孫雨欣，毛水芳，陳銀寧，丁喆，李雨潼，夏璽越，程浩，馮思敏

(浙江工業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與工程系，浙江 杭州， 310014)

莼菜(Braseniaschrebei)是一種稀有的和有價(jià)值的食用蔬菜。莼菜體外膠是存在于莼菜芽以及葉柄表面透明的凝膠黏液，所含的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)主要是多糖和多酚，以及少量的蛋白質(zhì)和黃酮，同時(shí)含有鋅、鈣、鐵等微量元素[1]。

目前，莼菜體外膠的分離通常是利用堿浸提法，但該方法極易破壞體外膠立體旋光活性結(jié)構(gòu)，且污染環(huán)境、成本較高，不適合規(guī)模化生產(chǎn)。王倩等[2]利用堿提醇沉法提取莼菜多糖，所得莼菜多糖純度為70.3%，提取率大約為79%；周毅峰等[3]表明莼菜體外膠質(zhì)溶解的溶劑是NaOH，最佳條件為濃度0.10 mol/ L，但堿提法則對(duì)多糖的空間結(jié)構(gòu)和生物活性均有破壞作用。超聲波提取由于具有簡(jiǎn)單、方便、快速、得率高且不影響有效成分等優(yōu)點(diǎn)，近年來(lái)被廣泛應(yīng)用到植物活性成分的提取中。

SESHADRI等發(fā)現(xiàn)，超聲處理可以改善果膠凝膠的光學(xué)特性，在食品工業(yè)中迫切需要透明和較少混濁的凝膠[4]。目前，超聲波處理對(duì)莼菜體外膠的流變性，持水性和物理性質(zhì)的研究仍然有限。本實(shí)驗(yàn)將結(jié)合超聲處理研究莼菜體外膠流變學(xué)、質(zhì)構(gòu)性以及生物學(xué)等特性的影響，為優(yōu)化莼菜的加工，推進(jìn)莼菜多糖產(chǎn)品的開發(fā)并賦予其更高的附加值奠定一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮莼菜，杭州千盛食品廠。

各標(biāo)準(zhǔn)單糖樣品，購(gòu)于Sigma公司(MO，USA)，其余均為國(guó)產(chǎn)分析純或化學(xué)純。

1.2 儀器與設(shè)備

AY-120/BL-220H 電子天平，日本Shimadzu公司；DHG-9140A 電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，上海一恒科技有限公司；BTP pro真空冷凍干燥機(jī)，美國(guó)Virtis公司；HH-6 數(shù)顯恒溫水浴鍋，江蘇國(guó)華電器有限公司；EYELA 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海愛朗儀器有限公司；SHB-III循環(huán)水式真空泵，鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司；98-2 磁力攪拌器，上海司樂儀器有限公司；DELTA 320 pH計(jì)，梅特勒-托利多儀器有限公司；CR21N 離心機(jī)，日本國(guó)茨城縣常陸那珂有限公司；FS-1200pv 超聲波處理器，上海生析超聲儀器有限公司；MDF-U3386 超低溫冰箱，上海松下健康醫(yī)療器械有限公司；SH2-B 恒溫水浴振蕩槽，上海一恒科技有限公司；DZF-6050 高溫真空烘箱，杭州全譜實(shí)驗(yàn)室設(shè)備有限公司；R/S-plus 流變儀，美國(guó)Brookfield公司；TA.XT Plus 物性測(cè)試器，英國(guó) Stable Micro Systems公司。

1.3 方法

1.3.1 分離莼菜體外膠

在分離實(shí)驗(yàn)之前，將新鮮莼菜漂洗3次并瀝干。準(zhǔn)確稱取20 g新鮮莼菜樣品置于燒杯中。并在不同條件下處理：(1)樣品在40 ℃下水浴振蕩分離0.5～4 h，轉(zhuǎn)速為220 r/min；(2)在能量密度2 400～8 000 J/g下對(duì)樣品進(jìn)行超聲處理；(3)將樣品放置于-80 ℃至0 ℃的變溫冰箱中冷凍24 h，然后在30 ℃下解凍；(4)在(3)步驟的基礎(chǔ)上再在能量密度為2 400 J/g下超聲處理。

在上述步驟之后，將樣品在7 000 r/min下離心10 min后，測(cè)殘?jiān)|(zhì)量，計(jì)算方法如公式(1)所示：

(1)

1.3.2 體外膠的基本成分測(cè)定

為測(cè)定超聲對(duì)基本活性成分的影響。用機(jī)械振蕩法將莼菜樣品在40 ℃下水浴振蕩分離2 h后離心10 min(轉(zhuǎn)速為7 000 r/min)，取上清液冷凍干燥或在恒溫鼓風(fēng)干燥箱內(nèi)熱風(fēng)干燥得莼菜體外膠樣品。稱取0.5 g上述未超聲的冷凍或熱風(fēng)干燥的多糖膠，先加入少量0.1 mol/L NaOH進(jìn)行溶解，之后用0.1 mol/L NaOH稀釋至100 mL，并用2 mol/L HCl調(diào)節(jié)pH至中性。超聲處理后(超聲頻率20 kHz，8s一個(gè)循環(huán)，600 W，1 min)進(jìn)行測(cè)定。總糖采用苯酚-硫酸法[5]；還原糖含量測(cè)定[6]：參照GB 5009.7—2016；蛋白含量測(cè)定[7]：參照GB 5009.5—2016 分光光度法；總酚含量的測(cè)定采用福林酚法[8]；總黃酮含量測(cè)定[9]：參照SN/T 4592—2016。

1.3.3 體外膠多糖的單糖組成測(cè)定

使用GC-MS法測(cè)定體外膠多糖的單糖組成[10]。將5 mL 2 mol/L的三氟乙酸(TFA)加入到2 mg體外膠中，并在110 ℃水解2 h，在40 ℃下減壓濃縮蒸干，加入3 mL甲醇減壓濃縮蒸干，重復(fù)4～5次以完全除去殘留的TFA。然后將樣品還原并乙?；詈笥寐确孪♂屩? mL。

色譜柱DB-23(30 m×0.25 mm×0.25 μm)，載氣流速(N2)(1 mL/min)，程序升溫，起始溫度100℃，以5℃/min升至200℃，保持1 min，再以10 ℃/min上升至250 ℃，保持5 min，進(jìn)樣口溫度250 ℃，檢測(cè)器溫度250 ℃，分流比1∶50，氫氣流速(35 mL/min)，空氣流速(350 mL/min)，尾氣流速(30 mL/min)。

1.3.4 體外膠的質(zhì)構(gòu)性測(cè)定

為測(cè)定超聲對(duì)體外膠質(zhì)構(gòu)性的影響。稱取1.3.2中所述未超聲的體外膠樣品1.2 g溶解于100 mL蒸餾水中得到1.2 g/L的體外膠懸浮液，在95℃下加入0.1 mol/L的CaCl2，再加入蔗糖使其質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到60%，然后繼續(xù)加熱磁力攪拌以使鈣離子和蔗糖充分溶解形成均勻的溶液，然后置于超聲波發(fā)生器中(超聲頻率20 kHz，8 s一循環(huán)，400～800 W，0～7 min)。之后將凝膠儲(chǔ)存在30 mm×50 mm的密封稱量瓶中，在4℃下過(guò)夜后進(jìn)行質(zhì)構(gòu)測(cè)定。

1.3.5 體外膠的流變特性測(cè)定

將1.3.2所述0.05 g干燥的體外膠(未超聲)溶解于20 mL蒸餾水中得到2.5 g/L的體外膠懸浮液，之后進(jìn)行超聲處理(超聲頻率20 kHz，8 s一循環(huán)，600 W，1 min)，將約1～2 mL樣品裝載到流變儀的板上并維持2.0 min以等待應(yīng)力和溫度的平衡。選用直徑為25 mm的平行板系統(tǒng)，平行板間距為1 mm。測(cè)定條件：溫度25 ℃，剪切速率：0.01～800 1/s，振蕩頻率掃描范圍：0.1～20 Hz。

1.3.6 體外膠的體外酶活性抑制實(shí)驗(yàn)

(1)將α-淀粉酶溶于0.1 mol/L 的磷酸鉀緩沖液(pH 6.8)配成0.1 U/mL備用。試管中加入1 mL體外膠溶液(1.2、1.4、1.6、2.0、2.4、2.8、3.2 mg/mL)，0.3 mL α-淀粉酶溶液，在37 ℃下水浴20 min,加入0.4 mL 1%的淀粉溶液。之后在37 ℃下水浴反應(yīng)8min，加入0.2 mL DNS，于沸水浴中反應(yīng)5 min，取出冷卻定容至25 mL，于540 nm 處測(cè)定吸光值(A1)，用緩沖液代替體外膠溶液測(cè)其吸光值(A0)，用緩沖液代替酶液測(cè)其吸光值(A2)。(2)取不同濃度體外膠溶液1 mL加入到2 mL pH 6.8的磷酸鉀緩沖溶液中，再加入1 mL 0.1 U/mL α-葡萄糖苷酶混勻，在37 ℃下水浴10 min后加入5 mmol/L的PNPG溶液0.5 mL，于37℃下保溫20 min，加入0.1 mol/L Na2CO3溶液2 mL終止反應(yīng)，在400 nm 處測(cè)其吸光值(A1)，用緩沖液代替體外膠溶液測(cè)其吸光度值(A0)，用緩沖液代替酶液測(cè)其吸光值(A2)。陽(yáng)性對(duì)照為阿卡波糖。酶活抑制率計(jì)算方法如公式(2)：

(2)

1.3.7 數(shù)據(jù)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(SD)表示，數(shù)據(jù)分析使用SPSS Version 16.0。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同因素對(duì)體外膠分離率的影響

由圖1-A可知，隨著振蕩時(shí)間從0.5 h增加到4 h，體外膠的分離率剛開始隨著振蕩時(shí)間的增加上升較快，當(dāng)振蕩時(shí)間超過(guò)2 h時(shí)，分離率的增加則變得十分緩慢。由振蕩產(chǎn)生的機(jī)械力可以促進(jìn)體外膠的分離，雖然延長(zhǎng)振蕩時(shí)間可以提高體外膠的分離率，但可能會(huì)使體外膠發(fā)生降解且會(huì)消耗大量的時(shí)間[11]。最佳的振蕩時(shí)間為2 h時(shí)，體外膠的分離率為(43.34±0.94)%。由圖1-B可以看出，當(dāng)溫度低于0 ℃時(shí)，分離率隨著溫度的升高而增加，這可能是由于緩慢冷凍形成的大顆粒冰晶，有利于體外膠的分離[12]。當(dāng)冷凍溫度為-4 ℃，超聲能量密度為2 400 J/g時(shí)，分離率最大為(63.93±6.11)%。由圖1-C可知，體外膠的分離率隨著超聲能量密度的增加而增加，超聲能量密度達(dá)到4 800 J/g時(shí)，分離率達(dá)到最大，進(jìn)一步增加超聲能量密度，多糖膠體外膠的分離率呈下降趨勢(shì)。當(dāng)能量密度低于4 800 J/g時(shí)，可能由于剪切力過(guò)小不足以完全分離體外膠，當(dāng)能量密度高于4 800 J/g時(shí)，反而造成體外膠分離率的下降[20]。當(dāng)超聲能量密度為4 800 J/g時(shí)，體外膠的分離率最大為(78.97±3.83)%。

A-振蕩時(shí)間；B-冷凍溫度；C-超聲能量密度

2.2 體外膠化學(xué)物質(zhì)的含量

圖2給出了經(jīng)不同方式處理后的莼菜體外體外膠的總糖、還原糖、總蛋白、總多酚和總黃酮含量。冷凍干燥體外膠的各化學(xué)物質(zhì)含量均高于熱風(fēng)干燥，這可能是由于熱風(fēng)干燥時(shí)體外膠被空氣氧化造成的。而超聲處理和未超聲處理的體外膠的各化學(xué)物質(zhì)含量幾乎相同，總糖含量為524.4～552.8 mg/g，還原糖含量為26.8～32.3 mg/g。體外膠的主要成分是多糖約為520.5 mg/g，與KAKUTA等的結(jié)果一致[21]，而且遠(yuǎn)高于果膠中的含量(326 mg/g)[15],是多糖的良好來(lái)源，具有很多生物活性。體外膠的總多酚含量為208.3～228.5 mg GAE/g，這使得它具有較高的抗氧化活性。此外，它還含有少量的蛋白質(zhì)(16.9～21.5 mg/g)和黃酮(1.8～5.1 mg/g)，這與ZHAO等的研究結(jié)果一致[16]。

圖2 超聲處理或未處理的不同干燥方式體外膠的化學(xué)物質(zhì)(總糖、還原糖、總蛋白、總多酚、總黃酮)的含量

2.3 體外膠多糖的單糖組成

如圖3所示，由體外膠多糖釋放的單糖組分完全可以彼此分離。通過(guò)比較未知峰與參考標(biāo)準(zhǔn)糖的保留時(shí)間，可以得出體外膠多糖含有9種單糖，含量較高的單糖為半乳糖(41.79%)，木糖(18.72%)和鼠李糖(7.13%)，這與 KAKUTA等發(fā)現(xiàn)的莼菜體外膠膠多糖富含半乳糖(32%～40%)，鼠李糖(6%～9%)和木糖(2%～7%)的結(jié)果一致[14]。還通過(guò)比較其質(zhì)譜碎裂模式與MS確定了一些含量較少的單糖，如甘露糖(4.29%)、葡萄糖(4.55%)、阿拉伯糖(1.02%)和可能的物質(zhì)(1,2,3-苯三酚，三乙酸酯)。

1-1,2,3-苯三酚，三乙酸鹽(9.26%)；2-未知單糖(3.01%)；3-鼠李糖(7.13%)；4-木糖(18.72%)；5-甘露糖(4.29%)；6-葡萄糖(4.55%)；7-半乳糖(41.79%)；8-未知單糖(2.18%)；9-阿拉伯糖(1.02%)

2.4 超聲對(duì)體外膠質(zhì)構(gòu)性的影響

2.4.1 超聲功率對(duì)體外膠質(zhì)構(gòu)性的影響

為了研究超聲處理對(duì)多糖膠質(zhì)構(gòu)性的影響，在超聲頻率為20 kHz，超聲脈沖方式為8 s，時(shí)間為3min的條件下,用不同的超聲功率(400～800 W)處理多糖膠。由表1可見，超聲處理顯著降低了冷凍干燥和熱風(fēng)干燥體外膠樣品的硬度、彈性、內(nèi)聚性和黏附性。隨著超聲功率的增加，上述參數(shù)均先增大后減小，超聲功率為600 W時(shí)達(dá)到最大值。冷凍干燥體外膠的硬度，彈性，內(nèi)聚性和黏附性均高于熱風(fēng)干燥體外膠，且超聲處理對(duì)冷凍干燥體外膠的影響更大。超聲波的作用不同于化學(xué)降解和熱降解，它是一種非隨機(jī)過(guò)程，優(yōu)先作用于大分子。在超聲處理過(guò)程中，大量低摩爾質(zhì)量的多糖大分子可能會(huì)被降解，這有助于增加超聲波降低黏性的有效性。然而，高超聲能量會(huì)損害體外膠的結(jié)構(gòu)并降低黏度[17]。

2.4.2 超聲時(shí)間對(duì)體外膠質(zhì)構(gòu)性的影響

在超聲頻率20 kHz，8 s一循環(huán)，超聲功率600W的條件下分析超聲時(shí)間對(duì)多糖膠質(zhì)構(gòu)性的影響。不同方式干燥后，體外膠的質(zhì)構(gòu)性(硬度，彈性，內(nèi)聚性和黏附性)見表2。結(jié)果表明，與初始值相比，增加超聲處理時(shí)間會(huì)降低冷凍干燥和熱風(fēng)干燥體外膠的上述參數(shù)值，且冷凍干燥體外膠的上述參數(shù)值均顯著高于熱風(fēng)干燥體外膠。隨著超聲時(shí)間的增加，體外膠的上述參數(shù)值均先增加后減小，冷凍和熱風(fēng)干燥體外膠的上述參數(shù)分別在5 min和3 min時(shí)達(dá)到最大值。通過(guò)增加超聲處理時(shí)間可以產(chǎn)生較軟的凝膠。

2.5 超聲對(duì)體外膠流變特性的影響

由圖4-A可見，冷凍干燥體外膠與熱風(fēng)干燥體外膠的黏度較接近，未經(jīng)超聲處理的體外膠呈現(xiàn)假塑性流體行為，超聲處理后的體外膠黏度顯著下降且表現(xiàn)近牛頓流體行為。

由圖4-B可知，4種樣品溶液的儲(chǔ)能模量(G′)隨著頻率的增加而增加，并且呈現(xiàn)出相似的形狀和趨勢(shì)，同時(shí)超聲處理體外膠的G′略低于未經(jīng)超聲處理的體外膠。而圖4-C對(duì)于未經(jīng)超聲處理的體外膠，在低頻處損耗模量(G″)高于經(jīng)超聲處理的體外膠，在大約1.72 Hz的角頻率處，經(jīng)超聲處理體外膠的G″迅速增加超過(guò)了未經(jīng)超聲處理體外膠的G″。超聲處理降低了體外膠的彈性行為并且在較高頻率下增加了黏性行為，這可能是由于超聲處理降低了體外膠的分子量，破壞了體外膠的致密均勻結(jié)構(gòu)造成的[18]。

表1 超聲功率對(duì)不同干燥方式體外膠質(zhì)構(gòu)性的影響

注：數(shù)據(jù)表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=3)；a,b,c表示通過(guò)ANOVA分析不同超聲功率之間的顯著差異(P<0.05)；*表示通過(guò)t檢驗(yàn)分析在相同超聲處理下冷凍干燥和熱風(fēng)干燥體外膠之間的顯著差異(P<0.05)。下同。

表2 超聲時(shí)間對(duì)不同干燥方式體外膠質(zhì)構(gòu)性的影響

注：數(shù)據(jù)表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=3);a, b, c表示通過(guò)ANOVA分析不同超聲時(shí)間之間的顯著差異(P<0.05);*表示通過(guò)t檢驗(yàn)分析在相同超聲處理下冷凍干燥和熱風(fēng)干燥體外膠之間的顯著差異(P<0.05)。.

A-流動(dòng)行為；B-動(dòng)態(tài)儲(chǔ)能模量；C-損耗模量

2.6 超聲對(duì)體外膠抑制酶活的影響

如圖5-A所示，經(jīng)不同方式處理后的體外膠對(duì)α-葡萄糖苷酶具有一定的抑制活性，且呈濃度依賴性。隨著體外膠濃度從1.2 mg/mL增加到3.2 mg/mL，體外膠對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制活性增加。抑制劑的半數(shù)抑制率(IC50)值可用于評(píng)估抑制劑的抑制效率，從圖中經(jīng)計(jì)算得到經(jīng)冷凍、冷凍和超聲、熱風(fēng)、熱風(fēng)和超聲處理后體外膠對(duì)α-葡萄糖苷酶的IC50值分別為1.832、1.770、2.256和2.023 mg/mL。超聲處理對(duì)體外膠抑制α-葡萄糖苷酶的活性影響不大，但熱風(fēng)干燥顯著降低了體外膠抑制α-葡萄糖苷酶的活性，可能是因?yàn)闊犸L(fēng)干燥使得體外膠中部分化學(xué)活性物質(zhì)分解造成的[19]。

由圖5-B可知，經(jīng)不同方式處理后的體外膠對(duì)α-淀粉酶具有一定的抑制活性，且呈濃度依賴性。隨著體外膠濃度從1.2 mg/mL增加到3.2 mg/mL，體外膠對(duì)α-淀粉酶的抑制率呈上升趨勢(shì)。從圖中經(jīng)計(jì)算得到,經(jīng)冷凍、冷凍和超聲、熱風(fēng)、熱風(fēng)和超聲處理后體外膠對(duì)α-淀粉酶的IC50值分別為2.156、2.151、2.392和2.249 mg/mL。冷凍干燥體外膠對(duì)α-淀粉酶具有較高的抑制活性，可能是因?yàn)槔鋬龈稍锟梢院芎玫乇Ａ趔w外膠中的化學(xué)活性物質(zhì)。

由圖5-C知，在濃度為0.4～3.2 mg/mL，阿卡波糖對(duì)α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶活性的抑制都是劑量依賴關(guān)系，隨劑量的加大，抑制率增大。阿卡波糖對(duì)α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶活性的半抑制濃度分別0.916、1.377 mg/mL，抑制效果略好于莼菜膠。

A-α-葡萄糖苷酶;B-α-淀粉酶;C-阿卡波糖

3 結(jié)論

超聲耦合離心法分離莼菜體外體外膠可獲得最大分離率。而且，超聲處理降低了冷凍干燥和熱風(fēng)干燥體外膠的硬度、彈性、內(nèi)聚性和黏附性。

體外膠本身含有豐富的多糖和多酚，超聲耦合離心法分離莼菜體外膠，可快速分離莼菜體外膠，既不破壞莼菜組織，又可以充分保持多糖膠的化學(xué)物質(zhì)含量、抗氧化活性以及酶抑制活性，且操作工藝簡(jiǎn)單，成本較低，生產(chǎn)過(guò)程對(duì)環(huán)境污染小，值得繼續(xù)深入探討，是否可以對(duì)莼菜其他成分提取有所幫助，以及其活性成分的生理功能研究。