賈鵬莉，沈 碩，胡英杰

（青海大學(xué)/青海省農(nóng)林科學(xué)院/青海省馬鈴薯育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/青藏高原生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，青海 西寧 810016）

0 引言

【研究意義】馬鈴薯是全球第四大重要的糧食作物，在貯藏過(guò)程中，馬鈴薯容易被多種病害所侵襲[1]。其中，馬鈴薯干腐病是馬鈴薯貯藏期主要的真菌性病害之一，由多種鐮刀菌（Fusarium spp.）引起[2]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，每年由馬鈴薯干腐病造成的馬鈴薯貯藏期產(chǎn)量損失一般為6%～25%，最高可達(dá)60%[3?5]。生產(chǎn)中對(duì)這種病害的防治以化學(xué)防治手段為主，常用的藥劑有苯醚甲環(huán)唑·嘧菌酯、霜脲·錳鋅、戊唑醇等，但長(zhǎng)期使用化學(xué)藥劑防治，造成菌株抗藥性、環(huán)境污染和農(nóng)藥殘留等嚴(yán)重問(wèn)題[6?8]。生物防治具有安全無(wú)毒、不污染環(huán)境和不易產(chǎn)生抗藥性等優(yōu)點(diǎn)[9?10]。因此，利用微生物等天然資源及其產(chǎn)生的天然產(chǎn)物對(duì)馬鈴薯干腐病進(jìn)行生物防治具有重要的意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】已報(bào)道的可對(duì)馬鈴薯干腐病進(jìn)行生物防治的生防菌有芽孢桿菌（Bacillus spp.）[11?12]、放線菌（Actinomyces spp.）[13?14]和木霉菌（Trichoderma spp.）[15]等生防菌株，以及寡雄蛋白（Oligandrin）[16]和藍(lán)桉精油[17]等活性物質(zhì)。白酒糟醅是以谷物為原材料經(jīng)發(fā)酵、蒸餾、提取酒精等加工過(guò)程后所殘余的廢渣物料。近年來(lái)，白酒糟醅多應(yīng)用于食品[18]、飼料[19]及抗癌[20]等方面的研究。已有研究顯示，青稞白酒糟醅在抑草、抑菌和抗病毒等方面具有生物活性[21?22]。【本研究切入點(diǎn)】目前，有關(guān)生防細(xì)菌抑制植物病原真菌的報(bào)道越來(lái)越多，但有關(guān)生防細(xì)菌抑制馬鈴薯干腐病病原菌活性方面的報(bào)道還很少，本課題組前期發(fā)現(xiàn)1株分離自青稞白酒糟醅的菌株JZ2-1-12對(duì)馬鈴薯干腐病病原菌具有抑制活性[23]?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】在前期研究的基礎(chǔ)上，對(duì)9株分離自青稞白酒糟醅的菌株進(jìn)行抑菌活性篩選，采用形態(tài)學(xué)、生理生化特征及分子生物學(xué)方法對(duì)活性菌株進(jìn)行鑒定，并研究活性菌株發(fā)酵液分泌抑菌物質(zhì)的能力及其萃取物的抑菌活性和穩(wěn)定性，以期為微生物來(lái)源的馬鈴薯干腐病生防菌劑及保鮮制劑的開(kāi)發(fā)提供新的理論依據(jù)和技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 菌 株 供 試 菌 株JZ3-4-7、JZ2-1-6、JZ3-1-4、JZ3-1-10、JZ3-2-2、JZ3-1-23、JZ3-5-1、JZ3-1-14和JZ3-1-15分離自青稞白酒糟醅。馬鈴薯干腐病病原真菌青9B-4-6（Fusarium solani）、青9D-2-6（Fusarium oxysporum）、 65C-4-3（Fusarium sambucinum var.intermedium）和 65D-5-2（Fusarium acuminatum）分離自馬鈴薯薯塊病樣，均純化并保存至青海省農(nóng)林科學(xué)院生物技術(shù)研究所微生物實(shí)驗(yàn)室4 ℃冰箱。

1.1.2 培養(yǎng)基 牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基[24]，PDA培養(yǎng)基[25]，淀粉培養(yǎng)基[26]，酪蛋白培養(yǎng)基[26]，葡聚糖酶培養(yǎng)基[27]，羧甲基纖維素培養(yǎng)基[28]。

1.1.3 主要儀器 電子天平（梅特勒-托利多儀器有限公司）、高壓蒸汽滅菌鍋（華粵企業(yè)集團(tuán)有限公司）、電熱恒溫干燥箱（上海齊欣科學(xué)儀器有限公司）、生化培養(yǎng)箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）、全溫?fù)u瓶柜（常州金壇精達(dá)儀器制造有限公司）。

1.2 菌株活化

將分離自青稞白酒糟醅的菌株從4 ℃冰箱取出，劃線接種于牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基平板上，接種完畢的平板放于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)48 h，備用。

1.3 活性菌株的篩選及穩(wěn)定性評(píng)價(jià)

采用平板對(duì)峙法[12]，測(cè)定9株分離自青稞白酒糟醅的菌株對(duì)4株馬鈴薯干腐病病原真菌的抑菌活性。計(jì)算公式如下：

抑菌率= [（對(duì)照菌落直徑?處理菌落直徑）/對(duì)照菌落直徑]×100%

為了確定活性菌株的穩(wěn)定性，將初篩得到的有抑菌活性的菌株進(jìn)行穩(wěn)定性評(píng)價(jià)，方法同上。分別將供試拮抗菌和病原真菌對(duì)峙培養(yǎng)7 d和14 d后，測(cè)量抑菌帶寬度，計(jì)算14 d時(shí)抑菌帶寬度縮小率（VF），比較各活性菌株的抑制穩(wěn)定性。穩(wěn)定評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)[29]：“--”：VF≥70%，不穩(wěn)定；“?”：50%≤VF＜70%，較不穩(wěn)定；“+”：20%≤VF＜50%，較穩(wěn)定；“++”：VF＜20%，穩(wěn)定。計(jì)算公式如下：

VF=[（7 d抑菌帶寬度值?14 d抑菌帶寬度值）/7 d抑菌寬帶值]×100%

1.4 活性菌株的鑒定

1.4.1 活性菌株的形態(tài)學(xué)鑒定 將活化后的活性菌株接種于NA培養(yǎng)基上，觀察其生長(zhǎng)的菌落形態(tài)特征，包括形狀、光澤、隆起形狀、透明度、邊緣等，以及菌體形態(tài)特征（包括革蘭氏染色、芽孢形態(tài)），根據(jù)《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)》[30]和《常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》[31]對(duì)菌株進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定。

1.4.2 活性菌株的生理生化特征 根據(jù)《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)》[30]和《常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》[31]對(duì)活性菌株進(jìn)行葡萄糖氧化發(fā)酵，檸檬酸鹽利用試驗(yàn)，接觸酶，糖、醇類發(fā)酵，石蕊牛奶測(cè)試，明膠液化，甲基紅（M.R），硝酸鹽還原，V-P測(cè)定，O-硝基苯-β-D吡喃半乳糖苷酶（ONPG）測(cè)定等試驗(yàn)。

1.4.3 活 性 菌 株 的 分 子 生 物 學(xué) 鑒 定 活 性 菌 株DNA提取根據(jù)上海生工生物工程（上海）股份有限公司的柱式細(xì)菌DNA提取試劑盒的程序操作。選擇通用的細(xì)菌16S rDNA引物F27（5′-AGAGTTTGAT CCTGGCTCA GG-3′）和P1541（5′-AAGGAGGTG GTGATCCAGCCG CA-3′）。PCR擴(kuò)增體系為：10×Buffer 2.5 μL，dNTP（10 mmol·L-1）2 μL，模板DNA 1 μL，引 物 各1 μL，Taq DNA聚 合 酶0.2 μL，水補(bǔ)足至25 μL。PCR反應(yīng)條件如下：94 ℃ 5 min；變性94 ℃ 40 s，退火55 ℃ 45 s，延伸72 ℃ 80 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。反應(yīng)結(jié)束后，取5 μL PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，回收產(chǎn)物送至上海生工生物工程公司測(cè)序。將得到的16S r DNA序列在網(wǎng)站https://www.ezbio cloud.net/上進(jìn)行序列對(duì)比，用MEGA 7.0軟件，采用Neighbor-Joining方法（Bootstrap值為1 000次），繪制系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)[32]。

1.5 活性菌株發(fā)酵液的制備及菌株生防因子分析

將篩選到的活性菌株接種到裝瓶量為400 mL的牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中，置于37 ℃、180 r·min?1恒溫?fù)u瓶柜中振蕩培養(yǎng)5～7 d，收獲發(fā)酵液，然后將其經(jīng)布氏漏斗減壓過(guò)濾去除菌體，得到去菌體發(fā)酵液，備用。

采用平板透明圈法[33]，分別在淀粉培養(yǎng)基、酪蛋白培養(yǎng)基、葡聚糖酶培養(yǎng)基、羧甲基纖維素培養(yǎng)基上打3孔（直徑6 mm），每孔加活性菌株發(fā)酵液100 μL，3次重復(fù)。以只加NA液體培養(yǎng)基為對(duì)照組。30 ℃培養(yǎng)48～72 h，向淀粉酶培養(yǎng)基中加入2 mL的碘液，將碘液均勻覆蓋平板，靜置10 min，觀察平板上出現(xiàn)透明圈情況。同時(shí)觀察酪蛋白酶培養(yǎng)基、葡聚糖酶培養(yǎng)基和羧甲基纖維素培養(yǎng)基出現(xiàn)透明圈的情況。

采用排油圈法[34]，取適量橄欖油加入蘇丹Ⅲ染色劑混勻，向培養(yǎng)皿（直徑9 cm）中加入60 mL純水及緩慢加入染色的橄欖油，水面形成一層油膜，向培養(yǎng)皿油膜中心持續(xù)滴加活性菌株發(fā)酵液，觀察是否形成排油圈。以只滴加NA液體培養(yǎng)基為對(duì)照組。檢測(cè)活性菌株發(fā)酵液是否有脂肽類物質(zhì)生成。

1.6 活性菌株發(fā)酵液萃取物的制備及其抑菌活性測(cè)定

取去菌體發(fā)酵液600 mL置于3 000 mL的分液漏斗中，依次用等體積的氯仿、乙酸乙酯和正丁醇對(duì)發(fā)酵液依次進(jìn)行等體積萃取，萃取液經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)得萃取物；將萃取物預(yù)溶于二甲基亞砜（≤0.1%），并用無(wú)菌水分別配成質(zhì)量濃度為1.25、2.50、5.00、10.00和20.00 mg·mL?1的萃取物溶液，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜抽濾3次，以等體積的二甲亞砜（≤0.1%）溶液作為空白對(duì)照，重復(fù)3次。采用牛津杯法[35]，測(cè)定發(fā)酵液有機(jī)溶劑萃取物的抑菌活性。計(jì)算公式如下：

抑制率=[（對(duì)照菌落直徑-處理菌落直徑）/對(duì)照菌落直徑] × 100%

根據(jù)張志祥等[36]的方法，用毒力回歸方程求得活性菌株萃取物對(duì)馬鈴薯干腐病病原真菌的抑菌中濃度（EC50）。

1.7 菌株發(fā)酵液提取物的穩(wěn)定性測(cè)定

選取20 mg·mL?1的正丁醇萃取物溶液作為研究對(duì)象，以馬鈴薯干腐病病原菌青9D-2-6作為指示菌，采用牛津杯法分別檢測(cè)正丁醇萃取物溶液對(duì)病原菌青9D-2-6抑菌活性的穩(wěn)定性[37]，重復(fù)3次。

1.7.1 熱穩(wěn)定性 將質(zhì)量濃度為20 mg·mL?1的正丁醇萃取物溶液分別進(jìn)行40 、60、80、100 ℃水浴處理及121 ℃高壓蒸汽滅菌鍋處理60 min，以未加熱處理的溶液作為對(duì)照。

1.7.2 酸堿穩(wěn)定性 將質(zhì)量濃度為20 mg·mL?1的正丁醇萃取物溶液分別用濃度為1 mol·L?1的鹽酸和1 mol·L?1的氫氧化鈉分別調(diào)節(jié)pH值為5、6、7、8、9，以未調(diào)節(jié)pH值的溶液作為對(duì)照。

1.7.3 紫外穩(wěn)定性 將質(zhì)量濃度為20 mg·mL?1的正丁醇萃取物溶液置于254 nm的紫外燈下20 cm處分別照射1、3、5、7、9 h，以未經(jīng)紫外照射處理的溶液作為對(duì)照。

1.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

采用IBM SPSS Statistics 24.0進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。采用Duncan氏新復(fù)極差法進(jìn)行差異顯著性（a=0.05）檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 抑制馬鈴薯干腐病病原真菌活性菌株的篩選

采用平板對(duì)峙法，對(duì)9株分離自青稞白酒糟醅的菌株（JZ3-5-1、JZ3-1-15、JZ3-1-14、JZ3-1-10、JZ3-1-4、JZ2-1-6、JZ3-4-7、JZ3-2-2、JZ3-1-23）分別進(jìn)行抑制馬鈴薯干腐病菌（青9D-2-6、65D-5-2、青9B-4-6、65C-4-3）活性測(cè)定。由表1可得，供試的9個(gè)菌株中，JZ3-5-1、JZ3-1-14、JZ3-1-10、JZ3-1-4、JZ2-1-6、JZ3-2-2和JZ3-1-23對(duì)病原真菌幾乎無(wú)抑菌作用，JZ3-1-15和JZ3-4-7對(duì)病原真菌具有中等的抑菌作用，其中JZ3-1-15對(duì)病原真菌青9D-2-6的抑制率為57.24%，對(duì)青9B-4-6的抑制率為51.92%，對(duì)65C-4-3的抑制率為50.18%，對(duì)65D-5-2的抑制率為49.83%（表1）。由上述結(jié)果可知，供試菌株中，JZ3-1-15對(duì)病原真菌青9D-2-6的抑菌活性最高。

表 1 分離自青稞白酒糟醅的菌株抑制馬鈴薯干腐病病原真菌的活性Table 1 Inhibitory activity of strains from distiller's grain against pathogens of potato dry rot

2.2 活性菌株的穩(wěn)定性評(píng)價(jià)

對(duì)菌株JZ3-1-15和JZ3-4-7進(jìn)行抑菌活性的穩(wěn)定性評(píng)價(jià)。由表2可知，JZ3-1-15對(duì)病原菌的抑菌帶縮小率為0.78%，根據(jù)1.3評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，穩(wěn)定性為“++”；JZ3-4-7對(duì)病原菌的抑制活性的抑菌帶縮小率25.75%，根據(jù)1.3評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，穩(wěn)定性為“+”；兩者穩(wěn)定性差異顯著（P＜0.05）?？梢?jiàn)，菌株JZ3-1-15對(duì)病原菌的抑菌作用最穩(wěn)定。

表 2 供試菌株對(duì)馬鈴薯干腐病病原真菌抑菌活性的穩(wěn)定性Table 2 Stability of antimicrobial activity of strains from distiller's grains against pathogens of potato dry rot

2.3 活性菌株的鑒定

2.3.1 形態(tài)學(xué)鑒定 如圖1所示，菌株JZ3-1-15在NA培養(yǎng)基上培養(yǎng)24 h后呈乳白色，單菌落形態(tài)呈圓形或橢圓形，邊緣整齊，不透明，表面光滑、濕潤(rùn)，明顯向上突起，黏液狀；培養(yǎng)72 h后表面出現(xiàn)褶皺，邊緣不規(guī)則，呈霧狀散開(kāi)；革蘭氏染色后鏡檢呈藍(lán)紫色、桿狀，表明該菌株為陽(yáng)性菌。

2.3.2 生理生化鑒定 由表3可知，菌株JZ3-1-15可使明膠液化，石蕊牛乳凝固，可利用蔗糖、甘露醇及麥芽糖，有氧或無(wú)氧分子均參與分解葡萄糖，可以產(chǎn)生ONPG，硝酸鹽還原、接觸酶試驗(yàn)均呈陽(yáng)性。而不能利用檸檬酸，甲基紅、V-P試驗(yàn)均呈陰性。

2.3.3 分子生物學(xué)鑒定 將菌株JZ3-1-15測(cè)序得到的16S rDNA序列提交至網(wǎng)址https://www.ezbiocloud.net/上與數(shù)據(jù)庫(kù)中已知的16S rDNA序列進(jìn)行比較，并下載與菌株JZ3-1-15的16S rDNA序列同源性大于95%的序列，使用Mega（7. 0）軟件，根據(jù)Neighbor-Joining方法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)（圖2）。鑒定結(jié)果表明，菌株JZ3-1-15與菌株貝萊斯芽孢桿菌（Bacillus velezensis）聚類同一分支，親緣關(guān)系最近，相似度高達(dá)99.78%。結(jié)合JZ3-1-15的形態(tài)特征、生理生化特征和16S rDNA序列分析結(jié)果，最終將JZ3-1-15鑒定為貝萊斯芽孢桿菌（Bacillus velezensis），Genbank登錄號(hào)為MT682887。

圖 1 菌株JZ3-1-15的培養(yǎng)性狀及革蘭氏染色特征Fig. 1 Culture and gram-staining characteristics of JZ3-1-15

2.4 活性菌株生防因子分析

采用透明圈法，測(cè)定菌株JZ3-1-15發(fā)酵液的產(chǎn)酶能力。如圖3所示，菌株JZ3-1-15發(fā)酵液在酪蛋白培養(yǎng)基（圖3A）、淀粉培養(yǎng)基（圖3B）和羧甲基纖維素培養(yǎng)基（圖3C）上均有明顯酶解圈產(chǎn)生，且在酪蛋白培養(yǎng)基和淀粉培養(yǎng)基上酶解圈邊緣界限清晰，酪蛋白培養(yǎng)基上的酶解圈明顯較大，羧甲基纖維素培養(yǎng)基上酶解圈邊緣界限模糊，說(shuō)明JZ3-1-15發(fā)酵液產(chǎn)蛋白酶較多，淀粉酶次之。如圖3D所示，在葡聚糖培養(yǎng)基上未有透明圈產(chǎn)生，說(shuō)明JZ3-1-15發(fā)酵液不具有產(chǎn)葡聚糖酶的能力。

采用排油圈法，測(cè)定JZ3-1-15發(fā)酵液是否具有產(chǎn)生表面活性功能的脂肽類物質(zhì)的能力。如圖3E所示，有明顯的排油圈產(chǎn)生，說(shuō)明菌株JZ3-1-15發(fā)酵液具有產(chǎn)脂肽類物質(zhì)的能力。

表 3 菌株JZ3-1-15的生理生化特征Table 3 Physiological and biochemical characteristics of JZ3-1-15

圖 2 基于16S rDNA序列構(gòu)建的菌株JZ3-1-15系統(tǒng)發(fā)育分析Fig. 2 Phylogenic analysis on JZ3-1-15 based on 16S rDNA sequence

圖 3 菌株JZ3-1-15發(fā)酵液生防因子分析Fig. 3 Biocontrol factors of JZ3-1-15 fermentation broth

2.5 活性菌株發(fā)酵液萃取物的抑菌活性

通過(guò)牛津杯法，測(cè)定活性菌株JZ3-1-15的發(fā)酵液萃取物對(duì)病原真菌青9D-2-6的抑菌活性及EC50。由表4可知，當(dāng)乙酸乙酯、氯仿和正丁醇萃取溶液質(zhì)量濃度為20 mg·mL?1時(shí)對(duì)病原真菌的抑菌活性最高，抑制率分別為62.67%、67.52%和80.07%。當(dāng)氯仿和正丁醇萃取物溶液質(zhì)量濃度為10 mg·mL?1時(shí)，對(duì)病原真菌仍具有較高的抑菌活性，抑制率分別為52.42%和61.41%。由顯著性分析結(jié)果可知，當(dāng)乙酸乙酯、氯仿和正丁醇萃取溶液質(zhì)量濃度為20 mg·mL?1時(shí) 與1.25、2.5、5、10 mg·mL?1時(shí) 差 異 顯 著（P＜0.05）。由毒力回歸方程可知：乙酸乙酯、氯仿和正丁醇萃取物溶液對(duì)病原真菌青9D-2-6抑制活性的EC50分別為14.06、8.88和5.18 mg·mL?1?？梢?jiàn)，JZ3-1-15發(fā)酵液正丁醇萃取物溶液對(duì)病原真菌青9D-2-6的抑菌力更強(qiáng)。

表 4 菌株JZ3-1-15發(fā)酵液萃取物對(duì)病原真菌青9D-2-6的抑菌活性Table 4 Inhibitory activity of crude extract from JZ3-1-15 fermentation broth against Qing 9D-2-6

2.6 活性菌株發(fā)酵液萃取物的穩(wěn)定性

由圖4可知，在試驗(yàn)設(shè)計(jì)濃度下，JZ3-1-15發(fā)酵液正丁醇萃取物對(duì)溫度、pH值和紫外線穩(wěn)定性均良好。在80 ℃高溫下，正丁醇萃取物抑制率能達(dá)到70%以上；當(dāng)溫度上升至121 ℃時(shí)，抑制率仍達(dá)65%以上，說(shuō)明菌株JZ3-1-15發(fā)酵液正丁醇萃取物中的抑菌物質(zhì)耐高溫；pH值對(duì)菌株JZ3-1-15發(fā)酵液正丁醇萃取物中的抑菌物質(zhì)有較小影響，pH=4時(shí)抑制率為59.28%，pH=8時(shí)抑制率為63.24%，抑制率雖然有小幅下降，但仍在55%以上。說(shuō)明強(qiáng)酸、強(qiáng)堿對(duì)菌株JZ3-1-15發(fā)酵液正丁醇萃取物中的抑菌物質(zhì)有較小的影響；紫外線對(duì)菌株JZ3-1-15發(fā)酵液正丁醇萃取物中的抑菌物質(zhì)幾乎無(wú)影響，抑制率均接近80%，抑制率浮動(dòng)小于5%。

圖 4 溫度（A）、pH值（B）和紫外線（C）對(duì)JZ3-1-15發(fā)酵液萃取物的抑菌活性影響Fig. 4 Effects of temperature (A), pH (B), and uv (C) on antibacterial activity of crude JZ3-1-15 fermentation broth extract

3 結(jié)論與討論

馬鈴薯干腐病是貯藏期病害最常見(jiàn)的真菌病害之一。目前，國(guó)外對(duì)馬鈴薯干腐病的生物防治已取得了較大進(jìn)展[38]，但國(guó)內(nèi)對(duì)馬鈴薯干腐病進(jìn)行生物防治的報(bào)道相對(duì)較少，甚至利用白酒糟醅對(duì)馬鈴薯干腐病進(jìn)行生物防治的研究報(bào)道仍處于空白。本研究基于本課題組前期發(fā)現(xiàn)1株分離自青稞白酒糟醅的菌株JZ2-1-12對(duì)馬鈴薯干腐病病原菌具有抑菌活性，繼續(xù)對(duì)分離自青稞白酒酒糟的9個(gè)株菌進(jìn)行了馬鈴薯干腐病病原菌的拮抗篩選，發(fā)現(xiàn)菌株JZ3-1-15對(duì)4株馬鈴薯干腐病病原菌均具有較強(qiáng)、較穩(wěn)定的抑菌活性，其發(fā)酵液正丁醇萃取物對(duì)馬鈴薯干腐病的抑菌活性最高，且發(fā)酵液正丁醇萃取物在不同溫度、pH值和紫外線處理下均有較高的穩(wěn)定性。這就表明JZ3-1-15能產(chǎn)生具有抑制馬鈴薯干腐病活性的次級(jí)代謝產(chǎn)物，且不易受外界環(huán)境影響，該菌株具備開(kāi)發(fā)為馬鈴薯干腐病生防菌劑的潛力。

經(jīng)形態(tài)學(xué)、生理生化特征及分子生物學(xué)方法對(duì)JZ3-1-15進(jìn)行鑒定，確定JZ3-1-15為貝萊斯芽孢桿菌（Bacillus velezensis）。芽孢桿菌（Bacillus spp.）是人們發(fā)現(xiàn)最早的拮抗細(xì)菌之一，因其具有生長(zhǎng)快、抑菌譜廣、抗逆性強(qiáng)、對(duì)人畜安全、環(huán)境相容性好等優(yōu)點(diǎn)而備受植物保護(hù)和環(huán)境保護(hù)專家的關(guān)注[39]。貝萊斯芽孢桿菌是近幾年國(guó)內(nèi)外分離得到的芽孢桿菌屬的一個(gè)新種，該菌與枯草芽孢桿菌具有很高的親緣性，大量菌株是作物生物防治的首選生物藥劑[40]。據(jù)報(bào)道，貝萊斯芽孢桿菌對(duì)煙草黑脛病菌、水稻條斑病菌、西瓜枯萎病菌、番茄灰霉病菌、草莓炭疽病菌、小麥赤霉病菌等植物病原菌具有顯著的抑菌作用[41?45]；其氯仿萃取物可以促進(jìn)玉米、豌豆和胡豆的根長(zhǎng)和芽長(zhǎng)生長(zhǎng)，且獲得的干物質(zhì)可以延緩玉米葉片衰老，提高植株抗逆性，促進(jìn)玉米生長(zhǎng)[46]。另外，貝萊斯芽孢桿菌定殖于小麥根部，會(huì)導(dǎo)致171個(gè)蛋白和3 127個(gè)基因表達(dá)發(fā)生顯著變化，且誘導(dǎo)SA轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中的PR1抗性基因表達(dá)，形成類似SAR的誘導(dǎo)系統(tǒng)抗性（ISR）[47]。本研究發(fā)現(xiàn)篩選出的菌株JZ3-1-15具有分泌淀粉酶、蛋白酶和纖維素酶的能力，這表明JZ3-1-15能產(chǎn)生具有抑制馬鈴薯干腐病活性的次級(jí)代謝產(chǎn)物，且產(chǎn)生的次級(jí)代謝產(chǎn)物可能為脂肽類物質(zhì)，與劉安等[28]的研究結(jié)果一致。因此，對(duì)JZ3-1-15后續(xù)的研究重點(diǎn)可放在對(duì)該菌株次級(jí)代謝產(chǎn)物的分離、純化及活性次級(jí)代謝產(chǎn)物抑菌機(jī)制的研究。該研究結(jié)果有望將青稞白酒酒糟開(kāi)發(fā)成一種新型、高效、低毒的微生物資源，可以為植物病害的生物防治和農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展奠定堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。