孫銘艷 吳倩倩 陶元勇

肺炎克雷伯菌是醫(yī)院感染的重要病原菌，可引起身體各部位感染[1]。臨床醫(yī)生曾將碳青霉烯類藥物作為治療耐藥肺炎克雷伯菌感染的最后一道防線，但由于抗菌藥物的不規(guī)范使用，碳青霉烯耐藥肺炎克雷伯菌(carbapenem-resistant klebsiella pneumoniae，CR-KP)不斷增多[2]。2008年，印度攜帶新德里金屬-β-內(nèi)酰胺酶-1(New Delhi metallo-βlactamase-1，NDM-1)耐藥基因的“超級細菌”的報道引發(fā)全球廣泛關(guān)注[3]。我國耐藥形勢同樣不容樂觀，2017年中國細菌耐藥監(jiān)測數(shù)據(jù)顯示，肺炎克雷伯菌對碳青霉烯類藥物亞胺培南和美羅培南的耐藥率均已超20%[4]。耐藥菌的出現(xiàn)增加了患者負擔，給臨床治療帶來極大困難。

CR-KP的耐藥機制包括產(chǎn)碳青霉烯酶、高產(chǎn)AmpCβ-內(nèi)酰胺酶(AmpC酶)、超廣譜β-內(nèi)酰胺酶(ESBLs)合并膜孔蛋白缺失及外排泵的過度表達，產(chǎn)碳青霉烯酶是其最主要的耐藥機制[5]。碳青霉烯酶包括A類酶、B類酶和D類酶，不同種類的碳青霉烯治療方案不同，準確和快速地檢測碳青霉烯酶并加以正確的臨床治療可減緩細菌耐藥的產(chǎn)生。為此，系統(tǒng)綜述碳青霉烯酶實驗室檢測方法，為碳青霉烯酶的檢測提供依據(jù)。

1 碳青霉烯酶表型檢測方法

實驗室常規(guī)工作中，可通過紙片擴散法(K-B法)或稀釋法(MIC法)檢測細菌對碳青霉烯類藥物的敏感性初步篩查碳青霉烯酶[6]。但該方法容易造成漏檢，需借助其他檢測方法進行確認。表型檢測方法簡單、易于觀察，包括培養(yǎng)基篩查、改良霍奇試驗(modified Hodge test，MHT)、Carba NP試驗、碳青霉烯滅活試驗(carbapenem inactivation method，CIM)和基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜(matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry，MALDI-TOF MS)。

1.1 培養(yǎng)基篩查

顯色培養(yǎng)基利用細菌產(chǎn)生的碳青霉烯酶使培養(yǎng)基的顯色劑發(fā)生顏色變化來進行判斷。ChromID ESBLs培養(yǎng)基最早用于ESBLs的檢測，隨后用于檢測碳青霉烯酶，可有效檢測碳青霉烯酶的A類酶和B類酶，對D類酶的篩查作用較小[7]?？岂R嘉KPC顯色培養(yǎng)基能快速篩查出產(chǎn)碳青霉烯酶菌株，但無法通過顯色反應(yīng)區(qū)分碳青霉烯酶的A類酶和B類酶。Hornsey等[8]在進行顯色培養(yǎng)基比對時發(fā)現(xiàn)，當菌落數(shù)＞106CFU/ml時，該培養(yǎng)基也能有效篩查產(chǎn)D類酶的肺炎克雷伯菌。SUPERCARBA培養(yǎng)基是2012年Nordmann等[9]研發(fā)的一種非顯色培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基對常見碳青霉烯酶的檢測能力明顯改善，能檢測A類、B類和D類碳青霉烯酶。

除SUPERCARBA培養(yǎng)基外，其他培養(yǎng)基不能有效檢測D類碳青霉烯酶。此外篩查的陽性菌株還需通過分子技術(shù)進行確認，增加了時間與經(jīng)濟成本，使用上受到一定限制[10]。

1.2 改良霍奇試驗(MHT)

MHT可用于檢測A類、B類和D類碳青霉烯酶[11]。操作簡單，結(jié)果易于觀察，常規(guī)實驗室即可開展，見圖1。

圖1 改良霍奇試驗(MHT)

圖1顯示，受試菌產(chǎn)生碳青霉烯酶，使擴散到培養(yǎng)基中的厄他培南失活。因此C處無足夠量厄他培南抑制大腸埃希菌ATCC25922生長，出現(xiàn)抑菌圈凹進現(xiàn)象。但MHT在檢測產(chǎn)ESBLs或AmpC酶合并膜孔蛋白缺失的菌株時易出現(xiàn)假陽性結(jié)果，檢測產(chǎn)NDM型金屬酶時可出現(xiàn)假陰性結(jié)果。2018年，美國臨床和實驗室標準協(xié)會(Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI)已將MHT從抗微生物藥物敏感性試驗執(zhí)行標準(CLSI M100)中刪除。

1.3 Carba NP試驗

Carba NP試驗方法于2012年由Patrice Nordmann研究團隊首次報道[12]。2015年CLSI新增Carba NP試驗用于檢測碳青霉烯酶。該方法利用酚紅作為指示劑，采用比色法，檢測常見碳青霉烯酶耐藥表型的特異性及靈敏度均大于90%[13]。Carba NP陽性菌株無需修改碳青霉烯類藥物的藥敏試驗結(jié)果，主要用于院感監(jiān)測及流行病學(xué)調(diào)查。目前沒有推薦此試驗作為常規(guī)試驗。其不足之處在于：①需要特殊試劑；②某些檢測結(jié)果無效；③無法區(qū)分碳青霉烯酶型別等。

1.4 碳青霉烯滅活試驗(CIM)

CIM于2015年由荷蘭van der Zwaluw研究團隊首次報道，可在較短時間內(nèi)檢測碳青霉烯酶，且對常見碳青霉烯酶的耐藥表型與聚合酶鏈式反應(yīng)(polymerase chain reaction，PCR)檢測結(jié)果具有高度一致性，特異度為95.5%，靈敏度為95.7%[14]。2017年CLSI引入改良CIM(modified carbapenem inactivation method，mCIM)用于檢測腸桿菌科細菌產(chǎn)碳青霉烯酶的表型確認，其與CIM的不同之處在于菌懸液所用的實驗室用水由胰蛋白酶大豆肉湯取代，加入美羅培南藥敏紙片后，孵育時間也從2 h延長至4 h。操作方法見圖2。

圖2 改良碳青霉烯(mCIM)的滅活方法及操作方法

mCIM減少了ESBL或AmpC所致的假陽性結(jié)果，對非產(chǎn)碳青霉烯酶的耐碳青霉烯類抗菌藥物腸桿菌科細菌識別能力更強，對D類酶敏感性較高。但不足之處在于其不能區(qū)分碳青霉烯酶的耐藥型別。為彌補這一不足，2018年CLSI引入EDTA改良碳青霉烯滅活試驗(EDTA-carbapenem inactivation method，eCIM)，通過加入乙二胺四乙酸(EDTA)抑制金屬酶活性，與mCIM試驗聯(lián)合，用以判斷產(chǎn)酶情況及區(qū)分金屬酶和絲氨酸酶[16]。CIM試驗操作簡便、成本低且結(jié)果易于判斷，對A類酶、B類酶和D類酶的敏感性高。但試驗孵育耗時長，不能實現(xiàn)快速檢測的目的，因此尚未在臨床微生物實驗室常規(guī)開展[17]。

1.5 MALDI-TOF MS檢測

MALDI-TOF MS是一種新型軟電離生物質(zhì)譜，其原理是離子在電場作用下加速通過飛行通道，根據(jù)到達檢測器的飛行時間不同，即測定離子的質(zhì)荷比(m/z)與離子的飛行時間成正比來對離子進行檢測，具有檢測速度快、靈敏度高和易于自動化等優(yōu)點。MALDI-TOF MS的快速檢測對于急性病例和特殊病原體的及時、準確鑒定及細菌耐藥檢測方面的應(yīng)用具有較好發(fā)展前景[18]。目前，MALDI-TOF MS已被用于產(chǎn)碳青霉烯酶菌株的檢測，具體方法為：將含有碳青霉烯類藥物的緩沖液與過夜培養(yǎng)的檢測菌共同孵育4 h后，離心取上清進行檢測。通過對比碳青霉烯類藥物與其降解產(chǎn)物質(zhì)譜峰值的變化來判斷有無碳青霉烯酶產(chǎn)生，但無法區(qū)分碳青霉烯酶型別。MALDI-TOF MS對細菌耐藥的檢測有助于臨床抗感染治療，缺點為儀器昂貴，常規(guī)實驗室難開展[19]。

2 分子技術(shù)

已有的表型檢測方法不能完全區(qū)分碳青霉烯酶型別，且檢測結(jié)果需用分子技術(shù)進行驗證。傳統(tǒng)PCR通量低、耗時長、實驗操作繁瑣及產(chǎn)物易污染等缺點制約了其在實驗室的應(yīng)用。近年來，開發(fā)一系列新型分子技術(shù)用以檢測碳青霉烯酶，包括實時熒光定量PCR、多重PCR、環(huán)介導(dǎo)等溫擴增法、基因芯片和二代測序(next-generation sequencing，NGS)。

2.1 實時熒光定量PCR

實時熒光定量PCR將熒光染料或熒光探針加入到PCR反應(yīng)體系中，通過將實時監(jiān)測到的熒光信號與校準品進行比較，得出相應(yīng)檢測結(jié)果。Higuchi等于1993年最早提出該方法，美國Perkin Elmer公司于1995年成功研發(fā)該新技術(shù)[20]。實時熒光定量PCR克服傳統(tǒng)PCR的諸多不足，且檢測結(jié)果與傳統(tǒng)PCR具有較高一致性。此外，該方法的檢測下限較低，可直接用于臨床標本的產(chǎn)碳青霉烯酶菌株耐藥基因的定性及定量檢測[21]。

2.2 多重PCR

多重PCR是將多對特異性引物同時加入到一個反應(yīng)體系中，循環(huán)條件滿足所有引物，目的基因擴增后存在易分辨和識別的差異，可實現(xiàn)在一個反應(yīng)中同時檢測多個目的基因。Monteiro等[22]首次報道使用實時多重PCR的方法，通過一個單獨的反應(yīng)進行熔化曲線分析，在3 h內(nèi)快速并準確的完成碳青霉烯酶耐藥基因，即NDM、KPC、GES、IMP、VIM和OXA-48的分析，方法的另敏度與特異度均為100%。其還可用于臨床標本耐藥基因的直接篩查。多重PCR具有高通量、高效率的優(yōu)勢，但需配備專業(yè)的技術(shù)人員與設(shè)備。

2.3 環(huán)介導(dǎo)等溫擴增法

環(huán)介導(dǎo)等溫擴增法是由Notomi等[23]研發(fā)的一種新型核酸擴增技術(shù)。針對目的基因的6個特異性序列設(shè)計2對引物，在鏈置換DNA聚合酶的作用下，1 h可將目的基因擴增109～1010倍，整個反應(yīng)在等溫條件60～65 ℃下進行，實現(xiàn)了特異和高效擴增，并可通過肉眼觀察反應(yīng)副產(chǎn)物焦磷酸鎂沉淀判斷結(jié)果。與多重PCR不同的是，該方法可改變其條件及引物檢測新的基因，在某些反應(yīng)中對新基因及靶位的檢測敏感性高，還可用于檢測臨床標本的碳青霉烯酶耐藥基因[24-25]。

2.4 基因芯片

基因芯片是一種通過與已知序列的核酸探針雜交進行核酸序列測定的分子技術(shù)。此技術(shù)易于商品化，在微生物鑒定及耐藥檢測領(lǐng)域得到良好應(yīng)用。Braun等[26]用基因芯片對117株包括腸桿菌科細菌在內(nèi)的臨床分離菌進行菌株鑒定及碳青霉烯酶等耐藥基因的檢測，檢測靈敏度為98.2%，特異度為97.4%。

2.5 二代測序(NGS)

NGS是生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的一項重要變革，目前已被廣泛用于疾病篩查及診斷、微生物鑒定、耐藥基因檢測及藥物研發(fā)等醫(yī)學(xué)領(lǐng)域[27-28]。其原理是在每一個測序周期中，利用計算機檢測DNA聚合酶催化熒光標記的脫氧核糖核苷三磷酸結(jié)合到DNA模板時產(chǎn)生的熒光信號來確定DNA序列，實現(xiàn)了邊合成邊測序。在碳青霉烯酶耐藥基因檢測方面，既可對常規(guī)培養(yǎng)菌株進行檢測，也可直接對臨床標本進行檢測，有效縮短檢測時間[29]。此外，NGS不僅能檢測已知的碳青霉烯酶耐藥基因，還能明確由非產(chǎn)酶原因即膜孔蛋白的缺失和外排泵的過度表達導(dǎo)致的碳青霉烯類藥物耐藥[30]。

3 展望

抗菌藥物的不合理使用使細菌的耐藥形勢尤其是碳青霉烯類藥物的耐藥形勢日趨嚴峻。針對耐藥菌，在有效的新型抗菌藥物上市前及時并準確地檢測，對感染的有效治療及耐藥菌的傳播尤為重要。

在肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶表型檢測方法中，各項試驗原理一致，均利用碳青霉烯酶水解碳青霉烯類藥物的活性進行設(shè)計，其特異性高，但對于低表達或水解活性低的碳青霉烯酶檢測的敏感性差。目前，CLSI推薦Carba NP試驗和CIM試驗用于碳青霉烯酶表型檢測。利用分子技術(shù)檢測碳青霉烯酶均為耐藥基因的直接檢測，不僅能檢測碳青霉烯酶，還能進行酶的分型。而NGS在此基礎(chǔ)上所獲信息更全面，還能檢測未知的耐藥基因。隨著技術(shù)發(fā)展及成本的下降，NGS將有廣闊的發(fā)展前景。