雷 龑，謝 倩，陳 婷，劉鑫銘，陳清西

（1. 福建農(nóng)林大學園藝學院，福建 福州 350002；2. 福建省農(nóng)業(yè)科學院果樹研究所，福建 福州 350013）

0 引言

【研究意義】國際葡萄與葡萄酒組織（OIV,www.oiv.int）2018年的數(shù)據(jù)表明，我國是世界第二大葡萄種植國，同時也是世界第一大鮮食葡萄消費國和第五大葡萄酒消費國[1]。但葡萄在栽培生產(chǎn)過程中會受到各種真菌病害的侵染，嚴重制約了葡萄產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。其中，葡萄炭疽病（Grape ripe rot），是葡萄露地栽培過程中危害葡萄果實的主要真菌病害之一[2]。構(gòu)建葡萄炭疽菌侵染后的葡萄果皮酵母cDNA文庫，可為篩選葡萄炭疽病侵染過程中的互作蛋白提供材料基礎(chǔ)。【前人研究進展】葡萄炭疽病主要為害近成熟的果實，嚴重時病穗率可達50%～70%，葡萄產(chǎn)量及品質(zhì)都受到嚴重影響[3,4]。近十年的研究主要集中在葡萄炭疽病病原菌的分類鑒定和遺傳多樣性等方面。先前的研究認為膠孢炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides）是葡萄炭疽病的唯一病原菌，隨著對葡萄炭疽病研究的增多，學者們發(fā)現(xiàn)葡萄炭疽病在中國的病原菌主要是C. viniferum。Yan等通過采集北京、河北、山西、山東等地的感染炭疽病的釀酒葡萄病果，分離了34個炭疽菌株系，其中27個屬于C. viniferum，且屬于C. viniferum的株系表現(xiàn)出更高的致病力[5]；Lei等采集了貴州及福建的62個病原菌樣品，分離出50個炭疽菌株，其中48個菌株屬于C. viniferum[6]。研究人員發(fā)現(xiàn)C.viniferum也是引起韓國葡萄炭疽病的病原菌[7]。我國具有豐富的野生葡萄資源，其中刺葡萄（Vitis davidii F?ex）是抗葡萄炭疽病的重要種質(zhì)資源。王躍進等[8]對中國野生刺葡萄寧-5、寧-6、濟南-1、洛陽-4、塘尾、雪峰、福建-4等葡萄株系進行了抗炭疽病鑒定，結(jié)果表明刺葡萄對炭疽病有極強的抗性，并獲得了刺葡萄抗炭疽病基因的分子標記OPC15-1300。因此，利用刺葡萄抗病性強的特點，從中挖掘出相關(guān)的抗炭疽病基因，對于減輕葡萄炭疽病的發(fā)生、開展葡萄抗病品種選育具有十分重要的意義?！颈狙芯壳腥朦c】先前的研究主要集中于葡萄炭疽菌的分類鑒定，但關(guān)于葡萄抗炭疽病的分子機理還鮮有報道。目前，尚未見到關(guān)于葡萄炭疽菌侵染后的葡萄果皮酵母cDNA文庫的報道。【擬解決的關(guān)鍵問題】本研究采用SMART體系構(gòu)建葡萄炭疽菌侵染后的葡萄果皮酵母cDNA文庫，以期為篩選葡萄炭疽病侵染過程中的互作蛋白提供材料基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

前期的研究中獲得了葡萄炭疽菌菌株C. viniferum（FJ017）[6]：2015年7月，從福建省福安市溪柄鎮(zhèn)葡萄種植園中，采集巨峰葡萄（V. vinifera × V.labrusca，Kyoho）上自然發(fā)病、具有典型炭疽病癥狀的果實樣品；在室內(nèi)參照方中達[9]的方法挑取炭疽菌單孢子分離菌株，25 ℃培養(yǎng)在PDA培養(yǎng)基上，經(jīng)過3次單孢純化培養(yǎng)后得到純化菌株。

以福建省福安市穆云鄉(xiāng)溪塔村的刺葡萄福安（V.davidii accession，F(xiàn)u'an）果實為試驗材料。隨機選取生長良好的9株刺葡萄（每3株為1個生物學重復），每個重復采集成熟度一致的葡萄果實42粒（每株14粒），將果實用70%的酒精表面消毒1 min后通過針刺法接種炭疽菌C. viniferum[6,10]，收集接種后0、1、3、7 d的果皮，液氮冷凍，儲存于?80 ℃冰箱，用于進一步分析。

1.2 主要試劑

文庫構(gòu)建試劑盒：SMART cDNA Library Construction Kit（Clontech Code No.634901）、文庫檢測試劑盒：Advantage 2 PCR Kit（Clontech Code No.639206）、文庫純化試劑盒：TaKaRa MiniBEST DNA Fragment Purification Kit（TaKaRa Code No.9761）、酵母雙雜交試劑盒：Matchmaker Gold Yeast Two-Hybrid System（Clontech Code No.630489）、酵母轉(zhuǎn)化試劑盒：YeastmakerTMYeast Transformation System 2（Clontech Code No.630439）、文庫質(zhì)粒提取試劑盒：NucleoBond Xtra Midi EF（MN Code No.U0420B）、DNA連接酶試劑盒：DNA ligation Kit（TaKaRa Code No.6022）、純化柱：CHROMA SPIN-1000-TE（Clontech Code No.636079）、一缺液體培養(yǎng)基：SD/-Trp with Broth（Clontech Code No.630308）、YPDA培養(yǎng)基（Clontech Code No.630306）、一缺固體培養(yǎng)基：SD/-Trp with Agar（Clontech Code No.630309）、二 缺 固 體 培 養(yǎng)基：SD/-Leu/-Trp with Agar（Clontech Code No.630317）、四缺固體培養(yǎng)基：SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp with Agar（Clontech Code No.630323）、金擔子素A：Aureobasidin A（Clontech Code No.630499）、X-α-Gal（Clontech Code No.630462）。

1.3 酵母雙雜交文庫的構(gòu)建

1.3.1 RNA質(zhì)量檢測 對刺葡萄刺傷接種葡萄炭疽病菌，于1、3、7 d取樣，取等量樣品，液氮研磨后混合成一個總樣品，用氯化鋰沉淀法提取RNA，用NanoDrop測量分析總RNA的質(zhì)量。RNA的完整性使用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.3.2 cDNA合成 使用SMART cDNA Library Construction Kit和 Advantage 2 PCR Kit，參照說明書，將3個不同時期提取的RNA等量混合，取1 μg合成cDNA。cDNA的合成效果采用1.5%瓊脂糖凝膠電泳對5 μL cDNA進行檢測。

1.3.3 酶切與短片段去除 使用TaKaRa MiniBEST DNA Fragment Purification Kit對上述獲得的cDNA 進行純化，最終溶解于ddH2O中。將溶解產(chǎn)物用SfiI進行酶切處理。使用CHROMA SPIN-1000-TE對酶切后cDNA過柱析出，去除短片段，經(jīng)PCI/CI凈化處理后，乙醇洗滌，ddH2O溶出。

1.3.4 載體連接與庫容檢測 上述過柱后的cDNA，與pGADT7-SfiI三框載體，參照DNA ligation Kit說明書按比例混合，12 ℃，O/N連接。連接完畢后，進行連接產(chǎn)物純化，得到初級cDNA文庫。取少量初級文庫連接產(chǎn)物，電轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)入感受態(tài)細胞HST08；涂布在Amp抗性LB平板，37 ℃過夜培養(yǎng)；統(tǒng)計平板上菌落數(shù)，推算初級文庫庫容。

1.3.5 文庫質(zhì)粒提取 根據(jù)庫容檢測數(shù)據(jù)，3種讀碼框各取50萬克隆的量，電轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細胞 HST08中，涂布于10個24.5×24.5 cm LB平板，37 ℃過夜培養(yǎng)。檢測轉(zhuǎn)化獲得的擴增克隆數(shù)目。回收擴增菌落，采用NucleoBond Xtra Midi EF試劑盒進行文庫質(zhì)粒提取。

1.3.6 酵母感受態(tài)細胞制備 將Y2HGold菌株在YPDA固體培養(yǎng)基上劃線，30 ℃條件下培養(yǎng)，長出單菌落后，挑選直徑為2～3 mm的菌落于YPDA液體培養(yǎng)基中，30 ℃、180 r·min?1培養(yǎng)12 h。吸取5 μL培養(yǎng)后的菌液于YPDA液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，直至OD600為0.15～0.30后，700 g離心5 min，加入100 mL YPDA液體培養(yǎng)基重懸菌體，同樣條件下培養(yǎng)至OD600為0.40～0.50。室溫下將活化的菌液700 g離心5 min，棄上清液，加入30 mL無菌蒸餾水重懸，700 g離心5 min，棄上清液，重復一次，加入1.1×TE/LiAc 1.5 mL進行重懸，瞬時離心15 s，棄去上清液，最后加入600 μL 1.1×TE/LiAc輕彈混勻后待用。

1.4 Y187酵母文庫制作

將文庫質(zhì)粒（20 μg）轉(zhuǎn)入Y187酵母菌株中，將轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂布于100個SD/-Leu平板，30 ℃條件下培養(yǎng)3 d。使用含25%甘油的Freezing Medium刮取菌落，收集菌液50 mL即為酵母文庫。

2 結(jié)果與分析

2.1 RNA質(zhì)量檢測

在刺葡萄接種葡萄炭疽病菌的第1、3、7 d分別取樣，液氮研磨后混合成一個總樣品，提取總RNA。用NanoDrop 測量分析總RNA的質(zhì)量見表1。取300 ng RNA進行1.5%瓊脂糖凝膠電泳，如圖1所示，通道1、2、3條帶均明晰，表明RNA質(zhì)量良好，可用于下一步試驗。

表 1 總RNA質(zhì)量分析Table 1 Quality of total RNA

圖 1 刺葡萄接種炭疽病菌后的RNA電泳檢測Fig. 1 RNA extracted from V. davidii pericarps infected by C.viniferum

2.2 酵母cDNA文庫構(gòu)建

以炭疽病菌侵染后的刺葡萄果皮RNA為模板，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，使用試劑盒將cDNA純化，隨后將純化產(chǎn)物（雙鏈cDNA）酶切處理及短片段去除，獲得質(zhì)量良好的cDNA（圖2、3）。將其克隆至 pGADT7三框質(zhì)粒載體，經(jīng)純化精制，獲得初級cDNA文庫。通過Amp抗性LB平板上生長的細胞菌落數(shù)，推算初級文庫庫容。結(jié)果表明，初級文庫庫容約為5.2×106cfu，讀碼框1文庫約1.5×106cfu，讀碼框2文庫約2.2×106cfu，讀碼框3文庫約1.5×106cfu，重組率約為97.92%，插入的片段長度主要分布在 400～2 000 bp，具有良好的多態(tài)性（圖4）。對初級cDNA文庫擴增后，取100 ng擴增文庫質(zhì)粒進行1.5%瓊脂糖凝膠電泳，條帶單一且明顯（圖5）。將上述提取成功的文庫質(zhì)粒，取20 μg轉(zhuǎn)化到Y(jié)187酵母菌中，制作擴增的酵母文庫。酵母cDNA文庫菌液稀釋后，涂布在SD/-Leu平板上30 ℃條件下培養(yǎng)3 d。文庫滴度（cfu·mL?1）=培養(yǎng)基上克隆數(shù)×稀釋倍數(shù)/涂板體積，依此計算，獲得的Y187酵母文庫滴度約為6.0×107cfu·mL?1（圖6），可用于后續(xù)的互作蛋白篩選。

圖 2 cDNA合成檢測Fig. 2 Detection of cDNA

圖 3 純化后cDNA檢測Fig. 3 Examination on purified cDNA

圖 4 酵母cDNA文庫插入片段檢測Fig. 4 Detection of inserted fragments in yeast cDNA library

圖 5 擴增文庫質(zhì)粒Fig. 5 Amplified plasmid library

圖 6 酵母cDNA文庫菌液在SD/-Leu平板上的菌落生長情況Fig. 6 Clones of yeast cDNA library on SD/-Leu plate

3 討論與結(jié)論

炭疽病是影響南方葡萄產(chǎn)業(yè)的重要病害，刺葡萄是高抗炭疽病的重要野生葡萄資源，深入挖掘刺葡萄抗炭疽病相關(guān)基因，研究其參與炭疽病脅迫響應(yīng)的抗病機制，對定向改良葡萄抗病性具有重要意義。酵母雙雜交是Fields and Song[11]提出驗證2個蛋白互作的經(jīng)典方法，關(guān)于葡萄炭疽病侵染下的葡萄果皮酵母cDNA文庫至今未見報道。前期的研究中，本課題組獲得了炭疽菌菌株（FJ017），以葡萄炭疽病侵染下的刺葡萄福安果皮為材料，提取葡萄炭疽菌侵染后1、3、7 d的葡萄果皮總RNA，采用SMART 技術(shù)構(gòu)建了cDNA 文庫，并對文庫進行了鑒定。

對于感染炭疽病的刺葡萄果皮，采用氯化鋰沉淀的方法可以較好地提取到高質(zhì)量的RNA。刺葡萄果皮含有大量的多酚和多糖物質(zhì)，RNA提取較為困難，但高質(zhì)量的RNA是構(gòu)建酵母cDNA文庫的前提條件[12,13]。本研究中采用氯化鋰沉淀的方法，提取到的刺葡萄RNA，28S和18S沒有明顯的降解，且沒有多糖、蛋白質(zhì)等雜質(zhì)的污染，因此可以用于后續(xù)的酵母cDNA文庫的構(gòu)建。

SMART的方法適用于炭疽菌侵染下的葡萄果皮酵母cDNA文庫構(gòu)建。目前，構(gòu)建酵母雙雜交cDNA文庫的方法主要有SMART的方法和Gateway的方法[14]。相較于Gateway的方法，SMART的方法更為經(jīng)典，技術(shù)更加成熟，其對建庫所用的RNA起始使用量較少，因為后續(xù)的使用中不再對RNA中的多糖、DNA、蛋白質(zhì)等物質(zhì)進行分離，因而對建庫所用RNA質(zhì)量要求較高。本研究中，由于刺葡萄果皮RNA較難提取，故而采用了SMART的方法，盡可能提取高質(zhì)量的RNA以保證后續(xù)建庫的質(zhì)量。本研究中以獲得的高質(zhì)量RNA為材料，采用SMART的方法成功構(gòu)建了炭疽菌侵染下的葡萄果皮酵母cDNA文庫，較好地發(fā)揮了SMART方法的優(yōu)勢，也為今后構(gòu)建類似的酵母cDNA文庫提供參考依據(jù)。

文庫建成后需要進行評價，評價的標準主要是文庫的庫容，對于Clontech公司的SMART文庫構(gòu)建標準來說，文庫容量應(yīng)至少達到1×106cfu[15]，而本研究中的文庫庫容量達到了5.2×106cfu，滿足了建庫要求。另一個標準是cDNA序列的完整性，SMART的方法要求重組率大于85%且插入片段的大小應(yīng)當在200 bp以上[13,14]，本研究中所建文庫重組率為97.92%，插入的片段長度主要分布在 400～2 000 bp，且多態(tài)性較高，說明所建文庫合格，為后續(xù)篩選葡萄炭疽病侵染過程中的互作蛋白奠定基礎(chǔ)。