林法喜，孫紅勇*

（南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院，江蘇 南京 210029）

精子發(fā)生是一個細胞分化過程，高度有序，男性不育受到精子發(fā)生異常的直接而深刻的影響[1]?，F(xiàn)階段，對生精細胞分化進行穩(wěn)定研究的細胞平臺仍然缺乏，在研究精子發(fā)生的過程中需要將特定類型的生精細胞從研究物種的睪丸中分離出來作為研究起始材料[2]。重力密度梯度沉降法能夠?qū)⑸毎蛛x出來，和二代測序技術(shù)有機結(jié)合將生精細胞特異的miRNA表達譜在鼠精子發(fā)生過程中的變化規(guī)律、4種生精細胞中miRNA表達譜變化規(guī)律尋找了出來[3]。本文研究了重力密度梯度沉降法中生精細胞類型吖啶橙染色快速鑒定的方法。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

購買北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部實驗動物學(xué)部提供的20只3周齡、10只5周齡SPF級ICR品系雄性小鼠，動物許可證號：SCXK（京）2016-0010。

1.2 實驗試劑

購買Sigma公司生產(chǎn)的花生凝集素（FITC標記）、胰蛋白酶、膠原酶、DNAasel，Hyclone公司生產(chǎn)的1640培養(yǎng)基，羅氏公司生產(chǎn)的細胞核染料，BD Falcon公司生產(chǎn)的40μm細胞網(wǎng)篩。

1.3 方法

1.3.1 分離生精細胞

運用重力密度梯度沉降法，粗線期從3周小鼠睪丸獲得精母細胞、長形、圓形精子細胞。運用頸椎脫臼法將小鼠處死，將睪丸取出來，將白膜剝?nèi)?。用小剪刀剪碎曲細精管至漿糊狀，向50ml離心管中轉(zhuǎn)移，用Krebs溶液補到20～25ml，冰上進行5min靜置，將上清棄去。將10μl 1g/L DNase I+10ml 1g/L膠原酶加入，在37℃溫度下進行10min水浴振蕩，同時不時吹吸，在此過程中將吸管充分利用起來，消化生精小管為極小片段，鏡檢從生精上皮分離出大多數(shù)生精細胞，之后將30ml左右預(yù)冷的Krebs溶液加入，將消化終止。在4℃的溫度下進行5min離心，將速率設(shè)定為1000r/min，將上清棄去，將10μl 1g/L DNase I+5ml 1g/L胰蛋白酶加入，在37℃的溫度下進行10min左右的水浴振蕩，同時不時用吸管吹吸，直到鏡檢視野中絕大多數(shù)為散在的單細胞，將30ml左右預(yù)冷的0.5% BSA/Krebs溶液加入，將消化終止。在4℃溫度下進行5min離心，將速率設(shè)定為1000r/min，將上清棄去。用0.5% BAS/Krebs洗細胞沉淀1次，在4℃溫度下進行5min離心，將速率設(shè)定為1000r/min，將上清棄去。最后懸起細胞沉淀，在此過程中將15～20ml 0.5%BSA/Krebs充分利用起來，同時經(jīng)40μm細胞網(wǎng)篩過濾。將細胞收集起來并編號，每管12ml左右，將150μl從每管中取出來，在96孔板中加入，將1.5μl 0.2g/L吖啶橙染液加入到每孔中，以輕柔的動作拍打混勻。將細胞純度、類型確定下來，途徑為熒光倒置顯微鏡（Zeiss Axio Observer DI）下觀察，并將同類細胞合并。吖啶橙染色觀察：熒光通道鏡下細胞核、細胞質(zhì)分別深染、淺染，分別呈綠色、淡黃色或橘黃色，具有較為清晰的染色背景、顯著的形態(tài)。但是拍攝出的圖片在相機的限制下只能區(qū)別細胞核、細胞質(zhì)的深染、淺染。

1.3.2 熒光染色

用PBS液洗滌生精細胞2次，每次在4℃溫度下進行5min離心，將速率設(shè)定為2000r/min，之后向1.5ml離心管中轉(zhuǎn)移，用1ml PBS懸起，將20μl細胞懸液取出來涂片，自然晾干。室溫下將細胞涂片固定起來，在此過程中將4%多聚甲醛充分利用起來，0.5% Triton X-100透化，同時漂洗，在此過程中將PBS充分利用起來，將FITC/PNA染頂體20μg/ml加入，室溫下進行40min左右的孵育，將DAPI染細胞核1μg/ml加入，室溫下進行5min的孵育，漂洗過程中將PBS充分利用起來，封片觀察。

2 結(jié) 果

2.1 吖啶橙染色能夠?qū)⒑习w對生精細胞鑒定的干擾排除

吖啶橙染色能夠?qū)忡R下合胞體現(xiàn)象（兩個或多個細胞聚集形成）與圓形細胞進行有效區(qū)分。

2.2 吖啶橙染色鑒定小鼠粗線期精母細胞

光鏡下粗線期精母細胞具有較大的直徑，為12～18μm，平均（15.2±2.3）μm，呈球形。吖啶橙染色結(jié)果表明，粗線期精母細胞較大，具有較多的核質(zhì)比、顯著的染色質(zhì)結(jié)構(gòu)。

2.3 吖啶橙染色鑒定小鼠圓形精子細胞

光鏡下圓形精子細胞直徑為8～10μm，平均（9.1±1.2）μm，呈球形。吖啶橙染色結(jié)果表明，圓形精子具有較小的體積，在細胞中央或偏向細胞一側(cè)分布，細胞核為圓形。

2.4 吖啶橙染色鑒定小鼠長形精子細胞

光鏡下長形精子形變，具有各異的形態(tài)。吖啶橙染色結(jié)果表明，長形精子細胞的細胞核形變，濃縮變小，通常呈顯著長條形，具有極性。

2.5 3種生精細胞DAPI/PNA染色鑒定純度

熒光染色分離到的粗線期精母細胞、圓形精子細胞、長形精子細胞的細胞核/頂體純度均為90%。

3 討 論

在重力密度梯度沉降法中，如何將高純度的生精細胞獲取過來是一個技術(shù)難題，而對分離到的生精細胞純度來說，鏡檢沉降后分離出的各管細胞組分發(fā)揮著極為重要的作用[4]。本研究改進了鏡檢方法，用吖啶橙熒光染色收集到的每管細胞，只需要在96孔板中加入吖啶橙染液就能夠觀察，不需要額外處理細胞，和細胞核細胞質(zhì)形態(tài)檢測中細胞大小形態(tài)檢測中直接光鏡下觀察相比具有較短的檢測時間、較為簡便的操作，能夠?qū)㈤L形、圓形精子細胞、粗線期精母細胞精確、快速鏡檢出來，從而促進生精細胞得量、純度的有效提升。本研究結(jié)果表明，吖啶橙染色能夠?qū)忡R下合胞體現(xiàn)象（兩個或多個細胞聚集形成）與圓形細胞進行有效區(qū)分。光鏡下粗線期精母細胞呈球形，具有較大的直徑。粗線期精母細胞較大，具有顯著的染色質(zhì)結(jié)構(gòu)、較多的核質(zhì)比。光鏡下圓形精子細胞呈球形。圓形精子具有較小的體積，在細胞中央或偏向細胞一側(cè)分布，細胞核為圓形。光鏡下長形精子形變，具有各異的形態(tài)。長形精子細胞的細胞核形變，濃縮變小，通常呈顯著長條形，具有極性。熒光染色分離到的長形精子細胞、圓形精子細胞、粗線期精母細胞的細胞核/頂體純度均為90%，充分證實了這一點。

綜上所述，重力密度梯度沉降法中生精細胞類型吖啶橙染色快速鑒定的效果好，值得推廣應(yīng)用。