李紫薇 郭彥兵 張琪 吳紅芝

摘 ?要：以馬蹄蓮不同品種的花粉為材料，研究馬蹄蓮花粉活力檢測(cè)的適宜方法和貯藏影響因子。比較了TTC、Lugols?染色液、亞甲基藍(lán)、醋酸洋紅4種染色法和離體培養(yǎng)法鑒定馬蹄蓮花粉活力的效果，以及花粉干燥時(shí)間（含水量）、貯藏溫度、預(yù)凍方法、解凍方法對(duì)花粉貯藏的影響。結(jié)果表明：所選用的4種染色法中，TTC法能將馬蹄蓮花粉染成深紅、淺紅、粉紅，從而區(qū)分出花粉有無活力及活力的強(qiáng)弱;Lugols 染色液、醋酸洋紅不能使花粉染色;亞甲基藍(lán)將所有花粉染成同一顏色;所以除TTC法外均不適合馬蹄蓮花粉活力的鑒定。離體培養(yǎng)法培養(yǎng)24 h可以較好鑒定馬蹄蓮花粉活力，其最佳培養(yǎng)基配方為80 g/L蔗糖+0.2?g/L硼酸+0.3 g/L硝酸鈣。馬蹄蓮花粉的適宜干燥條件是室溫下干燥27 h，之后不需任何預(yù)凍處理直接放入冰箱，最適解凍方式是37?℃水浴2?min。不同貯藏溫度下馬蹄蓮花粉活力變化存在明顯差異，試驗(yàn)溫度中以-80?℃的貯藏效果最好，貯藏61?d后仍能保持40%以上的活力，其次是-20?℃貯藏，然后是室溫，4?℃貯藏效果最差。綜上所述，TTC染色法和離體培養(yǎng)法是馬蹄蓮花粉活力測(cè)定的適宜方法，-80?℃的低溫可明顯延長(zhǎng)馬蹄蓮花粉的貯藏時(shí)間，研究結(jié)果為馬蹄蓮花粉離體保存提供了科學(xué)依據(jù)。

關(guān)鍵詞：馬蹄蓮;花粉活力鑒定;染色法;培養(yǎng)法;低溫貯藏中圖分類號(hào)：S682.2??????文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

Identification of Pollen Vitality and?Factors Influencing?Storage Quality of Zantedeschia?spp.

LI Ziwei， GUO Yanbing， ZHANG Qi， WU Hongzhi^*

College of Landscape and Horticulture， Yunnan Agricultural University， Kunming， Yunnan 650201， China

Abstract： The pollen of different varieties ofZantedeschia spp.?was selected as the experimental material to determine the optimal method to detect pollen viability and factors which influence pollen storage quality. The effects of TTC， Lugols solution， methylene blue and acetic acid magenta to detect pollen vitality were compared. The influence of pollen drying time （mean water content）， storage temperature， pre-cooling method and thawing method on pollen storage was explored. The results showed that the TTC method could?dye the pollen ofZantedeschiainto deep red， light red， and pink. However， the?Lugols solution?method?and ammonium acetate method could?not dye the pollen， and methylene blue could?dye all pollen blue. So only TTC method was suitable to?identifyZantedeschiapollen vitality. The most suitable culture medium for pollen germination was consisted of 80?g/L?sucrose， 0.2?g/L?boric acid， 0.3?g/L?calcium nitrate， and the best detection time for pollen vitality was 24 h cultured in the?medium. The treatment of drying pollen for 27 h， then putting into the refrigerator directly， combined?with water bath at 37?℃?for 2 min could?work with low temperature to maintain the vitality of the pollen well. Temperature had great impact on the vitality ofZantedeschiapollen stored. Among the experimental temperature， -80?℃?was the best one and still maintained more than 40% viability after storage for 61 days， then -20?℃?was second， room temperature was the third， and 4?℃?was the worst. Taken?together， TTC staining and culturedin vitromedia were the?suitable methods for identifying the vitality ofZantedeschiapollen. Low temperature -80?℃?could?prolong the storage time ofZantedeschiapollen significantly. The results would provide a scientific basis for preservingZantedeschiapollen.

Keywords： Zantedeschiaspp.; identification of pollen vitality;?dyeing method;?culture method;?low temperature storage

DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2020.01.007

馬蹄蓮（Zantedeschiaspp.）為天南星科（Araceae）馬蹄蓮屬（Zantedeschia Spreng.）的多年生草本球根花卉。由于其形態(tài)高雅、色彩艷麗，不僅可用作切花和盆花，還可扎成花束、花籃，還是春秋兩季花壇或花境的重要素材^[1]，因而其市場(chǎng)需求逐年增大。目前雜交育種是培育馬蹄蓮新品種的主要途徑，在雜交過程中，為解決親本花期不遇和異地授粉，需要對(duì)花粉進(jìn)行貯藏和活力鑒定，因此，研究花粉活力檢測(cè)的適宜方法和花粉貯藏影響因子具有重要的理論和實(shí)踐意義。

低溫能延長(zhǎng)花粉的貯藏期限^[2]，Mathad等^[3]研究表明，辣椒花粉在室溫下3?d就失去授粉能力，在-20?℃下可保存6 d，而液氮中保存48 d后仍能授粉結(jié)實(shí)。Kazushige等^[4]的研究發(fā)現(xiàn)，翠雀花粉室溫下貯藏期限不到21 d，在-30?℃下可以保存180 d;Alba等^[5]研究證明橄欖花粉在室溫下只能保存10 d，在液氮中的貯藏時(shí)間卻長(zhǎng)達(dá)1年。Yuan等^[6]研究表明蝴蝶蘭花粉在室溫下只能保存28 d，4?℃下可以保存280 d，-80?℃下可以保存672 d，而且4?℃和-80?℃下貯藏后的花粉仍能授粉結(jié)實(shí)。目前，有關(guān)馬蹄蓮花粉的研究較少，主要是簡(jiǎn)單的活力檢測(cè)^[7]，關(guān)于低溫或超低溫貯藏期限還未見報(bào)道。因此，本文研究馬蹄蓮花粉活力鑒定方法及貯藏特性，旨在為馬蹄蓮雜交育種中花粉活力檢測(cè)及離體保存提供理論依據(jù)，以促進(jìn)這一優(yōu)良種質(zhì)資源的研究和利用。

1??材料與方法

1.1材料

供試用的彩花馬蹄蓮品種（ym002、ym005、ym011、ym032、ym035、ym037、ym044、ym064、ym088）的開花植株來自于云南昆明亞歐園藝有限公司塑料大棚內(nèi)栽培的盆栽馬蹄蓮;白花馬蹄蓮則來自于云南農(nóng)業(yè)大學(xué)園林園藝學(xué)院種質(zhì)資源圃。于2017年10月至2018年9月晴天的上午9：00用干燥毛筆采集盛開的馬蹄蓮花粉，裝于墊有硫酸紙的培養(yǎng)皿中，迅速帶回實(shí)驗(yàn)室備用。

本實(shí)驗(yàn)先以白花馬蹄蓮花粉為材料，篩選出適宜馬蹄蓮花粉活力鑒定的染色法和萌發(fā)法、初步探索出馬蹄蓮花粉貯藏影響因子，隨后根據(jù)此結(jié)果以10個(gè)品種的馬蹄蓮花粉為材料，研究馬蹄蓮花粉的貯藏期限。

1.2方法

1.2.1 ?花粉染色法 ?氯化三苯四氮唑（triphenyl tetrazolium chloride， TTC）染色法^[8]：在載玻片上加1～2滴0.5%TTC染色液，用毛筆將白花馬蹄蓮新鮮花粉彈在染色液上，蓋上蓋玻片，置于28?℃恒溫培養(yǎng)箱中，12?h后置于顯微鏡下觀察。碘-碘化鉀（Lugols染色液）染色法^[9]：在載玻片上加1～2滴Lugols染色液，用毛筆將白花馬蹄蓮新鮮花粉彈在染色液上，蓋上蓋玻片，置于28?℃恒溫培養(yǎng)箱中，5～10 min后置于顯微鏡下觀察。亞甲基藍(lán)染色法^[10]：在載玻片上加1～2滴0.025%亞甲基藍(lán)染色液，用毛筆將白花馬蹄蓮新鮮花粉彈在染色液上，蓋上蓋玻片，置于28?℃恒溫培養(yǎng)箱中，5～10 min后置于顯微鏡下觀察。醋酸洋紅染色法^[11]：在載玻片上加1～2滴醋酸洋紅染色液，用毛筆將白花馬蹄蓮花粉彈在染色液上，蓋上蓋玻片，置于28?℃恒溫培養(yǎng)箱中，10～ 15?min后置于顯微鏡下觀察。

1.2.2 ?花粉離體培養(yǎng) ?花粉離體培養(yǎng)采用固體培養(yǎng)基，設(shè)置不同種類培養(yǎng)基來篩選最適培養(yǎng)基。本研究采用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，用L₉（3⁴）正交表安排試驗(yàn)，即3因素3水平試驗(yàn)（表1）。配制母液：稱取MgSO₄·7H₂O?2?g，KNO₃ 1?g，赤霉素50?mg，定容至500 mL。除蔗糖、硼酸和硝酸鈣之外，每種培養(yǎng)基加50 mL母液和6 g瓊脂。培養(yǎng)基配置好后分裝在培養(yǎng)皿中，放入4?℃冰箱備用。

參照周滌等^[7]的方法，將白花馬蹄蓮新鮮花粉均勻彈落于培養(yǎng)基上，放于28?℃培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng)24 h后每隔2?h進(jìn)行鏡檢，直至觀察到花粉萌發(fā)率不再增加。萌發(fā)率=視野內(nèi)萌發(fā)花粉粒數(shù)/視野內(nèi)總花粉粒數(shù)×100%，各處理重復(fù)3次，每次重復(fù)統(tǒng)計(jì)花粉數(shù)不少于100粒。

1.2.3 ?花粉貯藏??影響花粉貯藏效果的因素有很多，除了貯藏溫度外，花粉自身的含水量、貯藏前的預(yù)凍處理及貯藏后的解凍方式也會(huì)對(duì)花粉活力產(chǎn)生影響^[12]。為了篩選馬蹄蓮花粉的最佳干燥時(shí)間、預(yù)凍處理及解凍方式，本研究采用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，用L₉（3⁴）正交表安排試驗(yàn)，即三因素三水平試驗(yàn)（表2）。采集新鮮的白花馬蹄蓮花粉作為材料，在室溫（18～25?℃）下干燥不同時(shí)長(zhǎng)后，以不同的預(yù)凍方法處理后放入-80?℃冰箱貯藏，72?h后用不同的解凍方式處理后測(cè)定花粉活力。

根據(jù)篩選的最適的預(yù)凍和解凍方式，將10個(gè)馬蹄蓮品種的新鮮花粉置于室溫下干燥后，分裝至2 mL離心管中，做好標(biāo)記，設(shè)置不同的貯藏溫度：室溫、4、-20、-80?℃?；ǚ刍盍y(cè)定：室溫和4?℃下貯藏的花粉每隔1?d測(cè)定1次活力，-20和-80?℃下貯藏的花粉每隔10 d測(cè)定1次活力。

1.2.4 ?顯微觀察 ?花粉染色和萌發(fā)觀察采用LEICA顯微鏡（ICC50 W， 德國(guó)）。使用LASEZ Version 3.2.1軟件進(jìn)行圖像捕捉和保存。

1.3數(shù)據(jù)處理

采用Excel?10.0軟件處理數(shù)據(jù)和繪圖，并利用SPSS 18.0和正交設(shè)計(jì)助手軟件進(jìn)行方差分析。

2 ?結(jié)果與分析

2.1不同染色法測(cè)定馬蹄蓮花粉活力的效果

TTC染色的原理在于檢驗(yàn)花粉呼吸過程中脫氫酶的活性。具有活力的花粉呼吸作用較強(qiáng)，由于呼吸作用產(chǎn)生的氫能使無色的TTC還原成紅色的TTF，因此花粉被染成紅色;而無生命的花粉沒有呼吸代謝活力，TTC不被還原，因而不著色。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，TTC將馬蹄蓮花粉染成不同程度的紅色（深紅、淺紅和粉紅），只是顏色分界不明顯，如圖1A所示。

Lugols染色液法是利用碘遇淀粉變藍(lán)的原理來檢測(cè)花粉活力。有活力的花粉積累的淀粉多，遇到碘化鉀溶液可以被染成藍(lán)色;無活力的花粉積累的淀粉少，因而不著色。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示馬蹄蓮花粉均未染成藍(lán)色而呈黃褐色，可能是因?yàn)轳R蹄蓮花粉內(nèi)淀粉含量較少，不足以與碘化鉀反應(yīng)變色，如圖1B所示。

亞甲基藍(lán)是根據(jù)花粉胞質(zhì)的有無來判斷花粉活力，一般有活力的花粉胞質(zhì)豐富，花粉能被染成藍(lán)色;發(fā)育不完全沒有活力的花粉缺少胞質(zhì)，花粉不著色。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，馬蹄蓮花粉均被染成藍(lán)色，未成熟和敗育花粉也著色，可能是因?yàn)轳R蹄蓮花粉內(nèi)存在其他可以使亞甲基藍(lán)呈現(xiàn)藍(lán)色的物質(zhì)，如圖1C所示。

醋酸洋紅染色法是根據(jù)花粉對(duì)醋酸洋紅的吸附作用來判斷花粉活力。有活力的花粉細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)積累較多，對(duì)醋酸洋紅的吸附作用強(qiáng)，通常易被染成深紅色，沒有活力的花粉內(nèi)含物少，因而不著色。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示馬蹄蓮花粉均未被染成深紅色而呈染色液本身的顏色，可能是因?yàn)轳R蹄蓮花粉細(xì)胞壁過厚，醋酸洋紅染色液不能進(jìn)入花粉細(xì)胞從而不著色，如圖1D所示。

綜上，Lugols 染色液和醋酸洋紅染色液均沒有使花粉染上對(duì)應(yīng)的顏色;亞甲基藍(lán)染色液將檢測(cè)的所有花粉染成藍(lán)色，而TTC染色液將花粉染成不同程度的紅色，進(jìn)而區(qū)分花粉活力強(qiáng)弱。所以除TTC染色法外，Lugols染色液、醋酸洋紅和亞甲基藍(lán)染色法均不適合馬蹄蓮花粉活力的鑒定。

2.2離體培養(yǎng)法鑒定馬蹄蓮花粉活力的適宜培養(yǎng)基

花粉萌發(fā)結(jié)果顯示（表3），不同培養(yǎng)基下的白花馬蹄蓮花粉萌發(fā)率相差很大，其中組合5培養(yǎng)基80 g/L蔗糖+0.2 g/L硼酸+0.3 g/L硝酸鈣培養(yǎng)24 h的效果最好，白花馬蹄蓮花粉在培養(yǎng)24 h的萌發(fā)率為76.64%，其次是組合4的69.75%，組合1最弱，只有36.78%。

通過K₁、K₂、K₃的大小可以判斷各因素對(duì)花粉萌發(fā)率的影響程度。以花粉平均萌發(fā)率為試驗(yàn)指標(biāo)，根據(jù)極差值R的大小，可以判斷各因素對(duì)花粉萌發(fā)率的影響主次，由表3中的結(jié)果可見，極差值R由大到小依次為A>C>B，所以主次因素的影響順序?yàn)锳（蔗糖）>C（鈣）>B（硼酸）。

為判斷各因素對(duì)馬蹄蓮花粉萌發(fā)率的影響是否顯著，采用方差分析進(jìn)行檢驗(yàn)，精確評(píng)估各因素對(duì)花粉萌發(fā)率的影響程度。當(dāng)F值>F_0.05時(shí)，表明相對(duì)應(yīng)的因素達(dá)到顯著水平（P<0.05）。當(dāng)F值>F_0.01時(shí)，表明相對(duì)應(yīng)的因素達(dá)到極顯著水平（P<0.01）。由表4可知，各因素對(duì)花粉萌發(fā)率的影響順序?yàn)锳（蔗糖）>C（鈣）>B（硼酸），且F_A值>F_0.05，表明蔗糖濃度對(duì)花粉的萌發(fā)率影響較顯著（P<0.05），而因素B（硼酸）和因素C（鈣）對(duì)花粉萌發(fā)率的影響不顯著。因此試驗(yàn)最佳培養(yǎng)基組合為A₂B₃C₃，即80 g/L蔗糖+0.3?g/L硼酸+?0.3?g/L硝酸鈣。

2.3不同品種馬蹄蓮花粉的活力差異

由圖2可見，10個(gè)馬蹄蓮品種新鮮花粉在最佳組合培養(yǎng)基（80?g/L蔗糖+0.3?g/L硼酸+0.3 g/L硝酸鈣）中培養(yǎng)24 h的萌發(fā)率從高到低依次為白花馬蹄蓮>ym064>ym035>ym088>ym044> ym037> ym011>ym005>ym032>ym002。白花馬蹄蓮活力顯著（P<0.05）高于彩花馬蹄蓮;彩花馬蹄蓮中ym064顯著（P<0.05）高于其他品種，ym035與ym088、ym037與ym044、ym002和ym005與ym032之間花粉活力差異不顯著（P≥0.05）。

2.4花粉貯藏影響因子

2.4.1 ?花粉含水量、預(yù)凍方法及解凍方式對(duì)花粉貯藏活力的影響??以白花馬蹄蓮新鮮花粉作為材料，在室溫下干燥不同時(shí)間后，以不同的預(yù)凍方法處理后放入-80?℃冰箱貯藏72 h后，用不同的解凍方式處理，花粉活力測(cè)定結(jié)果表明（表5），不同處理方式對(duì)馬蹄蓮花粉的活力影響較大，其中組合⑦以室溫干燥27 h后直接放入-80?℃冰箱中貯藏，用37?℃水浴2 min解凍處理的萌發(fā)率最高，達(dá)到57.31%，其次是組合⑧的37.55%，組合⑤最弱，只有16.65%。

由表5極差分析可知，各因素對(duì)花粉萌發(fā)率影響的大小順序?yàn)椋篈?（干燥時(shí)間）>C?（解凍方法）>B?（預(yù)凍方法）。方差分析結(jié)果表明（表6），各因素的F值均小于F_0.05，干燥時(shí)間、預(yù)凍方法和解凍方法對(duì)花粉的萌發(fā)率影響均不顯著。

2.4.2??不同貯藏溫度對(duì)馬蹄蓮花粉活力的影響??由圖3A可知，白花馬蹄蓮新鮮花粉的活力最好，萌發(fā)率超過70%，室溫下貯藏10 d后仍有20%的萌發(fā)率。彩花馬蹄蓮ym064、ym035、ym088、

ym037和ym044新鮮花粉的活力較好，萌發(fā)率超過40%，室溫下貯藏10 d后除ym037萌發(fā)率降至6%外，其他品種花粉仍有15%的萌發(fā)率。而彩花馬蹄蓮ym011、ym032、ym005和ym002新鮮花粉的活力較弱，萌發(fā)率不到30%，室溫下貯藏10 d后萌發(fā)率只有6%，幾乎失活。

從圖3可以看出，4?℃貯藏10?d后，除白花馬蹄蓮與彩花馬蹄蓮ym064仍有20%以上的萌發(fā)率（圖3B），其余品種花粉的萌發(fā)率均不到15%。-20?℃下貯藏31?d后，彩花馬蹄蓮ym002、ym005、ym032、ym037和ym011萌發(fā)率已降至10%，將近失活;貯藏51 d后，除ym064仍有15%的萌發(fā)率外，其余品種的花粉萌發(fā)率均不到10%，61 d后所有品種花粉萌發(fā)率只有5%（圖3C）。-80?℃下貯藏61 d后，白花馬蹄蓮花粉仍有40.68%的萌發(fā)率，彩花馬蹄蓮ym064、ym035、ym044、ym037和ym088仍有20%的萌發(fā)率。彩花馬蹄蓮ym011、ym032、ym005和ym002的花粉在貯藏前萌發(fā)率較低，但其貯藏后的萌發(fā)率仍然超過10%（圖3D）。

此外，在相同貯藏條件下，不同馬蹄蓮花粉活力的變化明顯不同，其中白花馬蹄蓮的花粉活力最強(qiáng)，下降最慢;彩花馬蹄蓮ym005的花粉活力最弱，下降最快，同種花粉在不同貯藏條件下的活力也有顯著差異，說明花粉活力與貯藏溫度和花粉來源密切相關(guān)。

從圖4可見，馬蹄蓮花粉在室溫、4?℃、-20?℃和-80?℃下貯藏10 d后，-80?℃下貯藏的花粉平

-80?℃下貯藏的10個(gè)馬蹄蓮花粉，貯藏31?d時(shí)，其平均萌發(fā)率從44.39%下降到28.86%;貯藏61?d時(shí)，平均萌發(fā)率仍有22.77%。與-80?℃貯藏相比，-20?℃貯藏的馬蹄蓮花粉，其活力下降較快，51?d后花粉萌發(fā)率不到10%，61 d后花粉萌發(fā)率力只有3.61%。而室溫和4?℃貯藏的馬蹄蓮花粉，其萌發(fā)率在2 d前相差不大，4 d后4?℃的貯藏效果明顯低于室溫。

3 ?討論

本研究所采用的4種染色法中，除TTC染色法外的3種染色法均不適于馬蹄蓮花粉活力的測(cè)定，Lugols染色液及醋酸洋紅染色液均未能使馬蹄蓮花粉著色，可能是由于馬蹄蓮花粉的花粉壁對(duì)這2種溶液有限制作用，染色液不能穿過花粉壁進(jìn)入原生質(zhì)體，從而不能使花粉著色^[13]，也可能是馬蹄蓮花粉所含的淀粉較少，不能使Lugols染色液染色液變色;在亞甲基藍(lán)溶液作用下馬蹄蓮花粉均被染成藍(lán)色，說明沒有活力的花粉也有足夠的胞質(zhì)被亞甲基藍(lán)染色，所以此方法不能區(qū)分馬蹄蓮未成熟和敗育花粉;本研究中TTC染色時(shí)間過長(zhǎng)，如若大幅縮短染色時(shí)間，有可能會(huì)更好地分辨強(qiáng)活力、弱活力和無活力的花粉。染色法測(cè)定花粉活力雖然比實(shí)際值偏高，但快速便捷，在實(shí)際應(yīng)用中建議先用TTC染色法對(duì)馬蹄蓮花粉活力做定性分析，再用萌發(fā)法對(duì)花粉做定量分析。

花粉長(zhǎng)期冷凍貯藏時(shí)，其含水量與活力關(guān)系密切。含水量過高，花粉易受凍死亡喪失活力;含水量過低，花粉的代謝受到抑制則影響活力^[14]。因此，花粉只有在適宜的含水量下貯藏才會(huì)持久的保持其活力^[15]。芍藥花粉超低溫保存效果最好的含水量為12%左右^[16];山茶花粉超低溫保存效果最好的含水量為15%～23%^[17];枇杷花粉超低溫保存效果最好的含水量為30%左右^[18];部分梅花在含水量高達(dá)40%時(shí)仍然可以進(jìn)行超低溫保存^[19]。本研究用不同干燥時(shí)間區(qū)分花粉含水量，并發(fā)現(xiàn)馬蹄蓮花粉干燥27 h后在低溫貯藏環(huán)境中仍能保持較高的活力。有研究發(fā)現(xiàn)，干燥溫度越低，花粉的失水速度越慢，細(xì)胞自由水含量也較高，花粉在低溫貯藏過程中更易形成細(xì)胞內(nèi)結(jié)晶，引起細(xì)胞破裂，導(dǎo)致花粉活力降低^[20-21]。本研究在室內(nèi)（室溫18～25?℃）干燥花粉，室內(nèi)空氣濕度差異也可能對(duì)花粉的失水程度產(chǎn)生影響，因此，后續(xù)研究有必要將空氣濕度考慮在內(nèi)。

預(yù)凍處理對(duì)花粉活力的影響因品種而異。桃、梨花粉和人參花粉的超低溫貯藏效果不受預(yù)凍處理的影響^[22-23];山茶和番茄花粉的超低溫貯藏效果因預(yù)凍處理而顯著提高^{[17， 24]};芍藥和臘梅花粉的超低溫貯藏效果則因預(yù)凍處理而顯著降低^{[16， 25]}。本研究中馬蹄蓮花粉的貯藏效果不受預(yù)凍處理的影響，與桃、梨和人參花粉的研究結(jié)果相一致^[22-23]。

解凍過程是維持馬蹄蓮貯藏活力關(guān)鍵的一步，芍藥和番茄花粉超低溫保存后自來水沖洗的解凍方法效果較好^{[16， 24]}，而地被菊和山茶花粉超低溫保存后溫水浴和冰化的解凍方法效果較好^{[12， 17]}。本研究中馬蹄蓮花粉低溫貯藏后采用何種解凍方法對(duì)其萌發(fā)率的影響都不顯著。

低溫可以抑制花粉代謝活性進(jìn)而延長(zhǎng)花粉的貯藏期限。王欽麗等^[2]研究表明，在超低溫度（-270～-180?℃）下花粉的生活力可以長(zhǎng)期維持。一般來說，耐寒植物花粉萌發(fā)的適溫較低，而喜溫植物花粉萌發(fā)適溫較高。馬蹄蓮喜溫暖濕潤(rùn)和陽光充足的環(huán)境，不耐寒也不耐旱，其生長(zhǎng)開花均需要相對(duì)高的溫度。本研究中，室溫下馬蹄蓮花粉的貯藏效果要稍好于4?℃低溫，說明馬蹄蓮花粉在常溫條件下耐貯性較好，這與馬蹄蓮適宜的生長(zhǎng)溫度一致，此結(jié)果也與周滌等^[7]的研究結(jié)果相一致;-20?℃下花粉的貯藏效果則優(yōu)于室溫;-80?℃下花粉貯藏61?d后仍有活力，貯藏效果顯著高于其他3種溫度，與山茶和百合花粉的研究結(jié)果相一致^{[17， 21]}。

本研究從干燥時(shí)間、預(yù)凍處理、解凍方式和溫度4個(gè)主要因素測(cè)定了馬蹄蓮花粉低溫貯藏的效果，探明這些因子對(duì)馬蹄蓮低溫貯藏的影響，至于馬蹄蓮花粉貯藏的低溫極限，在超低溫保存中是否會(huì)出現(xiàn)迎春、紫葉桃等花粉超低溫保存的“冷刺激”現(xiàn)象^[15]有待進(jìn)一步研究。

參考文獻(xiàn)

[1]?吳紅芝， 石景峰， 鄭思鄉(xiāng)， 等. 彩色馬蹄蓮2n花粉誘導(dǎo)及其三倍體植株的獲得[J]. 農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào)， 2011， 19（4）： 662-668.

[2]?王欽麗， 盧龍斗， 吳小琴， 等. 花粉的保存及其生活力測(cè)定[J]. 植物學(xué)通報(bào)， 2002（3）：?365-373.

[3]?Mathad R C， Vasudevan S N， Patil S B. Cryo-preservation of pollen for hybrid seed production in hot pepper[M]// Pros pe cts in Bioscience：?Addressing the Issues. India： Springer， 2012： 273-276.

[4]?Honda K， Watanabe H， Tsutsui K. Cryopreservation of Delphinium pollen?at -30?℃[J]. Euphytica， 2002， 126（3）： 315-?320.

[5]?Alba V， Bisignano V， Alba E，et al. Effects of cryopreservation on germination ability of olive （Olea europaeaL.） pollen[J]. Genetic Resources and Crop Evolution， 2011， 58（7）：?977-982.

[6]?Yuan S C， Chin S C， Lee C Y，et al. Phalaenopsis pollinia storage at sub-zero and its pollen viability assessment[J]. Botanical Studies， 2018， 59（1）：?1-8.

[7]?周??滌， 王??賢. 11種彩色馬蹄蓮種質(zhì)花粉生活力測(cè)定初報(bào)[C]//2007年中國(guó)園藝學(xué)會(huì)觀賞園藝專業(yè)委員會(huì)年會(huì)論文集， 北京： 中國(guó)林業(yè)出版社， 2007（3）： 127-129.

[8]?胡 ?春， 劉左軍， 李富香， 等. 鈍裂銀蓮花花粉活力測(cè)定方法的研究[J]. 植物研究， 2013， 33（5）：?582-586.

[9]?楊 ?紅， 余和明， 李小艷， 等.?獼猴桃花粉生活力測(cè)定方法及花藥處理方法研究[J]. 北方園藝， 2015（8）：?36-39.

[10]許銀鳳， 尹子麗. 瀕危藥用植物金鐵鎖花粉活力快速測(cè)定研究[J]. 云南中醫(yī)中藥雜志， 2018， 39（7）：?69-70.

[11]于曉英， 盧向陽， 龔明福， 等. 瓜葉菊花粉生活力研究[J]. 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版）， 2005， 31（1）：?42-46.

[12]呂晉慧， 趙 ?耀， 王 ?媛， 等. 地被菊花粉活力和儲(chǔ)藏性研究[J]. 園藝學(xué)報(bào)， 2012， 39（12）：?2483-2490.

[13]李 ?琳， 谷 ?巍， 巢建國(guó)， 等. 瀕危藥用植物茅蒼術(shù)花粉形態(tài)、活力測(cè)定及貯存研究[J]. 中國(guó)中藥雜志， 2012， 37（11）：?1546-1549.

[14]胡適宜， 楊弘遠(yuǎn).被子植物受精生物學(xué)[M]. 北京：?科學(xué)出版社， 2002： 29-58.

[15]徐 ?瑾. 玉蘭花粉超低溫保存機(jī)制研究[D]. 北京： 北京林業(yè)大學(xué)， 2014.

[16]尚曉倩. 芍藥花粉超低溫保存研究[D]. 北京： 北京林業(yè)大學(xué)， 2005.

[17]李廣清. 山茶花粉超低溫保存研究[D]. 北京： 北京林業(yè)大學(xué)， 2005.

[18]王家福， 劉月學(xué)， 劉小軍， 等. 枇杷花粉干凍法超低溫保存研究[J]. 中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào)， 2004， 20（1）：?1-2， 20.

[19]張亞利， 陳瑞丹， 張 ?波， 等. 超低溫保存的梅花花藥萌發(fā)率和授粉后的結(jié)實(shí)能力[J]. 植物生理學(xué)通訊， 2007， 43（3）：?457-460.

[20]古??吉， 喬??雨， 鄭昀曄， 等. 干燥條件及貯藏時(shí)間對(duì)煙草花粉活力的影響[J]. 中國(guó)煙草科學(xué)， 2018， 39（6）：?7-12.

[21]趙嬋璞， 張泉衛(wèi)， 史寶勝， 等. 有斑百合花粉低溫貯藏研究[J]. 河北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)， 2014， 37（1）：?54-58.

[22]江雨生. 桃、梨花粉的超低溫貯藏[J]. 中國(guó)果樹， 1989（3）：?50-51.

[23]張連學(xué)， 常維春， 魏云潔， 等. 人參、西洋參花藥超低溫保存對(duì)花粉存活的影響[J]. 植物學(xué)通報(bào)， 1993（2）： 58-59.

[24]趙樹仁， 武麗英， 姚民昌， 等. 番茄花粉超低溫保存的研究[J]. 園藝學(xué)報(bào)， 1993， 20（1）：?66-70.

[25]陳 ?珊. 蠟梅屬植物花粉低溫及超低溫保存研究[D]. 武漢： 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)， 2005.