梁家銘 徐建廣

基于間充質(zhì)干細(xì)胞(MSC)的骨組織工程技術(shù)是骨組織缺損修復(fù)極具發(fā)展前途的治療策略之一。外泌體是細(xì)胞分泌的細(xì)胞外囊泡，作為MSC的旁分泌介質(zhì)，它是MSC發(fā)揮組織修復(fù)功能的重要原因，外泌體治療作為替代細(xì)胞治療的新方案，可避免細(xì)胞治療帶來免疫排斥反應(yīng)、潛在致癌等并發(fā)癥，也規(guī)避了倫理問題[1]。外泌體攜帶mRNA、miRNA、蛋白質(zhì)、細(xì)胞因子和生長因子等生物活性物質(zhì)，其通過影響細(xì)胞功能成為骨組織缺損修復(fù)的新治療策略[2]。

1 調(diào)節(jié)MSC成骨分化

外泌體可調(diào)節(jié)并誘導(dǎo)MSC進(jìn)行成骨分化。研究表明，MSC分泌的外泌體作為一種細(xì)胞工具，在體內(nèi)外都能誘導(dǎo)幼稚MSC特異性分化，同時(shí)還可與基質(zhì)蛋白(如Ⅰ型膠原蛋白、纖維蛋白等)結(jié)合，從而誘導(dǎo)成骨細(xì)胞分化[3]。Xu等[4]對人骨髓MSC培養(yǎng)并分離的外泌體miRNA進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)在MSC成骨細(xì)胞分化過程中有9種miRNA表達(dá)上調(diào)，4種miRNA表達(dá)下調(diào)，這種表達(dá)差異在成骨分化早期最為顯著，這為進(jìn)一步研究MSC分泌的外泌體提供了前提條件。Narayanan等[5]研究表明，成骨細(xì)胞分泌的外泌體和脂肪細(xì)胞分泌的外泌體都能增強(qiáng)細(xì)胞外基質(zhì)介導(dǎo)的MSC向各自譜系分化，同時(shí)在含有成骨細(xì)胞分泌外泌體的成脂肪細(xì)胞基質(zhì)中培養(yǎng)的人骨髓MSC有成骨基因表達(dá)，認(rèn)為外泌體對人骨髓MSC分化方向起著主導(dǎo)作用，其影響超過了細(xì)胞外基質(zhì)介導(dǎo)的細(xì)胞分化信號。

成骨分化階段的細(xì)胞分泌外泌體，在分化過程中形成正反饋?zhàn)饔茫M(jìn)一步促進(jìn)MSC成骨分化和生長。Yang等[6]對比成骨分化的人類脂肪干細(xì)胞分泌的外泌體和未分化的脂肪干細(xì)胞分泌的外泌體中miRNA表達(dá)譜，發(fā)現(xiàn)其中201個(gè)miRNA表達(dá)上調(diào)，33個(gè)miRNA表達(dá)下調(diào)，這些差異化表達(dá)的外泌體miRNA參與基因表達(dá)、細(xì)胞發(fā)育和分化及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等多種生物學(xué)過程；這些miRNA將成骨分化與軸突引導(dǎo)和絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路、Wnt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路相聯(lián)系以促進(jìn)脂肪干細(xì)胞成骨分化。MSC在成骨分化時(shí)分泌的外泌體功能也隨著分化階段的變化而變化，以調(diào)節(jié)不同分化階段的細(xì)胞功能。Wang等[7]研究表明，不同成骨分化階段MSC分泌的外泌體都能促進(jìn)同型干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化，但只有處于成骨分化后期MSC分泌的外泌體中含有差異表達(dá)的miRNA可以促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)礦化，這些miRNA進(jìn)一步豐富調(diào)控成骨分化的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路(如Wnt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路等)，加強(qiáng)細(xì)胞內(nèi)吞作用，以調(diào)整不同階段細(xì)胞功能。

2 調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞增殖和活性

成骨細(xì)胞廣泛存在于骨、骨膜、骨髓等骨組織中，它是骨形成的主要功能細(xì)胞，是骨基質(zhì)合成、分泌和礦化的基石[8]。外泌體可通過直接調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞增殖和活性來促進(jìn)骨組織再生。Zhao等[9]研究發(fā)現(xiàn)，將MSC分泌的外泌體與成骨細(xì)胞共培養(yǎng)后，葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白3(GLUT3)、MAPK相關(guān)蛋白及其mRNA在細(xì)胞中含量增加，并加快細(xì)胞周期，促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖。前列腺癌細(xì)胞分泌的外泌體具有極好的骨親和性，在其作用下成骨細(xì)胞增殖速度可以達(dá)到原來的1.5倍。Yang等[10]研究表明，將人骨髓MSC分泌的含有肺腺癌轉(zhuǎn)移相關(guān)轉(zhuǎn)錄本1(MALAT1)的外泌體與原代成骨細(xì)胞共培養(yǎng)，結(jié)果表明其通過介導(dǎo)miR-34c/SATB2軸增強(qiáng)成骨細(xì)胞活性。

Qin 等[11]研究表明，骨髓MSC分泌的外泌體在體外通過miR-196a促進(jìn)成骨細(xì)胞分化和增殖及成骨基因表達(dá)，同時(shí)促進(jìn)顱骨缺損SD大鼠骨形成。Liao等[12]探究攜帶miRNA-122-5p的骨髓MSC分泌的外泌體在股骨頭壞死兔模型中的作用，發(fā)現(xiàn)攜帶過表達(dá)miR-122-5p的外泌體通過提高受體酪氨酸激酶(RTK)活性，經(jīng)由RTK/Ras/MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路下調(diào)Sprouty2表達(dá)，促進(jìn)成骨細(xì)胞分化和增殖，從而抑制股骨頭壞死進(jìn)展。而在調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞活性的同時(shí)，外泌體也直接參與成骨細(xì)胞成骨。研究發(fā)現(xiàn)，外泌體在為礦化成骨細(xì)胞運(yùn)輸磷酸鈣中起著重要作用[13]。

3 影響破骨細(xì)胞分化和功能

骨重建是修復(fù)和替換受損骨組織的過程，由破骨細(xì)胞介導(dǎo)骨吸收、招募成骨前體細(xì)胞、激活分化形成新的骨組織來完成，破骨細(xì)胞與成骨細(xì)胞的相互作用和協(xié)調(diào)是骨組織修復(fù)的關(guān)鍵，破骨細(xì)胞的作用在骨組織修復(fù)中尤為重要[14]。Cui等[15]研究發(fā)現(xiàn)，內(nèi)皮祖細(xì)胞分泌的外泌體通過高表達(dá)的LncRNA-MALAT1與miRNA-124結(jié)合，抑制miRNA-124活性，誘導(dǎo)骨髓基質(zhì)細(xì)胞遷移和破骨細(xì)胞分化；在小鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，將內(nèi)皮祖細(xì)胞分泌的外泌體與原代小鼠骨髓來源巨噬細(xì)胞移植入骨折處，能顯著促進(jìn)骨折部位骨組織修復(fù)。Xu等[16]則發(fā)現(xiàn)，老年大鼠骨髓MSC分泌的外泌體中miRNA-31a-5p含量也明顯高于年輕大鼠，當(dāng)抑制外泌體中miR-31a-5p功能時(shí)，破骨細(xì)胞分化及功能也受到抑制，骨髓微環(huán)境中miR-31a-5p受抑制減少了老年大鼠骨丟失，并減弱了破骨細(xì)胞活性，這為年齡相關(guān)的骨質(zhì)疏松提供了潛在的治療靶點(diǎn)。

腫瘤骨轉(zhuǎn)移與破骨細(xì)胞異常激活密切相關(guān)。Taverna等[17]研究發(fā)現(xiàn)，非小細(xì)胞肺癌分泌的外泌體中攜帶雙向調(diào)節(jié)蛋白(AREG)，其能誘導(dǎo)破骨前體細(xì)胞表皮生長因子受體(EGFR)途徑激活而過表達(dá)核因子-κ B受體活化因子配體(RANKL)，從而促進(jìn)破骨細(xì)胞形成與分化。Xu等[18]在肺腺癌細(xì)胞分泌的外泌體中也發(fā)現(xiàn)了相似途徑，外泌體通過過表達(dá)miR-21促進(jìn)破骨細(xì)胞形成。而破骨細(xì)胞本身也可通過分泌外泌體調(diào)節(jié)自身功能，從而形成自身正負(fù)反饋?zhàn)饔?。Huynh等[19]收集了早期破骨細(xì)胞分化為破骨細(xì)胞時(shí)分泌的外泌體，其在整個(gè)分化過程中可促進(jìn)破骨細(xì)胞分化，同時(shí)成熟的破骨細(xì)胞分泌的部分外泌體中富集核因子-κ B受體活化因子(RANK)，它可能通過競爭性結(jié)合破骨細(xì)胞RANKL阻止其促進(jìn)破骨細(xì)胞分化，以免過度分化的破骨細(xì)胞進(jìn)一步破壞骨組織。

4 促進(jìn)血管新生

骨組織修復(fù)是多步驟的復(fù)雜過程，由炎癥引發(fā)各種細(xì)胞因子和生長因子釋放，募集干細(xì)胞，促進(jìn)血管形成，從而促進(jìn)功能性骨形成，新生血管作為骨組織修復(fù)中的重要一員，在運(yùn)送養(yǎng)料的同時(shí)還能促進(jìn)細(xì)胞增殖和基質(zhì)礦化[20]。外泌體促進(jìn)組織和器官血管生成已得到許多研究的證實(shí)[21]，它可能通過促進(jìn)骨缺損中血管新生刺激骨骼再生。Zhang等[22]在大鼠股骨骨不連的體內(nèi)研究中發(fā)現(xiàn)，將骨髓MSC分泌的外泌體植入骨折處，術(shù)后20周移植的骨髓MSC分泌的外泌體可明顯促進(jìn)大鼠骨不連成骨、血管生成和骨愈合；體外培養(yǎng)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞和小鼠胚胎成骨前體細(xì)胞中能攝取骨髓MSC分泌的外泌體，它通過激活低氧誘導(dǎo)因子(HIF)-1α/血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路和骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)-2/Smad1/RUNX2信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路增強(qiáng)細(xì)胞增殖、遷移和成骨分化能力。Zhang等[23]研究發(fā)現(xiàn)，臍帶MSC分泌的外泌體可促進(jìn)VEGF和HIF-1α表達(dá)，顯著增強(qiáng)內(nèi)皮細(xì)胞血管生成活力，但其Osx、骨鈣蛋白(OCN)、COL1A1和堿性磷酸酶(ALP)等成骨相關(guān)基因mRNA表達(dá)水平并沒有顯著提升，然而體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中臍帶MSC分泌的外泌體可顯著促進(jìn)小鼠骨折模型血管生成和骨組織愈合，因此推測該外泌體促進(jìn)骨折愈合機(jī)制可能并不依賴于促進(jìn)成骨分化，而是通過促進(jìn)血管新生加強(qiáng)骨組織修復(fù)。

Jia等[24]研究證實(shí)，內(nèi)皮祖細(xì)胞分泌的外泌體可通過miRNA-126增強(qiáng)內(nèi)皮細(xì)胞血管生成能力，miRNA-126下調(diào)了Spred1并激活Ras/細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(ERK)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，在體外牽張成骨模型中，經(jīng)內(nèi)皮祖細(xì)胞分泌的外泌體處理的脛骨新生骨組織中血管密度較高，同時(shí)新生骨組織具有較高的載荷極限和失效能量。Tao等[25]研究發(fā)現(xiàn)，由富血小板血漿(PRP)分泌的外泌體富集了PRP中的生長因子，通過激活A(yù)kt和ERK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路拮抗地塞米松對內(nèi)皮細(xì)胞VEGF-A表達(dá)的抑制作用而促進(jìn)血管生成，同時(shí)PRP分泌的外泌體通過Wnt/β-catenin信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路拮抗地塞米松對小鼠胚胎成骨前體細(xì)胞體外成骨的抑制作用，維持細(xì)胞成骨分化能力；在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，改善股骨頭血供和促進(jìn)成骨可逆轉(zhuǎn)甲強(qiáng)龍導(dǎo)致的骨小梁厚度降低、骨量減少和骨小梁數(shù)量減少等，緩解甲強(qiáng)龍誘導(dǎo)的股骨頭壞死。

5 與生物材料聯(lián)合應(yīng)用

對于超過臨界大小的骨缺損，生物材料的應(yīng)用克服了骨移植物有限的難題，但生物材料也存在著局限性，因此有學(xué)者將外泌體與生物材料聯(lián)合應(yīng)用以提升其生物活性和功能。Zhang等[26]將人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞源性MSC分泌的外泌體與磷酸三鈣(β-TCP)支架復(fù)合，發(fā)現(xiàn)其能從β-TCP支架中釋放，促進(jìn)骨髓MSC增殖、遷移和成骨分化，同時(shí)可通過激活骨髓MSC的磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/Akt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路增強(qiáng)β-TCP的成骨活性，從而促進(jìn)骨缺損修復(fù)。Li等[27]將人脂肪干細(xì)胞分泌的外泌體固定在聚多巴胺包裹的聚乳酸-羥基乙酸(PLGA)支架上，發(fā)現(xiàn)其可緩慢而持續(xù)地從PLGA支架上釋放并與PLGA支架結(jié)合發(fā)揮誘導(dǎo)成骨作用，促進(jìn)骨髓MSC在新生骨組織中遷移和歸巢以促進(jìn)骨組織再生。Wei等[28]將經(jīng)BMP-2預(yù)處理巨噬細(xì)胞來源的外泌體與鈦納米管相結(jié)合，發(fā)現(xiàn)其通過促進(jìn)自噬途徑來促進(jìn)骨髓MSC成骨分化，顯著促進(jìn)早期成骨分化標(biāo)志物ALP和BMP-2的表達(dá)，從而促進(jìn)缺損骨組織修復(fù)。

生物材料在形狀上可填充骨缺損區(qū)域，同時(shí)代替原有骨組織承擔(dān)部分機(jī)械支撐作用，為細(xì)胞提供生長環(huán)境，而外泌體的加入則提升了支架生物活性和成骨誘導(dǎo)能力，將兩者有效結(jié)合應(yīng)用可為骨組織修復(fù)提供可靠的“后勤保障”。

6 展望

與細(xì)胞治療相比，外泌體治療具有安全性高、便于運(yùn)輸和儲存、免疫原性低、可作為藥物載體和治療效率高等優(yōu)勢[29]。然而，外泌體大規(guī)模應(yīng)用也面臨產(chǎn)量低、提取和分離方式存有爭議、攜帶的遺傳信息確切功能尚未闡明、注射分布不可控等局限性[30-32]。因此，開發(fā)一種可靠、低成本、高產(chǎn)量、高可重復(fù)性的外泌體分離方式將極大地助力于外泌體研究。而認(rèn)識和了解外泌體確切功能，掌握外泌體劑量、體內(nèi)分布和清除效率可為外泌體進(jìn)一步臨床應(yīng)用提供安全性保障。通過預(yù)處理等方式提高外泌體的作用效率及靶向運(yùn)輸能力將有助于提高外泌體療法的治療效果。