姚淑芳 董海平 黃慕超 林建鋒

肺癌在世界范圍內(nèi)是最常見的惡性腫瘤之一，我國肺癌的發(fā)病率和死亡率均高居腫瘤的第一位[1]。肺癌的治療手段包括手術(shù)切除、放療和化療等傳統(tǒng)治療及分子靶向療法和生物治療等新型治療[2-3]，雖然其治療效果具有一定程度的進展，但是肺癌的死亡率仍然居高不下，預(yù)后未見明顯改善，5年生存率僅有15%左右[4]。肺癌的侵襲轉(zhuǎn)移及治療過程中出現(xiàn)的化療、靶向藥物的耐藥和放療抵抗，是患者預(yù)后較差的主要原因[5]，同時肺癌發(fā)病過程是復(fù)雜的，因此探索肺癌發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮作用的一些重要分子，對提高肺癌患者治療的敏感性及改善預(yù)后具有重要意義。多形性腺瘤基因樣蛋白2(pleomorphic adenoma gene-like protein 2, PLAGL2)為轉(zhuǎn)錄因子，在多種腫瘤的發(fā)展中發(fā)揮重要作用[6-7]，數(shù)據(jù)庫分析數(shù)據(jù)，顯示在肺腫瘤中具有高PLAGL2表達的患者更容易被發(fā)現(xiàn)[8]。無剛毛鱗甲復(fù)合體樣蛋白2(achaete-scute homologue 2, ASCL2)屬于保守的轉(zhuǎn)錄因子，是wnt/β-catenin信號通路重要的靶基因之一[9]，wnt/β-catenin信號通路是調(diào)控腫瘤增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移等惡性行為的經(jīng)典信號通路[10-11]，研究發(fā)現(xiàn)ASCL2在多種腫瘤中為致癌基因，在肺鱗癌中高表達[12]。PLAGL2和ASCL2在肺癌中的表達水平及是否具有相關(guān)性，引起我們的關(guān)注，因此本研究通過qRT-PCR和免疫組化檢測PLAGL2、ASCL2在肺癌組織和癌旁組織中的表達情況，并分析兩者在肺癌中表達的相關(guān)性及PLAGL2、ASCL2表達與患者臨床病理參數(shù)和預(yù)后的關(guān)系，為PLAGL2、ASCL2可能作為肺癌治療基因提供基礎(chǔ)實驗依據(jù)。

資料與方法

一、臨床資料

收集2016年1月～2018年1月入住我院患者手術(shù)標本86例，標本收集納入標準：首次行手術(shù)切除治療，術(shù)前未接受放化療和分子靶向治療等任何抗腫瘤治療，組織類型經(jīng)2位以上病理專家證實，病例資料和隨訪資料完整。標本收集排除標準：合并其他類型腫瘤，具有傳染病，患有威脅生命健康的嚴重疾病，其中患者年齡29～73歲，平均年齡(43.95±21.36)歲。經(jīng)醫(yī)院倫理委員會審核通過，患者均簽署知情同意書。

二、 材料與試驗方法

1 試劑與儀器 RNAsimple 總RNA提取試劑盒購自北京天根生化科技有限公司；PrimeScriptTM RT reagent Kit反轉(zhuǎn)錄、SYBR Premix Ex TaqTM qRT-PCR試劑盒等均購自日本TaKaRa公司；PLAGL2、ASCL2、內(nèi)參GAPDH引物均由美國Invitrogen公司合成；兔抗人PLAGL2多克隆抗體(ab139509)，兔抗人ASCL2多克隆抗體(ab107046)均購自英國Abcam公司；DAKO試劑盒購自德國Darmstadt公司；DAB顯色試劑盒、非免疫羊血清均購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；加拿大中性樹膠，購于Solarbio公司。

2 qRT-PCR 收集手術(shù)切除的肺癌組織及遠離腫瘤5 cm以上的癌旁組織，置于-80℃液氮中保存，根據(jù)RNAsimple 總RNA提取試劑盒說明書提取組織中總RNA。測得RNA濃度，根據(jù)PrimeScriptTM RT reagent Kit反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將總RNA逆轉(zhuǎn)為cDNA。PLAGL2引物F:GAGTCAAGTGAAGTGCCAATGT, R:TGAGGGCAGCTATATGGTCTC；ASCL2引物F:CGTGAAGCTGGTGAACTTGG, R:GGATGTACTCCACGGCTGAG；內(nèi)參GAPDH引物F:CTGGGCTACACTGAGCACC, R:AAGTGGTCGTTGAGGGCAATG。以cDNA作為模板，每個樣品設(shè)置3個反應(yīng)復(fù)孔，進行熒光定量PCR。反應(yīng)條件:95 ℃預(yù)變性5 s，95 ℃變性5 s、60 ℃退火30 s 共40 個循環(huán)，分析各樣品的Ct值 (threshold cvcle，循環(huán)閾值)，用2-ΔΔCt法分析各組實驗數(shù)據(jù)。

3 免疫組織化學(xué) 收集手術(shù)切除的肺癌組織及遠離腫瘤5cm以上的癌旁組織固定在4%的中性甲醛中，并包埋為蠟塊，制成4μm切片，放置70℃烤箱2 h后，二甲苯浸泡脫蠟1 h，進行梯度酒精逐級水化，即依次在100%、95%、90%、85%、75%酒精中放置5min，雙蒸水中放置30 min后置于pH6.0、0.01M枸櫞酸鈉溶液中高壓鍋煮沸3min進行抗原修復(fù)，滴加羊血清室溫孵育1h，滴加一抗工作液(PLAGL2 2 μg/mL，ASCL2稀釋比為1 ∶100)，4 ℃孵育過夜，PBS沖洗3次5min，二抗室溫孵育30 min，PBS沖洗3次5min，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，流水返藍15min，依次在75%、85%、90%、95%、無水乙醇中進行脫水，二甲苯透明干燥后封片。

根據(jù)陽性細胞所占比例和染色程度進行免疫組化評分：根據(jù)陽性細胞所占比例計分，陽性細胞為棕黃色細胞，無陽性細胞計0分，<25%計1分；25%～50%計2分；50～75%計3分；>75%計4分；根據(jù)染色程度計分：深棕黃色計3分，棕黃色計2分淺棕黃色計1分，無陽性著色計0分。二者之和>3分為陽性表達，≤3分為陰性表達。

4 隨訪 對患者術(shù)后1～60個月進行定時隨訪，由專業(yè)隨訪人員采用電話及門診的方式進行，患者死亡或者隨訪時間截止時結(jié)束隨訪。

三、統(tǒng)計學(xué)分析

結(jié) 果

一、 qRT-PCR檢測肺癌組織中PLAGL2 mRNA和ASCL2 mRNA的表達水平

qRT-PCR檢測PLAGL2 mRNA和ASCL2 mRNA在86例肺癌組織和癌旁組織中的表達情況。結(jié)果顯示：PLAGL2 mRNA在肺癌組織中的表達(1.63±0.88)顯著高于癌旁組織(1.08±0.70)(P<0.05)(圖1A)，ASCL2 mRNA在肺癌組織中的表達(2.28±1.34)顯著高于癌旁組織(0.99±0.56)(P<0.05)(圖1B)。

二、 PLAGL2和ASCL2在肺癌組織中表達的相關(guān)性

Spearman等級相關(guān)分析法分析PLAGL2與ASCL2在肺癌組織中表達相關(guān)性，結(jié)果顯示PLAGL2與ASCL2在肺癌組織表達呈正相關(guān)(rs=0.561，P=0.009﹚。(圖2)。

A：PLAGL2 mRNA在肺癌組織中的表達顯著上調(diào)；B：ASCL2 mRNA在肺癌組織中的表達顯著上調(diào)。

三、免疫組化檢測PLAGL2和ASCL2在肺癌組織中的表達情況

免疫組化檢測PLAGL2、ASCL2在肺癌組織中陽性表達分別為50(58.14%)、58(67.44%)例，在癌旁組織中陽性表達分別為30例(34.88%)、26例(30.23%)，PLAGL2在肺癌組織中的陽性表達顯著高于癌旁組織(χ2=9.348，P=0.002)、ASCL2在肺癌組織中的陽性表達顯著高于癌旁組織(χ2=23.827，P<0.001)。

四、肺癌組織中PLAGL2和ASCL2表達臨床意義

肺癌組織中PLAGL2的表達與患者的性別、年齡、組織類型、腫瘤大小及TNM分期均無關(guān)，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，而與組織學(xué)分級和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)(P<0.05)。肺癌組織中ASCL2的表達水平與患者的性別、年齡、組織類型及腫瘤大小均無關(guān)，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，而與TNM分期、組織學(xué)分級及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)(P<0.05)(見表1)。

五、肺癌組織中PLAGL2和ASCL2表達對患者預(yù)后的影響

對86例肺癌患者術(shù)后隨訪，研究PLAGL2和ASCL2表達對肺癌患者術(shù)后生存的影響，并按PLAGL2在肺癌組織中表達的染色程度和陽性細胞所占比例之和>5分為PLAGL2高表達組，≤5為分低表達組，ASCL2以同樣的方法分為ASCL2高表達組和ASCL2低表達組。進行Kaplan-Meier生存分析，結(jié)果顯示：PLAGL2高表達組患者的5年生存期明顯短于PLAGL2低表達組(χ2=18.72， P?0.001)；同樣，ASCL2高表達組患者的5年生存期也明顯短于ASCL2低表達組(χ2=9.79，P<0.001)(圖3)。

A:PLAGL2高表達組患者的5年生存期較短；B:ASCL2高表達組患者的5年生存期較短。

討 論

肺癌嚴重威脅人類生命和健康[1]。近年來，由于社會的發(fā)展，引起人們生活節(jié)奏的加快、工作壓力的增加、環(huán)境污染加重等不良因素，導(dǎo)致肺癌發(fā)病率增加及發(fā)病年齡的年輕化[13]。一方面肺癌發(fā)病率增加，另一方面肺癌早期癥狀不明顯，使得肺癌患者確診時往往已經(jīng)為晚期，而晚期患者由于發(fā)生轉(zhuǎn)移，致手術(shù)治療受限，放化療容易產(chǎn)生耐藥及抵抗，最終導(dǎo)致肺癌預(yù)后不容樂觀，是所有腫瘤相關(guān)死亡的主要原因[5,14]。然而，肺癌的發(fā)病機制尚未明確，研究報道促癌基因的激活和抑癌基因的失活是導(dǎo)致腫瘤發(fā)生、惡性進展的內(nèi)在根源，針對癌基因和抑癌基因的靶向治療對提高肺癌患者治療和降低死亡率具有重要意義。

人類基因組中廣泛存在鋅指蛋白編碼基因，鋅指蛋白在正常生理過程及病理過程中均具有重要的作用[15]。其中PLAG基因家族編碼的鋅指蛋白，在其N末端具有7個保守的C2H2鋅指結(jié)構(gòu)域，可以結(jié)合DNA激活特定基因的轉(zhuǎn)錄，參與調(diào)控靶基因的功能，涉及多種腫瘤的惡性增殖進展過程[16-17]。PLAG鋅指蛋白家族包括PLAGl、PLAGLl和PLAGL2，PLAGL2基因位于染色體20q11，屬于核蛋白轉(zhuǎn)錄因子，PLAGL2最初在小鼠細胞系中發(fā)現(xiàn)，人類PLAGL2基因高表達于胎兒期[18]。Landrette等[19]首先研究PLAGL2與惡性腫瘤的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)其過表達促進人類急性髓性白血病的發(fā)展，促使廣大學(xué)者在腫瘤領(lǐng)域?qū)LAGL2進行研究，越來越多的研究表明PLAGL2是腫瘤致癌基因，在結(jié)直腸癌中PLAGL2在癌組織中的表達高于癌旁組織，其3'-UTR可促進結(jié)腸癌發(fā)生并可作為結(jié)腸癌治療的新型潛在生物標志物[20]；在乳腺癌中，PLAGL2表達的降低抑制了乳腺癌細胞的增殖和轉(zhuǎn)移[21]。而Yang等[8]報道在小鼠肺中誘導(dǎo)PLAGL2表達的雄性小鼠比雌性小鼠更容易發(fā)生肺癌，進一步在公共肺癌基因表達譜數(shù)據(jù)庫分析發(fā)現(xiàn)在肺癌中具有PLAGL2高表達的患者更容易發(fā)現(xiàn)，且在疾病早期具有低PLAGL2表達的女性患者具有更好的預(yù)后。本實驗qRT-PCR和免疫組化檢測均發(fā)現(xiàn)PLAGL2在肺癌組織中的表達顯著高于癌旁組織，其高表達與組織學(xué)分級和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)，與瞿等[22]研究發(fā)現(xiàn)PLAGL2在前列腺癌組織中表達上調(diào)，且其高表達與包括腫瘤臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及包膜筋膜侵犯等在內(nèi)的不良病理參數(shù)顯著相關(guān)的結(jié)果具有相似性。同時本文Kaplan-Meier生存分析結(jié)果顯示PLAGL2高表達患者預(yù)后較差，提示PLAGL2促進肺癌的發(fā)生發(fā)展，可能為患者不良預(yù)后和肺癌治療的潛在指標。

ASCL2基因定位于染色體11p15.5，屬于ASCL基因家族(ASCL1-ASCL5)中的一員，該家族含有基本螺旋-環(huán)-螺旋(bHLH)結(jié)構(gòu)域的轉(zhuǎn)錄因子，ASCL2是Wnt信號通路的下游靶標并通過與E-box結(jié)合而啟動靶基因轉(zhuǎn)錄[23]。此外，ASCL2是腸隱窩基底柱細胞干性的主要調(diào)節(jié)因子，在胎盤的滋養(yǎng)層及大小腸的隱窩基底部表達豐富，而在其他正常組織中幾乎不表達，其高表達導(dǎo)致大腸腫瘤疾病的發(fā)生[24]。近年來研究發(fā)現(xiàn)ASCL2在其他腫瘤中同樣存在高表達，數(shù)據(jù)表明ASCL2的表達在原發(fā)性胃癌和胃轉(zhuǎn)移性腫瘤中表達均增高，ASCL2促進EMT的發(fā)生，促進胃癌的轉(zhuǎn)移[25]；ASCL2在骨肉瘤中表達升高，ASCL2陽性患者的總生存期和無轉(zhuǎn)移生存期顯著短于陰性表達患者，多變量Cox分析顯示ASCL2表達為預(yù)測不良總體存活率和無轉(zhuǎn)移生存率的獨立預(yù)后因素，且ASCL2表達促進骨肉瘤細胞增殖、遷移和侵襲[26]。Wang等[27]基于微陣列數(shù)據(jù)庫分析發(fā)現(xiàn)ASCL2在乳腺癌、結(jié)腸癌、胃癌、肺癌、頭頸癌和卵巢癌等腫瘤中表達較高。本實驗發(fā)現(xiàn)肺癌組織中ASCL2的表達顯著高于癌旁組織，其高表達與TNM分期、組織學(xué)分級及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)，Kaplan-Meier生存分析結(jié)果顯示ASCL2高表達者生存期較短，Hu等[12]研究發(fā)現(xiàn)與正常肺組織和肺腺癌相比，ASCL2在肺鱗癌中的表達增加，ASCL2高表達與TNM分期、肺鱗癌低分化和預(yù)后不良相關(guān)，與本文研究具有一致性，但是本文研究顯示ASCL2在肺腺癌和肺鱗癌的表達沒有差異，可能是由于樣本數(shù)量及質(zhì)量的原因?？傊甈LAGL2高表達可能參與并促進了肺癌的發(fā)生發(fā)展，可用于肺癌治療和預(yù)后不良的新型生物標志物。

Wnt信號通路是調(diào)控肺癌惡性生物學(xué)行為的經(jīng)典信號通路之一[11]。在結(jié)腸癌中PLAGL2通過激活wnt6a促進細胞增殖，還可以通過激活細胞核中Wnt信號通路重要組分β-catenin誘導(dǎo)EMT的發(fā)生促進細胞增殖[6]，而ASCL2是Wnt信號通路的重要靶基因，PLAGL2在腸上皮干細胞中可以直接增強ASCL2的表達[24]。PLAGL2和ASCL2是否發(fā)揮共同促進肺癌的發(fā)生發(fā)展，本研究結(jié)果顯示PLAGL2和ASCL2在肺癌組織中的表達成正相關(guān)，表明兩者可能具有協(xié)同關(guān)系，但是PLAGL2及ASCL2在肺癌中發(fā)揮作用的分子機制目前還不清楚，還需在體外及體內(nèi)實驗中進一步研究以得到更可靠的結(jié)論。

綜上所述，PLAGL2及ASCL2在肺癌組織中均表達上調(diào)，并與肺癌患者預(yù)后差有關(guān)。PLAGL2和ASCL2在肺癌中的表達呈正相關(guān)性，可能具有協(xié)同作用， PLAGL2及ASCL2可能為肺癌患者預(yù)測預(yù)后及治療的潛在基因靶點。