高 艷，朱雅楠，蘇松坤，聶紅毅

（福建農林大學動物科學學院[蜂學學院]，福建 福州350002）

蜜蜂具有明顯的級型分化和復雜的社會分工，是適合研究社會行為進化的模式生物。蜂群成員間的勞動分工具有極強的可塑性，對于維持群勢，適應環(huán)境變化等有著不可取代的作用[1-2]。工蜂勞動分工分化的哺育蜂和采集蜂不僅在群體繁衍發(fā)展方面發(fā)揮重要作用，更為人類帶來巨大的經濟效益。盡管蜜蜂在農業(yè)經濟和生態(tài)系統(tǒng)服務中起著至關重要的作用，但直到20世紀初才開始在分子和生化水平上研究蜜蜂生物學[3]。哺育蜂分泌出的蜂王漿不僅對蜂群的發(fā)展至關重要，對于協調人體內各項機能的健康發(fā)展也起到不可或缺的作用。蜂王漿是僅次于蜂蜜的主要蜂產品，蜂王漿的生理生化、藥理療效功能已在國內外得到廣泛的研究，同時蜂王漿產業(yè)帶來了巨大的經濟效益。經過多年的發(fā)展，從普通意大利蜜蜂中培育的“浙農大1號”意蜂的王漿產量高出普通意蜂的10倍以上，極大地提高了我國蜂王漿的產量，使我國成為世界上蜂王漿生產和輸出的第一大國，也極大地促進了我國蜂業(yè)經濟的高速發(fā)展。因此，探究蜂王漿形成的生物學機制對后期培育出更加優(yōu)質高產的蜂王漿品種（蜂種）有著重要的理論意義。本文對西方蜜蜂咽下腺、上顎腺、腦的形態(tài)結構、生理功能以及現階段分子水平等已有研究報道進行綜述，以期為深入研究蜂王漿的分泌機制和培養(yǎng)蜂王漿優(yōu)質高產的蜂種提供理論參考。

1 咽下腺

1.1 咽下腺的形態(tài)結構

蜂王漿主要由哺育蜂咽下腺和上顎腺分泌，其中咽下腺是分泌王漿的主要器官[4-5]。咽下腺位于工蜂頭內部，呈葡萄串狀纏繞在頭部兩側，其生理功能會隨著工蜂在蜂群內職務的改變而變化。目前，咽下腺發(fā)育的形態(tài)研究主要是借助顯微鏡及各類染色技術觀察不同日齡條件下咽下腺腺泡的體積或面積。此外，超顯微結構發(fā)現咽下腺的發(fā)育不僅與工蜂的日齡和行為相關，也受其他因素的影響，如蜜蜂的種系、蜂群條件、季節(jié)氣候等[6]。咽下腺發(fā)育所需的蛋白主要來源于蜂群中花粉的供應[7]。

咽下腺在哺育蜂時期腺泡體積達到最大、內容物最充實，是觀察腺泡形態(tài)的最佳時期[8]。在自然蜂群中，10日齡左右的哺育蜂咽下腺腺泡中大部分充滿發(fā)育好的層狀粗內質網，21日齡左右的采集蜂后粗內質網減少[9]。通過體視顯微觀察，發(fā)現漿蜂（一種從意大利蜜蜂品種中篩選出的高產蜂王漿蜂種）較普通意大利蜜蜂（以下簡稱意蜂）的咽下腺腺泡發(fā)育早、內容物增多，呈乳白色，分泌蜂王漿時間長[10]。共聚焦顯微觀察咽下腺由數千個雙細胞單元組成，這些雙細胞單元由分泌細胞和導管細胞組成，并且這些雙細胞單元圍繞長的收集管以約每12個1組排列而成[11]。Klose等人通過DAPI和鬼筆環(huán)肽染料對蛹期和剛出房意大利工蜂的咽下腺進行染色，發(fā)現咽下腺是由假復層上皮排列的球囊發(fā)育成為成年工蜂的復雜器官[11]。通過考馬斯亮藍對不同發(fā)育日齡的咽下腺染色，普通光學顯微鏡下觀察染色后的咽下腺，發(fā)現9日齡工蜂（哺育蜂階段）的咽下腺的體積達到最大[6]。掃描電鏡觀察發(fā)現漿蜂咽下腺大小顯著高于意蜂，特別是在15日齡[12]。相比于意蜂，漿蜂咽下腺的腺泡體積增大，線粒體、粗面內質網面積變大，核仁數目增多，分泌周期長[9,10,13]。

比較漿蜂和意蜂的形態(tài)學，可以發(fā)現哺育蜂階段漿蜂咽下腺分泌活性的增強，這也為進一步豐富工蜂咽下腺的形態(tài)學以及掌握咽下腺形態(tài)發(fā)育與蜂王漿分泌能力提供理論參考。

1.2 咽下腺的生理功能相關研究進展

咽下腺的發(fā)育周期與勞動分工密切相關，但并不受日齡的限制，為適應蜂群的需要，咽下腺在大小和形態(tài)上也有很大的變化[14,16]。咽下腺在哺育蜂中主要負責分泌蜂王漿，而在采集蜂中主要職責轉變?yōu)榉置谙纸饷傅萚17-18]。哺育蜂階段，咽下腺發(fā)育飽滿并合成王漿主蛋白（Major Royal Jelly Proteins,MRJPs），而在采集蜂階段，它們會萎縮并合成將花蜜加工成蜂蜜的碳水化合物代謝酶[19-20]。蛋白質是蜂王漿的主要成分，超過80%的蜂王漿蛋白由MRJPs組成[21]；MRJPs一般是含鐵量最多的蛋白，一定量的鐵可以提高蜂王漿的營養(yǎng)價值[22]。此外，哺育階段的哺育行為會刺激咽下腺分泌相關蛋白[16,23]。

隨著組學技術的發(fā)展，基于日齡依賴性的工蜂咽下腺發(fā)育階段的轉錄組和蛋白質組的研究大量涌現。轉錄組學分析不同發(fā)育階段意蜂咽下腺的差異基因，結果顯示大量上調差異基因參與核糖體、內質網中的蛋白質加工、蛋白質輸出等通路[24]；蛋白質組學分析意蜂咽下腺不同發(fā)育階段的蛋白質，其中包括MRJPs、細胞骨架、抗氧化劑活性、發(fā)育調節(jié)以及碳水化合物、脂質和蛋白質代謝相關的蛋白質[25]；意蜂和漿蜂蛋白質組學的全面表征和比較發(fā)現：漿蜂哺育蜂階段咽下腺中的大量上調蛋白參與能量代謝、蛋白質生物合成、氨基酸代謝、細胞骨架和抗氧化。這些上調蛋白質參與的生化功能不僅促進咽下腺的發(fā)育而且也激發(fā)其分泌大量蜂王漿的能力[12,16]。

MRJPs屬于Yellow蛋白質家族成員，由一系列的家族基因編碼，包括MRJP1～9[26]。具有營養(yǎng)價值功能的MRJP1～3和MRJP5占蜂王漿蛋白總量的82%～90%，其中MRJP1是MRJPs家族成員中含量最豐富的一種，由單體和低聚形式組成，該低聚物的分子量介于350～420 kDa之間，可分為55～5 kDa的單元。MRJP2，MRJP3，MRJP4和MRJP5是 介 于49～80 kDa之間的糖蛋白[27-28]。工蜂咽下腺組織中的MRJP1～5和MRJP7的基因表達量和蛋白質含量呈日齡依賴性，并且在哺育蜂階段其表達量增加而在采集蜂階段減少。但MRJP6的表達譜相對其他MRJPs有很大差異，其在采集蜂階段的咽下腺中表達量高于哺育蜂階段[29]。另外一些基因，包括Apis mellifera buffy(Ambuffy)、Apis mellifera gustatory receptor 10(Am-GR10)、Major royal jelly protein 2(Mrjp2)在哺育蜂咽下腺中的表達量高于采集蜂，暗示它們在蜜蜂的哺育行為中起著基礎性作用[30-31]。此外，哺育蜂咽下腺的生理狀態(tài)也受到蛻皮激素和幼蟲信息素相關信號傳導的協同調控[30]。

2 上顎腺

2.1 上顎腺的形態(tài)結構

工蜂上顎腺由分泌部和儲液囊二部分結構組成，分泌部的分泌細胞中布滿儲存池，這與工蜂的分泌功能有關[32-34]。研究顯示：意蜂工蜂的上顎腺形態(tài)從羽化出房到采集過程中呈無規(guī)律變化，體積不隨日齡增長發(fā)生明顯的變化，在出房時上顎腺發(fā)育已基本完成[35]。

2.2 上顎腺的生理功能以及研究進展

工蜂上顎腺主要合成和分泌脂肪酸（蜂王漿主要成分之一）以及蜂群報警激素相關的2-庚酮等信息素[36]，工蜂上顎腺分泌脂肪酸的主要功能用于幼蟲食物營養(yǎng)[37]。上顎腺的組成和分泌量不僅取決于蜜蜂的級型，而且還取決于工蜂的日齡[38]。蜂王漿的成分主要由水、蛋白質、糖類、磷脂類、脂質、礦物質和維生素等組成，其中脂質主要由中鏈脂肪酸組成。脂質中的主要成分10-羥基-2-癸烯酸（10-hydroxy-2(E)-decenoic acid,10-HDA）是蜂王漿所特有的成分，也是評價蜂王漿質量的重要參考標準[28]。蜂王漿已被證明具有廣泛的藥理作用，包括抗氧化活性、抗炎癥活性、免疫調節(jié)活性等[28]，蜂王漿的抗菌作用也是其重要生理功能之一，與蜂王漿含有的10-HDA有關。此外，對哺育蜂腦、上顎腺、咽下腺轉錄組測序發(fā)現抗菌肽基因在咽下腺中的表達量顯著高于腦部和上顎腺組織，暗示蜂王漿的抗菌作用還與蜂王漿中豐富的抗菌多肽有關[39]。同時，文獻報道：上顎腺還分泌糖類，其中包括D-葡萄糖、果糖和蔗糖[40]。

工蜂上顎腺主要合成10-HDA、10-羥基癸烯酸（10-hydroxy-decanoic acid，10-HDAA）等ω位功能化脂肪酸，但也合成少量的9-HDA等ω-1位功能化脂肪酸[37,41,42]。哺育蜂上顎腺合成10-HDA和10-HDAA的量一般高于采集蜂[43]，并且蜂王漿成分中的ω-羥基酸（10-HDA、10-HDAA）及其相應的二酸是由哺育蜂上顎腺分泌的[44]，這些酸是蜂王漿中的主要脂質成分[38]。

工蜂上顎腺分泌物合成的生化途徑報道較多，一般認為，硬脂酸是上顎腺合成分泌物的最適合前體[45]。硬脂酸經過ω-羥基化得到ω-羥化硬脂酸，ω-羥化硬脂酸經過一系列β-氧化和功能化修飾得到主要分泌物10-HDA[46]。脂肪酸的合成均經過羥基化、β氧化和功能集團修飾。Plettner等[37]認為羥基脂肪酸的β-氧化過程中可能有不同種類的酶催化不同長度的脂肪酸，其中細胞色素P450是負責催化末端羥基化的關鍵蛋白[47]。此外，細胞色素P450與昆蟲體內保幼激素、蛻皮激素的合成密切相關[47]。

工蜂上顎腺分泌物的相關研究多見于借助GC-MS、HPLC技術定量檢測工蜂上顎腺內的10-HDA含量，如：GC-MS對黑小蜜蜂（Apis andreniformis Smith）、小 蜜 蜂（Apis florea Fabricius）、大蜜蜂（Apisdorsata Fabricius）、東方蜜蜂（Apis cerana Fabricius）、西方蜜蜂（Apis mellifera L.）5種蜂的工蜂上顎腺內容物進行測定，結果表明：10-HDA在大蜜蜂和西方蜜蜂工蜂上顎腺中含量較高[41]；利用HPLC對0～30日齡意蜂工蜂頭部的10-HDA進行測定，結果發(fā)現工蜂上顎腺中10-HDA含量隨日齡總體呈逐漸上升的趨勢，在10～20日齡間保持平衡，30日齡含量達到最高，推測10～20日齡工蜂可能參與哺育行為，上顎腺分泌物有一部分已分泌進入蜂王漿中，而25、30日齡處于采集階段，因此，10-HDA含量處于較高值[48]。

借助不斷發(fā)展的組學技術，有關上顎腺參與蜂王漿分泌過程合成主要脂肪酸物質的生化過程在轉錄組和蛋白質組方面的研究也取得了一定的進展。轉錄組學分析意大利蜜蜂上顎腺分泌物合成途徑，發(fā)現細胞色素P450（CYP450）家族基因參與脂肪酸β-氧化和ω-氧化，其中CYP6AS8是工蜂中CYP450家族基因中表達量最高的基因，這一結果有助于闡明脂肪酸衍生的信息素生物合成的分子基礎[49]。

李建科團隊利用蛋白質組對日齡依賴性的意蜂和漿蜂上顎腺進行比較，結果顯示剛出房工蜂中，蛋白質組形成于上顎腺發(fā)育的起始階段。在哺育蜂階段，它在脂質合成中驅動高分泌活性；在采集蜂階段，它通過誘導脂質代謝和小分子等活動，合成特殊氣味物質以提高采集效率。特別在哺育蜂階段，特異性和高度豐富的蛋白主要富集于與物質轉運和脂質合成相關的通路，這表明上顎腺優(yōu)先啟動脂質合成中的高分泌活性以作為提供幼蟲營養(yǎng)方面的來源，正是通過這個過程，哺育蜂上顎腺通過激活脂質合成維持所需的脂肪酸來源（蜂王漿的主要成分）并最大限度地降低脂質降解以增加10-HDA合成，從而有助于提高蜂王漿的產量[38]。

3 腦

3.1 腦的形態(tài)結構

蜜蜂的大腦由幾丁質外殼包圍，打開蜜蜂頭部正面幾丁質后，整個腦隱藏于咽下腺、頭唾腺以及眼部色素下面[50]。大腦體積不足1 mm3，重量不足1 mg，神經元不足1萬個，擁有的神經細胞不足100萬個，但大腦有著一般模式昆蟲所不具備的認知能力[51-53]。

3.2 腦的生理功能以及研究進展

蜜蜂的大腦幾乎能夠調控它所有的行為，如，學習記憶行為、哺育行為、采集行為、跳舞行為等。蜜蜂表現出的各種行為響應由腦部相對簡單的神經系統(tǒng)所調控，其中包括從哺育行為到采集行為的生命過渡過程，如分泌蜂王漿哺育幼蟲、采集、識別顏色和嗅覺線索、舞蹈交流、群體防御等[54-56]。

蜂王漿的分泌由哺育蜂哺育行為所介導，這一哺育行為已被人工用于生產蜂王漿供人類食用，由哺育行為介導的蜂王漿分泌過程離不開哺育蜂腦部復雜網絡機制的調控。一般認為，蜂王漿由適齡工蜂的咽下腺、上顎腺共同分泌[57-58]，而哺育行為介導的王漿分泌過程離不開中心器官——大腦的調控。腦部中樞神經系統(tǒng)通過調控咽下腺和上顎腺相關基因的表達，促進這些腺體的發(fā)育并且增強它們分泌蜂王漿的功能[59]。

基于日齡依賴性工蜂在從巢內工作向巢外采集的轉變過程[60-62]與大腦的結構、基因表達和蛋白質合成的變化相關[63]，同時也與激素和神經化學物質的生理過程以及成千上萬基因的表達變化相關[31]，例如其在功能和形態(tài)方面的轉變會受保幼激素的控制[64]。

現大多研究主要集中從組學技術方面探討腦部調控行為的分子機制。轉錄組學方面分析腦部相關基因的表達變化，發(fā)現哺育蜂的大腦中高量表達的基因可能參與軸突形成和細胞黏附，這些基因可能參與哺育蜂在轉向采集活動之前的大腦結構變化[60]。哺育蜂腦部磷脂酰肌醇信號轉導和花生四烯酸代謝水平的提高有助于增強嗅覺對幼蟲信息素刺激的反應[65]，而在采集蜂腦部，與神經信號傳導相關的通路（SNARE在囊泡運輸中的互作，wnt信號通路，TGF-beta信號通路等）的功能加強，增強了采集蜂的采集能力，這可以為蜂群提供充足的蛋白質食物進而滿足哺育蜂分泌蜂王漿對蛋白質的需求[65]。從蛋白質組學方面分析腦部膜蛋白，發(fā)現哺育蜂的大腦對蜂王漿分泌產生了一種獨特的神經肽，哺育蜂分泌蜂王漿能力的增強與調節(jié)行為過程中高度增強的神經肽有關，并通過調節(jié)水穩(wěn)態(tài)、對幼蟲信息素的識別、采集能力和收集花粉來增加蜂群群體的營養(yǎng)供應進而提高蜂王漿的分泌，從而在提高蜂王漿產量方面發(fā)揮了作用[59]。

此外，除腦部神經肽方面的相關研究外，關于腦部調控王漿分泌機制的研究多見于基于日齡依賴性開展的工蜂腦部磷酸化蛋白質組學和膜蛋白質組學方面，以及基于日齡依賴性開展意蜂與漿蜂之間的腦部蛋白質組學工作[55,58,59,63]。此外，借助微陣列分析技術而展開基于日齡依賴性的工蜂腦部基因表達變化也有相關的報道[66]。

4 小結與展望

蜂王漿分泌機制的研究機理一直是蜂業(yè)界探討的熱點和難點。到目前為止，對蜂王漿分泌的分子機制的廣泛研究集中在咽下腺組織，如李建科團隊通過對意蜂咽下腺蛋白質組學和代謝組學的深入研究發(fā)現并明確了調控蜂王漿高產的關鍵代謝通路和蛋白質功能[16,58,67]。然而，蛋白質合成和蜂王漿分泌在哺育階段的機制尚不清楚。

目前在對上顎腺分泌物中相關脂肪酸的研究取得了一定的進展，但對上顎腺分泌物中其他方面的分子機理的研究并不多。研究蜜蜂上顎腺中基因以及蛋白的表達與調控，對揭示上顎腺分泌物合成的分子機制和深入了解上顎腺相關靶基因誘導蜂王漿分泌的分子機制有著重要的意義，結合對脂肪酸代謝過程的了解，能夠為旨在提高漿蜂中10-HDA含量的蜜蜂分子育種工作提供參考。

蜜蜂大腦是進行信息處理和行為調控的中央樞紐，對協調咽下腺和上顎腺等組織分泌蜂王漿有著重要的作用，但目前科研界對蜜蜂大腦的研究主要集中在勞動分工、學習記憶、級型分化等方面，其中在勞動分工方面的研究會涉及哺育蜂哺育行為相關的網絡調控機制，這也能夠為人們深入腦部調控腺體組織分泌蜂王漿的分子機制提供參考。

綜上所述，本文總結了與蜂王漿分泌密切相關的3個腺體/器官的研究進展，期望從多維度為后續(xù)蜂王漿分泌的分子機制提供新的視角和理論參考。然而，目前關于蜂王漿分泌機制的研究主要集中于自然蜂群中不同日齡工蜂的咽下腺、上顎腺和腦，篩選了大量與蜂王漿分泌機制相關的關鍵候選基因。但是這些關鍵候選基因中部分基因也有可能是由于日齡差異所導致，因此，在后續(xù)研究中應該利用蜜蜂行為的可塑性，人工組建相同日齡的蜂群，排除日齡因素的影響，進而縮小與蜂王漿分泌機制相關的候選基因的范圍。同時隨著基因組編輯CRISPR/Cas9技術的成熟以及在蜜蜂中成功的應用，該技術將為后期關鍵候選基因功能的驗證提供了有力的工具，同時也為闡明蜂王漿分泌和調控的分子機制提供新的方向。