王諳 吳琦 陳懷永

天津醫(yī)科大學(xué)海河臨床學(xué)院 天津市肺臟再生醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室300350

呼吸系統(tǒng)疾病病死率在世界范圍內(nèi)逐年上升,每年約有700多萬人死于呼吸系統(tǒng)疾病［1］。這些疾病通常是細(xì)胞內(nèi)在突變、細(xì)胞間作用改變、對環(huán)境損害的異常應(yīng)答、細(xì)胞類型比例失調(diào)以及組織結(jié)構(gòu)紊亂的綜合結(jié)果［2］。已有報(bào)道稱,肺中存在40余種細(xì)胞類型［3］。最近有關(guān)學(xué)者在人類氣道壁上發(fā)現(xiàn)了一種豐度很低的新型上皮細(xì)胞類型——離子細(xì)胞［4］,這得益于單細(xì)胞測序技術(shù)強(qiáng)大的分析功能。單細(xì)胞測序技術(shù)通過轉(zhuǎn)錄組擴(kuò)增進(jìn)行高通量測序,揭示單個(gè)細(xì)胞的基因表達(dá)狀態(tài),反映細(xì)胞間的異質(zhì)性和動(dòng)態(tài)互作,把組織病理學(xué)推向單細(xì)胞水平［2］。全面而深入地解析人類肺組織及呼吸系統(tǒng)疾病模型動(dòng)物肺臟所有細(xì)胞類型、功能和互作關(guān)系,有助于人們理解肺臟功能的基本原理,揭示呼吸系統(tǒng)疾病發(fā)生與發(fā)展的機(jī)制。

1 單細(xì)胞測序技術(shù)

作為單細(xì)胞系統(tǒng)生物學(xué)的一部分,單細(xì)胞測序的原理是將分離的單個(gè)細(xì)胞的微量遺傳基因進(jìn)行擴(kuò)增,獲得高覆蓋率的完整的基因組后,再進(jìn)行高通量測序,用于揭示細(xì)胞群體差異和細(xì)胞進(jìn)化的關(guān)系。單細(xì)胞測序已成為檢測細(xì)胞間基因異質(zhì)性的重要工具,它將計(jì)算科學(xué)、數(shù)學(xué)模型和高通量技術(shù)與細(xì)胞的生物學(xué)功能結(jié)合起來［5］。2002年,多項(xiàng)研究報(bào)道單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組的基因芯片分析［6-9］。雖然基因芯片使全面分析單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組成為可能,但是它只能檢測已知基因,而且檢測的靈敏度和動(dòng)態(tài)范圍均有限［10］。2009年,Tang等［11］通過對小鼠的單個(gè)卵母細(xì)胞進(jìn)行分析,首次報(bào)道單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組的深度測序分析 (single cell RNAsequencing,scRNA-Seq)。2012 年,Wang 等［12］通 過 單 細(xì)胞測序的方法,測定100個(gè)精子的重組率,發(fā)現(xiàn)許多新的重組熱點(diǎn)。2013年,Ni等［13］首次利用癌癥患者外周血單個(gè)循環(huán)腫瘤細(xì)胞進(jìn)行全基因組和外顯子組測序,為腫瘤無創(chuàng)診斷和監(jiān)測提供了一種新的技術(shù)手段。單細(xì)胞測序技術(shù)能夠解析細(xì)胞間更加細(xì)微的差異,推動(dòng)腫瘤、微生物、神經(jīng)科學(xué)、免疫等領(lǐng)域的發(fā)展,正在成為生命科學(xué)研究中的熱點(diǎn)［14］。從2016 年開始,scRNA-Seq技術(shù)被逐漸引入到呼吸系統(tǒng)疾病研究中來。

2 單細(xì)胞分析在肺發(fā)育研究中的應(yīng)用

對肺臟功能的研究中,單細(xì)胞測序技術(shù)有助于解析肺臟發(fā)生過程中的細(xì)胞進(jìn)程,定義間充質(zhì)、上皮和單核/巨噬細(xì)胞群體之間的細(xì)胞異質(zhì)性。Treutlein等［15］利用單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序分析小鼠遠(yuǎn)端肺細(xì)胞類型。對198個(gè)不同分化階段的小鼠肺上皮細(xì)胞進(jìn)行聚類分析,能有效區(qū)分遠(yuǎn)端肺上皮細(xì)胞的各個(gè)類型,并發(fā)現(xiàn)了上皮細(xì)胞的多個(gè)新標(biāo)志物。重建了雙潛能前體細(xì)胞沿2個(gè)肺泡譜系成熟的步驟,闡明了Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞譜系發(fā)生過程。Lee等［16］使用了基因譜系追蹤、單細(xì)胞RNA 測序和類器官培養(yǎng)等技術(shù),在小鼠肺中鑒定出2個(gè)支持上皮干細(xì)胞生長的間質(zhì)細(xì)胞群。這兩群間質(zhì)細(xì)胞分別表達(dá)Lgr5 和Lgr6,分布的部位也不相同。這種對上皮細(xì)胞和其鄰近間質(zhì)細(xì)胞之間譜系特異性的鑒定,拓寬了人們對肺臟細(xì)胞組成及其互作的理解。Wang等［17］利用scRNA-seq技術(shù),確定出生后Ⅰ型肺泡上皮細(xì)胞(alveolar typeⅠ,AT1)的發(fā)育特點(diǎn)。發(fā)現(xiàn)成體AT1細(xì)胞群中同時(shí)含有Hopx+Igfbp2+和Hopx+Igfbp2-2個(gè)AT1細(xì)胞亞群,且其中Igfbp2+的AT1細(xì)胞比例在肺泡形成和肺切除后新形成的肺泡中增加,其在肺臟穩(wěn)態(tài)及肺通氣功能中的作用有待進(jìn)一步揭示。

3 單細(xì)胞分析在呼吸系統(tǒng)疾病研究中的應(yīng)用

3.1 單細(xì)胞分析與肺癌 肺癌的異質(zhì)性被認(rèn)為是設(shè)計(jì)和選擇個(gè)體化治療策略,以及重新定義腫瘤病理學(xué)分子類別的關(guān)鍵 線 索,并 用 于 精 準(zhǔn) 醫(yī) 學(xué) 治 療［18］。Kim 等［19］應(yīng) 用scRNA-Seq檢測單個(gè)腫瘤內(nèi)的基因表達(dá)和單核苷酸突變的全面信息,并從肺腺癌患者的異種移植物中分離出34個(gè)來源于患者的異種移植物腫瘤細(xì)胞,在這些細(xì)胞中鑒定出一個(gè)與抗癌藥物耐藥相關(guān)的候選腫瘤細(xì)胞亞群,有助于優(yōu)化臨床抗腫瘤策略。然而,人們更多關(guān)注的是,癌細(xì)胞的基因序列是否會(huì)在體內(nèi)生長過程或體外培養(yǎng)過程中發(fā)生改變［20］?；颊邆€(gè)體差異、原發(fā)或轉(zhuǎn)移、癌變部位以及治療方法等因素帶來的腫瘤細(xì)胞微環(huán)境的異質(zhì)性也會(huì)影響單細(xì)胞內(nèi)基因表達(dá)的動(dòng)態(tài)變化［21］。另外,靶向或非靶向藥物本身也可直接或間接改變微環(huán)境發(fā)揮藥理學(xué)作用,而微環(huán)境改變導(dǎo)致體細(xì)胞基因突變以及細(xì)胞對治療的敏感性改變,這也是在治療過程中產(chǎn)生耐藥性的潛在機(jī)制之一。Suzuki等［22］通過構(gòu)建和篩選scRNA-Seq文庫,測量了肺腺癌細(xì)胞系中每個(gè)細(xì)胞對分子靶向藥物反應(yīng)的轉(zhuǎn)錄組特征,以及原始細(xì)胞和細(xì)胞獲得耐藥性后的差異。Guo等［23］通過單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序,檢測了14例非小細(xì)胞肺癌患者在進(jìn)行藥物治療之前,其外周血、癌旁組織和癌組織中的T 細(xì)胞,描述了在不同T 細(xì)胞亞群中一些已知的免疫治療靶點(diǎn)基因的表達(dá)分布,揭示了不同的免疫治療藥物可能對應(yīng)的靶向細(xì)胞,為非小細(xì)胞肺癌患者未來的精準(zhǔn)治療提供了支持。

3.2 單細(xì)胞分析與肺纖維化 氣道重塑、炎癥、肺泡破壞和蜂窩狀肺被認(rèn)為是肺纖維化的重要特征之一,肺纖維化是慢性肺疾病中病死率和發(fā)病率較高的疾病之一［24］。上皮修復(fù)是肺損傷后愈合的一個(gè)持續(xù)過程,在此過程中,上皮細(xì)胞遷移至損傷部位,分泌細(xì)胞因子促進(jìn)自我增殖和分化,產(chǎn)生新的上皮細(xì)胞類型［4］。Xu等［25］通過scRNA-Seq分析基因表達(dá)的差異,定義了特發(fā)性肺纖維化動(dòng)物模型中不同的上皮細(xì)胞類型,并追蹤了慢性肺損傷修復(fù)過程中氣道上皮細(xì)胞增殖分化的過程。scRNA-Seq分析可以確定許多與細(xì)胞亞型特異性相關(guān)或與疾病特異性相關(guān)的上皮細(xì)胞標(biāo)志物,但由于臨床活檢、倫理以及技術(shù)障礙的限制,測量慢性肺疾病患者的單個(gè)上皮細(xì)胞分布是一個(gè)實(shí)際的挑戰(zhàn)［19］。3.3 單細(xì)胞分析與哮喘 人類的肺臟能夠與外界進(jìn)行有效的氣體交換,同時(shí)也通過黏膜免疫來抵御病原體的入侵而發(fā)揮屏障作用。肺內(nèi)穩(wěn)態(tài)依賴于結(jié)構(gòu)細(xì)胞和免疫細(xì)胞之間密切的相互作用［26］。Vieira Braga等［27］收集并檢測來自健康人以及哮喘患者的肺臟細(xì)胞,包括上呼吸道和下呼吸道細(xì)胞以及肺實(shí)質(zhì)部位的細(xì)胞。研究人員在健康者中發(fā)現(xiàn)了肺部記憶性T 細(xì)胞,并在哮喘患者的肺部發(fā)現(xiàn)了新的黏液纖毛細(xì)胞和杯狀細(xì)胞,這些細(xì)胞似乎有助于下呼吸道增生。除此之外,還發(fā)現(xiàn)了上皮內(nèi)肥大細(xì)胞、致病性2型輔助性T 細(xì)胞。通常來說,各種細(xì)胞應(yīng)該密切聯(lián)系,以保持呼吸道的正常功能,但對于哮喘患者來說,這種細(xì)胞間的相互作用幾乎不存在,而由炎性細(xì)胞取代。

4 單細(xì)胞研究的局限性

雖然目前單細(xì)胞測序技術(shù)在基礎(chǔ)研究和臨床研究中都得到了廣泛的應(yīng)用,但仍存在一些困難需要克服。最明顯的困難之一就是需要將組織樣本制成單細(xì)胞懸液。對于液體活檢來說,如支氣管肺泡灌洗液或外周血,制成單細(xì)胞懸液通常只需要原始活檢樣本的濃縮;而對于實(shí)體組織檢查來說,從細(xì)胞外間質(zhì)組織相互連接的細(xì)胞中分離出單個(gè)細(xì)胞的過程便更加困難,酶消化和機(jī)械消化的步驟是必不可少的,需要精確的方案和原始組織來源［28］。另外,在分離過程中,某些操作可能會(huì)給細(xì)胞帶來影響,這些影響包括改變細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄、表達(dá)以及代謝過程。因此,需要建立合適的單細(xì)胞制備技術(shù),從而反映細(xì)胞體內(nèi)的真實(shí)情況。

5 單細(xì)胞分析技術(shù)在呼吸系統(tǒng)疾病研究中的應(yīng)用前景

生物個(gè)體中,不同組織器官中、同一組織器官中處于不同周期階段的細(xì)胞都必須協(xié)同而又有差別地程序性開啟或關(guān)閉某些基因,以便執(zhí)行正確的生物學(xué)功能。在臨床醫(yī)學(xué)中,從微觀水平上,觀察單個(gè)細(xì)胞的動(dòng)態(tài)變化,以及避開細(xì)胞的異質(zhì)性,區(qū)分病變組織中正常細(xì)胞和病態(tài)細(xì)胞的生理狀態(tài),全面揭示病理學(xué)的改變,甚至發(fā)現(xiàn)一些新出現(xiàn)的豐度低的功能細(xì)胞,這些對于疾病的診斷和治療都非常重要。單細(xì)胞分析技術(shù)為回答這些重要的問題提供了有效的分析技術(shù)與方法,未來還可以利用單細(xì)胞技術(shù)發(fā)現(xiàn)更多新類型的細(xì)胞,深入了解疾病的發(fā)病機(jī)制,甚至鑒別出在癌癥或者疾病早期起關(guān)鍵作用的細(xì)胞及標(biāo)志物,以這些標(biāo)志物為指導(dǎo)進(jìn)行疾病的預(yù)防、診斷,并可以根據(jù)此來研究新的治療方式和藥物。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突