楊珣 饒珊珊 張湘燕,3△

1.遵義醫(yī)科大學(xué)研究生院,貴州 遵義 553000；2.貴州省人民醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科,貴州 貴陽 550002；3.貴州大學(xué)醫(yī)學(xué)院,貴州 貴陽 550025)

百草枯(PQ)作為一種有效的除草劑,已廣泛應(yīng)用于農(nóng)田和牧場,具有顯著的除草效果。百草枯化學(xué)名稱為1-1-二甲基-4-4-聯(lián)吡啶陽離子鹽,對人體有很強(qiáng)的毒性[1],特別是在口服中毒情況下,由于無有效的治療手段,死亡率高達(dá)90%[2]。臨床病例顯示,PQ可導(dǎo)致多個器官損傷,特別是肺損傷,PQ可引起肺泡上皮損傷甚至死亡,隨著肺泡細(xì)胞的破壞,進(jìn)一步出現(xiàn)肺毛細(xì)血管破裂導(dǎo)致肺泡內(nèi)出血和肺部感染,最后發(fā)生肺纖維化[3]。目前PQ引起死亡的機(jī)制已初步闡明,但是 PQ引起肺纖維化的機(jī)制并沒有澄清。利用大鼠建立百草枯模型穩(wěn)定可靠,比較符合百草枯致人肺纖維化病理特點(diǎn)。我們綜述了百草枯致大鼠肺纖維化的研究現(xiàn)狀,以期對為闡明百草枯致肺纖維化的發(fā)病機(jī)制提供參考,并為后續(xù)治療提供方向。

1 百草枯致大鼠肺纖維化發(fā)病機(jī)制

1.1肺泡損傷 大量實(shí)驗(yàn)[4-6]顯示,按照百草枯15 mg/Kg劑量進(jìn)行大鼠肺纖維化模型構(gòu)建,效果較好,觀察PQ染毒大鼠肺組織病理變化,發(fā)現(xiàn)肺纖維化的發(fā)生主要有3個環(huán)節(jié):肺泡的免疫和炎癥反應(yīng)—肺實(shí)質(zhì)損傷—受損肺泡修復(fù)和纖維化。許多肺部疾病均可導(dǎo)致肺纖維化重塑,肺損傷的起源尚不清楚,但肺泡上皮II型(AE2)細(xì)胞在肺纖維化中起著關(guān)鍵作用,它們對上皮細(xì)胞再生、肺泡穩(wěn)定和與成纖維細(xì)胞相互作用有重要影響,而這些被認(rèn)為是膠原沉積的原因,最終引起肺泡上皮持續(xù)損傷、再生能力受損、肺泡塌陷,導(dǎo)致肺纖維化[7]。

1.2氧化損傷 百草枯中毒造成的肺損傷主要與活性氧、過度脂質(zhì)過氧化反應(yīng)所產(chǎn)生的脂質(zhì)過氧化氫物及谷胱甘肽含量減少有關(guān)。百草枯中毒時,百草枯與NAD(P)H在NAD(P)H氧化酶作用下,生成百草枯基團(tuán)和NAD(P)+,同時氧被還原成超氧陰離子。肺上皮細(xì)胞胞漿中具有較多的對二苯基敏感的NAD(P)H:百草枯氧化還原酶,此酶在NAD(P)H存在情況下,利用氧,生成百草枯亞基團(tuán),導(dǎo)致肺損傷。在細(xì)胞中提取的百草枯還原酶包含硫氧還原蛋白還原酶的活性,可以保護(hù)細(xì)胞不受氧化應(yīng)激損傷[8]。提示氧化損傷是引起肺損傷致肺纖維化的重要因素。既往研究發(fā)現(xiàn)[9]：在大鼠百草枯中毒中,肺組織和BALF中的丙二醛(MDA)、羥脯氨酸(HYP)、白介素-6(IL-6)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)水平都升高,SOD和GSH-PX活性降低；肺組織中TGF-β1、MMP-2、TIMP-1 mRNA也升高。其他研究也發(fā)現(xiàn),百草枯中毒大鼠血清新喋呤水平與LDH活性、肺丙二醛、TGF-β1及肺損傷程度相關(guān),再次證實(shí)氧化應(yīng)激、抗氧化能力降低和炎癥在百草枯誘導(dǎo)的肺損傷中起到重要作用,同時提示新喋呤水平升高程度可能成為百草枯中毒的一個預(yù)后評估參數(shù)[10]。實(shí)驗(yàn)證明PQ中毒后2h內(nèi)TSP-1、CD 47表達(dá)與肺組織中活性氧(ROS)、羥自由基、丙二醛及肺泡炎癥程度呈正相關(guān),PQ中毒后1d TSP-1、CD 47表達(dá)與肺組織羥脯氨酸濃度呈正相關(guān),提示TSP-1和CD 47的表達(dá)與氧化應(yīng)激有關(guān),進(jìn)而導(dǎo)致大鼠肺泡炎及肺纖維化的發(fā)生發(fā)展[11]。

1.3內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激 研究發(fā)現(xiàn)百草枯暴露于體外和體內(nèi),會導(dǎo)致線粒體DNA(mtDNA)損傷及線粒體功能障礙,mtDNA以無堿性位點(diǎn)的形式受損,受損原因與氧化損傷相關(guān)[12]。有研究[5]發(fā)現(xiàn),百草枯中毒大鼠肺組織α-SMA、糖原相關(guān)蛋白78(GRP78)表達(dá)上調(diào),提示內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激在百草枯中毒大鼠肺纖維化中起到重要作用。盡管哺乳動物細(xì)胞對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡(未折疊蛋白反應(yīng))有防御機(jī)制,但百草枯中毒改變了未折疊蛋白相關(guān)分子的表達(dá)水平,導(dǎo)致在人肺上皮A549細(xì)胞中發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)細(xì)胞死亡,而?；切苋パ跄懰徕c(TUDCA)能夠減輕百草枯誘導(dǎo)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激而抑制細(xì)胞死亡,減輕肺損傷[13]。

1.4信號通路 PQ染毒的大鼠肺組織中TGF-β1明顯升高,研究已經(jīng)表明TGF-β1/Smads 信號通路的激活在PQ 引起的肺纖維化發(fā)病中具有十分重要的作用[14]。除此之外,上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)換(EMT)被認(rèn)為參與了百草枯(PQ)誘導(dǎo)的肺纖維化過程,但這一過程的分子機(jī)制尚未明確。研究發(fā)現(xiàn)PQ誘導(dǎo)的上皮RLE-6NT細(xì)胞發(fā)育間充質(zhì)細(xì)胞特征,上皮標(biāo)記物E-cadherin顯著減少,細(xì)胞外基質(zhì)標(biāo)記物α-平滑肌肌動蛋白呈劑量和時間依賴性增加。此外,PQ處理的RLE-6NT細(xì)胞具有EMT樣表型,MMP-2、MMP-9、COL I和COLⅢ表達(dá)增高,遷移能力增強(qiáng),這些都導(dǎo)致肺纖維化的發(fā)生,而PQ誘導(dǎo)的EMT通過激活MAPK通路導(dǎo)致erk-1和smad2磷酸化,表明PQ誘導(dǎo)的肺纖維化是通過由MAPK途徑介導(dǎo)EMT發(fā)生的。MAPK通路可能是肺纖維化發(fā)生的原因,且是肺泡上皮細(xì)胞的一個有前途的治療靶點(diǎn)[15]。

1.5其他細(xì)胞因子 PQ染毒大鼠中,結(jié)締組織生長因子(CTGF)表達(dá)增加, CTGF是一種重要的生長因子,參與組織修復(fù)和纖維化的發(fā)生,可以觸發(fā)肺成纖維細(xì)胞的增殖、遷移,誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞分化,引起α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)和膠原的表達(dá)增加,提示 CTGF可能在PQ誘導(dǎo)的肺纖維化中起重要作用[16]。同樣觀察到在隨PQ中毒大鼠肺纖維化進(jìn)程中,整合素連接激酶(ILK) 的mRNA和蛋白表達(dá)增加,ILK在肺纖維化形成中可能起著重要作用[17]。上述研究提示CTGF、ILK可能是PQ中毒致肺纖維化的關(guān)鍵分子靶點(diǎn)。

2 抗纖維化治療進(jìn)展：

2.1血管緊張素II的抑制 氯沙坦是一種血管緊張素II 1型受體拮抗劑,對纖維化的治療有積極作用。有實(shí)驗(yàn)探究了氯沙坦對PQ中毒大鼠肺纖維化的影響,發(fā)現(xiàn)氯沙坦能顯著降低PQ染毒鼠肺組織中羥脯氨酸含量和下調(diào)TGF-β1、MMP9和TIMP-1的mRNA和I型和III型膠原的表達(dá)。PQ組大鼠的組織學(xué)檢查顯示肺損傷和肺泡間隙廣泛的炎性細(xì)胞浸潤和肺纖維化,而氯沙坦可明顯減輕這種損傷并預(yù)防肺纖維化。結(jié)果表明,氯沙坦能減輕肺損傷,預(yù)防肺纖維化[18]。而這種抗纖維化作用可能是因?yàn)檠芫o張素II的抑制[19]。以往的研究[20]表明,從中藥丹參中分離得到的活性化合物丹參酮IIA (TiIA)能有效地減輕博萊霉素誘導(dǎo)的大鼠肺纖維化,然而,Tiia是否能減輕百草枯(PQ)所致的急性肺損傷(ALI)尚未確定。PQ可引起B(yǎng)ALF組織學(xué)改變,增加中性粒細(xì)胞浸潤、肺濕/干重比、細(xì)胞總數(shù)、蛋白含量和LDH水平,同時顯著降低肺組織ACE 2和Ang-(1-7)的表達(dá)水平,研究表明 Tiia減弱了這些作用,提示Tiia可能對PQ誘導(dǎo)的大鼠ALI有治療作用,ACE 2和Ang-(1-7)可能參與了這種作用的機(jī)制。

2.2過氧化物酶體增殖劑激活受體-γ(PPAR-γ) PPAR-γ是一類配體激活的核轉(zhuǎn)錄因子超家族成員,在炎癥的發(fā)生中有著重要的調(diào)節(jié)作用。羅格列酮是一種PPAR-γ激動劑,能恢復(fù)PQ引起的動脈血氧分壓(PaO 2)下降、濕干(W/D)肺組織重量比(W/D)升高和肺纖維化評分,抑制PQ誘導(dǎo)的PPAR-γ和α-SMA蛋白和mRNA水平的降低。提示羅格列酮通過上調(diào)PTEN和下調(diào)轉(zhuǎn)化生長因子-β1的表達(dá),以PPAR-γ依賴的方式減輕PQ誘導(dǎo)的肺纖維化[21]。阿托伐他汀是一種PPAR-γ受體拮抗劑,除具有降膽固醇作用外,還具有抗炎和抗氧化的作用。有學(xué)者使用阿托伐他汀治療百草枯染毒的大鼠,測定血清丙二醛(Lung hydroxyproline)和肺指數(shù)及半定量組織病理學(xué)變化。發(fā)現(xiàn)阿托伐他汀對百草枯誘導(dǎo)的大鼠肺纖維化有良好的預(yù)防作用,而它同樣通過拮抗PPAR-γ降低TGF-β1表達(dá)水平,從而在百草枯中毒中起到了的抗纖維化作用[22]。以上研究提示PPAR-γ的研究可能為治療肺纖維化帶來新的方向,其機(jī)制可能與PPAR-γ拮抗劑拮抗TGF-β1的表達(dá)有關(guān)。

2.3中藥抗炎、抗氧化治療 百草枯致肺纖維化暫無有效治療方法,其中中藥治療是目前一種治療手段。已證明依達(dá)拉奉可通過抗氧化的方式減輕肺纖維化,研究者對比了銀杏葉二萜注射液(DGMI)和依達(dá)拉奉對百草枯(PQ)所致大鼠肺損傷和肺纖維化的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)DGMI可以降低PQ中毒大鼠白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)、白細(xì)胞介素-6(IL-6)和腫瘤壞死因子-α(TNF-α)水平,逆轉(zhuǎn)肺組織中丙二醛(MDA)水平的升高和超氧化物歧化酶(SOD)水平的下降,顯著提高PQ中毒大鼠的存活率,治療效果更好[23]。黃芪總黃酮(FAC)也可以改善血清中的抗氧化酶活性,減輕纖維化程度和纖維化程度。FAC可能是通過抑制TGF-β/SMAD信號通路減輕了PQ誘導(dǎo)的大鼠肺纖維化[24]。姜黃素為二酮類化合物,具有降血脂、抗腫瘤、抗炎、抗氧化等作用,有研究者使用姜黃素治療百草枯染毒的大鼠,發(fā)現(xiàn)治療組大鼠PaCO 2、血清Smad 4、Smurf 2和IL-4均低于百草枯組,證明姜黃素能減少PQ中毒大鼠肺組織膠原纖維沉積,有效改善百草枯中毒大鼠的肺纖維化[25-26]。也有研究發(fā)現(xiàn)七葉皂甙鈉[27]、冬蟲夏草[28]可通過抗炎作用減輕肺損傷。

2.4苯丙胺類興奮劑 苯丙胺類興奮劑可減輕PQ中毒所致的肺損傷和肺纖維化。這種效應(yīng)是劑量依賴性的。ATS治療可通過增加上皮標(biāo)記物E-cadherin和ZO-1的水平,降低肺組織和體外細(xì)胞培養(yǎng)中間充質(zhì)標(biāo)記物α、SMA和波形蛋白的表達(dá)而減輕EMT的發(fā)生。此外,苯丙胺類藥物在體內(nèi)和體外還可能降低HIF-1α和β-catenin的水平。因此苯丙胺類興奮劑可減輕PQ誘導(dǎo)的肺纖維化的機(jī)制可能與下調(diào)缺氧缺血性腦病(HIF-1)α/β-catenin通路和抑制苯丙胺類興奮劑(ATS)誘導(dǎo)的EMT有關(guān),苯丙胺類興奮劑可作為治療PQ中毒所致肺纖維化的藥物[29]。

2.5亞氧苯胺羥肟酸(Saha) 最近的研究表明,組蛋白去乙酰化酶抑制劑亞氧苯胺羥肟酸(Saha)具有抗纖維化作用。但其抗纖維化的確切機(jī)制尚不清楚。我國學(xué)者發(fā)現(xiàn)SAHA通過抑制TGF-β1誘導(dǎo)的HDAC1活性來阻止Smad7的去乙?；?提高Smad7蛋白水平,加強(qiáng)Smad7 TGF-β1/Smads信號通路的負(fù)調(diào)控作用,從而發(fā)揮抗纖維化作用[14]。

2.6吡非尼酮和強(qiáng)的松 吡非尼酮可減輕PQ誘導(dǎo)的肺纖維化,經(jīng)過吡非尼酮治療的PQ染毒大鼠肺組織羥脯氨酸含量、轉(zhuǎn)化生長因子-β1和腫瘤壞死因子-α水平減低,吡非尼酮還能抑制PQ誘導(dǎo)的MMP-2和TIMP-1的增加,提示吡非尼酮通過調(diào)節(jié)大鼠肺纖維化過程中羥脯氨酸含量、氧化應(yīng)激、促炎、促纖維化基因表達(dá)發(fā)揮抗纖維化作用。有意思的是,該實(shí)驗(yàn)對比了強(qiáng)的松的治療效果,發(fā)現(xiàn)單用強(qiáng)的松并無抗纖維化作用,而當(dāng)吡非尼酮與強(qiáng)的松龍合用時,所有上述的這些作用都被夸大了,表現(xiàn)出更強(qiáng)的治療作用[30]。

3 結(jié) 語

百草枯中毒致肺纖維化的發(fā)病機(jī)制目前尚未闡明,但經(jīng)過眾多研究者努力,已取得了部分進(jìn)展,用大鼠建模用于實(shí)驗(yàn)是較為廣泛、可靠的方法,在此基礎(chǔ)上,出現(xiàn)了許多新的百草枯致肺纖維化的治療方向,但仍處于實(shí)驗(yàn)階段,無突破性進(jìn)展。然而百草枯農(nóng)藥中毒導(dǎo)致肺纖維化是臨床常見病例,預(yù)后差,是目前研究的難點(diǎn)、重點(diǎn),還需要大量研究者繼續(xù)努力探索解決。