯瓦螨的運(yùn)動(dòng)行為進(jìn)行了錄像分析，并將其移動(dòng)的平均速度與病毒載量聯(lián)系起來，以此來研究狄斯瓦螨的運(yùn)動(dòng)行為與病毒載量的相關(guān)性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)DWV和SBV均可能在狄斯瓦螨的運(yùn)動(dòng)行為中起作用，2種病毒的相互作用通常會(huì)使狄斯瓦螨移動(dòng)得更慢。但病毒載量與狄斯瓦螨行為之間的聯(lián)系可能遠(yuǎn)比想象的復(fù)雜。在蜂群水平上，蜂螨可能會(huì)根據(jù)環(huán)境條件（例如蜂群、繁殖能力和蜂巢溫度等）來改變其行為，而環(huán)境條件又會(huì)通過影響狄斯瓦螨的運(yùn)動(dòng)性而直接影響病毒的傳播能力[22]。

2.2 病毒與殺蟲劑

百菌清是一種廣譜的氯腈殺真菌劑。O'Neal等研究了在田間水平上百菌清對(duì)蜜蜂抗病毒、免疫、生化、營養(yǎng)和生長(zhǎng)發(fā)育形態(tài)等指標(biāo)的影響，這項(xiàng)研究清楚地闡明了百菌清暴露對(duì)蜜蜂免疫、營養(yǎng)和發(fā)育的亞致死影響，但需要進(jìn)一步的試驗(yàn)來研究百菌清是如何與蜜蜂生理相互作用以增加與病毒感染相關(guān)的死亡率[23]。

Coulon等發(fā)現(xiàn)，長(zhǎng)期暴露于吡蟲啉和被CBPV同時(shí)感染的情況下，會(huì)導(dǎo)致CBPV病毒載量增加，且CBPV復(fù)制與卵黃生成素和dorsal-1a基因轉(zhuǎn)錄有關(guān)，但未發(fā)現(xiàn)吡蟲啉和CBPV對(duì)蜜蜂的存活有協(xié)同作用影響，也沒有觀察到蜜蜂對(duì)該農(nóng)藥有代謝能力[24]。

通過分析蜜蜂大腦中差異表達(dá)基因、DWV病毒載量等，Morfin研究了亞致死劑量的噻蟲胺和狄斯瓦螨對(duì)蜜蜂的影響。與噻蟲胺相比，狄斯瓦螨的影響更加普遍；此外，噻蟲胺和狄斯瓦螨共同作用后，蜜蜂大腦中的差異表達(dá)基因數(shù)量反而減少[25]。

2.3 病毒與營養(yǎng)

Dolezal等探索了蜜蜂的食物多樣性與病毒感染之間的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)蜜蜂在感染IAPV時(shí)飼喂多花花粉或高質(zhì)量的單花花粉具有降低其死亡率的效果。食物與病毒感染對(duì)蜜蜂的死亡率具有顯著的影響，這表明良好的飲食可以幫助蜜蜂提高對(duì)病毒感染的耐受性。此外，作者還發(fā)現(xiàn)花粉缺乏和IAPV感染的情況會(huì)增加蜜蜂對(duì)幼蟲的清除行為[26]。而另一項(xiàng)關(guān)于單花花粉和IAPV感染蜜蜂的RNA測(cè)序結(jié)果表明，約2 000個(gè)基因隨著飲食質(zhì)量的改變而改變，但其中只有43個(gè)基因存在差異表達(dá)，其中一些具有已知的免疫、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)和肌肉收縮等功能；通過轉(zhuǎn)錄組比較和功能富集分析發(fā)現(xiàn)，良好的營養(yǎng)條件能減弱病毒對(duì)蜜蜂的影響[27]。

Alger等首次證明蜜蜂能將病毒傳播到花朵上，但檢測(cè)的2種病毒（BQCV和DWV）在植物中分布不均，由此推測(cè)花的性狀、病毒生態(tài)學(xué)、覓食行為的差異可能介導(dǎo)了病毒的傳播。大黃蜂探訪受病毒污染的花朵后并未被感染，這表明通過花朵傳播病毒的可能性很小，傳播可能取決于多種因素的共同作用，例如：跨物種的病毒株的感染性、宿主免疫能力、病毒毒力、病毒載量和大黃蜂接觸被病毒污染的花朵的概率[28]。

3 SBV的研究進(jìn)展

SBV一直是國內(nèi)學(xué)者重點(diǎn)研究的蜜蜂病毒之一。本年度中文論文中有2篇博士學(xué)位論文和2篇碩士學(xué)位論文與此相關(guān)。

通過給中蜂和意蜂2日齡幼蟲及新出房成蜂飼喂SBV，鄭彬悅研究了被SBV侵染后中、意蜂幼蟲的體重、發(fā)育歷期、死亡率及成蜂的體重和存活率的變化，探究中、意蜂對(duì)SBV侵染的敏感性和致病性差異的機(jī)制。試驗(yàn)表明SBV主要對(duì)蜜蜂幼蟲造成危害，其對(duì)中蜂幼蟲的致病性要高于意蜂幼蟲。SBV對(duì)中、意蜂幼蟲和成蜂各階段的發(fā)育、營養(yǎng)代謝、免疫相關(guān)基因的表達(dá)具有不同程度的影響，中蜂幼蟲在變態(tài)期體內(nèi)凋亡相關(guān)基因的高表達(dá)或許是致其死亡的原因，意蜂幼蟲在變態(tài)期增強(qiáng)了營養(yǎng)、免疫和變態(tài)相關(guān)基因的表達(dá)，使得意蜂得以生存更久甚至能成功化蛹。同時(shí)，通過給中、意蜂幼蟲先注射Rack1基因的dsRNA后接種飼喂SBV來探究SBV病毒在宿主體內(nèi)的增殖情況，結(jié)果表明蜜蜂Rack1基因?qū)BV在宿主體內(nèi)的復(fù)制與增殖起到了促進(jìn)作用，這一結(jié)果為蜜蜂囊狀幼蟲病的研究提供了新的治療方向與方法[29]。

孫莉通過試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)SBV可以自然感染意大利蜜蜂的幼蟲并導(dǎo)致其死亡。在對(duì)SBV病毒株特性進(jìn)行分析研究后，用滅活的SBV疫苗免疫母雞制備了特異性卵黃抗體IgY，發(fā)現(xiàn)該卵黃抗體可有效防治囊狀幼蟲病的發(fā)生。此項(xiàng)研究成果為SBV的防治提供了技術(shù)支持，也為其他蜜蜂病毒的治療提供了思路[30]。

李明以其所在實(shí)驗(yàn)室分離到的SBV相關(guān)基因?yàn)榛A(chǔ)，對(duì)目的基因VP2-P-VP1和VP2-VP4-VP1表達(dá)獲得的目的蛋白抗原性進(jìn)行了比較，然后選擇抗原性較好的蛋白代替SBV作為免疫原，制備了抗SBV單克隆抗體，再利用制備的單克隆抗體研制出了雙抗體夾心ELISA檢測(cè)試劑盒。該試劑盒具有較高特異性、敏感性和準(zhǔn)確性，可以用于SBV的臨床檢測(cè)。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果為SBV的快速診斷和早期預(yù)警提供了技術(shù)支持[31]。

此外，還有很多其他關(guān)于SBV的研究進(jìn)展。例如，劉永梅等研究了SBV在Sf9和S2兩種細(xì)胞中感染及增殖能力，結(jié)果表明SBV不能感染S2細(xì)胞，雖能感染Sf9細(xì)胞卻不能在該細(xì)胞中增殖，這可能是因?yàn)镾f9細(xì)胞含有某類可清除SBV的因子[32]；史紅霞等為了研究靶向SBV結(jié)構(gòu)蛋白VP2基因siRNA介導(dǎo)的RNA干擾作用和其對(duì)SBV在中華蜜蜂幼蟲體內(nèi)復(fù)制的影響，通過細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和幼蟲實(shí)驗(yàn)得到的結(jié)果表明SBV結(jié)構(gòu)蛋白VP2基因的特異性siRNA能夠介導(dǎo)產(chǎn)生RNAi，從而影響SBV在中蜂體內(nèi)的復(fù)制[33]；馬躍宇等以SBV的RdRp基因?yàn)榘袠?biāo)，選取RdRp-1和RdRp-2兩個(gè)干擾區(qū)域進(jìn)行了RNAi實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示干擾片段RdRp-1不能顯著下調(diào)RdRp基因的轉(zhuǎn)錄，而干擾片段RdRp-2可顯著性下調(diào)RdRp表達(dá)并具有劑量依賴性，表明RdRp基因可以作為用于SBV防治的RNA干擾靶標(biāo)[34]。

4 新病毒和新病毒株的發(fā)現(xiàn)

Levin等通過宏基因組學(xué)分析發(fā)現(xiàn)2種新型的蜜蜂病毒株：Varroa Orthomyxovirus-1（VOV-1）和Hubei Virga-like 14 Homolog Virus（VDV-4）。相比蜜蜂，VOV-1在狄斯瓦螨中更常見[35]。

Herrero等也在狄斯瓦螨上發(fā)現(xiàn)了3種新的病毒，其中2種是VDV-2和VDV-3的變體（基因組相似度達(dá)到75%），VDV-5為首次被報(bào)道[36]。

5 蜜蜂病毒相關(guān)專利

蜜蜂病毒相關(guān)的專利集中在病毒病的預(yù)防、治療和病毒檢測(cè)試劑盒上。2019年公布的專利中，5項(xiàng)與病毒病的預(yù)防與治療相關(guān)，其中針對(duì)CBPV的有2項(xiàng)、SBV和DWV的各1項(xiàng)，另一項(xiàng)是通過限王產(chǎn)卵等方式預(yù)防和控制病毒性疾病對(duì)蜂群造成損害。檢測(cè)試劑盒一般針對(duì)多種病毒，部分針對(duì)單個(gè)病毒設(shè)計(jì)，如用于檢測(cè)IAPV的RT-PCR檢測(cè)試劑盒。

6 其他

6.1 西奈湖病毒（Lake Sinai virus,LSV）

為了更好地了解LSV的進(jìn)化史，Cornman對(duì)GenBank上的LSV分離株的開放閱讀框、取代率變化和密碼子使用等進(jìn)行了評(píng)估，結(jié)果發(fā)現(xiàn)LSV密碼子的使用與蜜蜂及其他常見的蜜蜂病毒有顯著的不同，這表明LSV與宿主并沒有很強(qiáng)的協(xié)同進(jìn)化關(guān)系。同時(shí)，通過從SRA序列中重建的LSV分離株的系統(tǒng)發(fā)育位置和相對(duì)豐度的分析表明，在公共數(shù)據(jù)庫中，相對(duì)于LSV1和LSV2的姐妹譜系，這二者的檢測(cè)偏差可能過高[37]。該研究進(jìn)一步闡明了LSV分支的相對(duì)分布，確定了分子進(jìn)化的模式，為今后的研究奠定了基礎(chǔ)。

6.2 病毒對(duì)蜜蜂觸角功能的影響

DWV病毒量升高可能會(huì)損害蜜蜂的感知和溝通能力，Kim等便調(diào)查了有無DWV致病癥狀的蜜蜂觸角內(nèi)病毒的存在、位置和富集情況，發(fā)現(xiàn)病毒粒子僅在有癥狀個(gè)體的觸角上皮基底區(qū)發(fā)現(xiàn)，且這些區(qū)域存在準(zhǔn)晶體陣列，表明這些組織內(nèi)病毒正在進(jìn)行復(fù)制。被感染區(qū)域的完整性也遭到損害，這意味著正常的觸角功能和依賴于觸角功能的衛(wèi)生等行為也可能受到了不利影響[38]。

7 結(jié)語

蜜蜂病毒有種類多、易變異、相關(guān)因素多等特點(diǎn)，對(duì)蜜蜂的影響非常復(fù)雜，有很多問題都值得深入研究。近年來，蜜蜂病毒相關(guān)研究報(bào)道呈井噴式增長(zhǎng)，研究?jī)?nèi)容精彩紛呈。這些研究促進(jìn)了人們對(duì)蜜蜂病毒的認(rèn)識(shí)，有利于養(yǎng)蜂生產(chǎn)上對(duì)蜜蜂病毒病的防控。但由于合適蜜蜂細(xì)胞系的缺乏，蜜蜂病毒學(xué)中2個(gè)重要的課題——蜜蜂病毒的致病機(jī)理及有效藥物的篩選仍處于幾乎空白的狀態(tài)，亟待解決。