宋兆威，李志堅(jiān)，王曉慧，李華章

0引言

炎性體是位于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的多蛋白復(fù)合物，它負(fù)責(zé)促進(jìn)炎性細(xì)胞因子如白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)和白細(xì)胞介素-18(IL-18)的成熟，以及激活高度炎癥形式的細(xì)胞死亡和焦亡。在感染或細(xì)胞應(yīng)激后，炎性體被組裝、激活并參與疾病的宿主防御和疾病的病理生理過程[1]。

經(jīng)典炎性體是響應(yīng)病原相關(guān)分子模式(PAMP)或損傷相關(guān)分子模式(DAMP)而在細(xì)胞質(zhì)中激活caspase-1的媒介。 典型炎癥小體由輔助蛋白和自身寡聚化支架蛋白組成，通常屬于核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體(NLR)家族。 NLR蛋白含有三個(gè)共同結(jié)構(gòu)域：C末端富含亮氨酸的重復(fù)序列(LRR)，中心核苷酸結(jié)合寡聚化(NOD / NACHT)結(jié)構(gòu)域和N末端半胱天冬酶募集(CARD)或pyrin(PYD)結(jié)構(gòu)域。 黑色素瘤-2(AIM2)蛋白中不存在的非NLR含有PYD信號(hào)傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域和結(jié)合HIN-200結(jié)構(gòu)域的DNA。 LRR負(fù)責(zé)配體識(shí)別和自身抑制，NACHT結(jié)構(gòu)域使用ATP激活信號(hào)復(fù)合物，CARD / PYD結(jié)構(gòu)域介導(dǎo)同型蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用。 迄今已鑒定出四種經(jīng)典炎性體——NLRP1，NLRP3，NLRC4和AIM2[2]。含 Pryrin 結(jié)構(gòu)域蛋白 3(nod-like receptor protein 3,NLRP3)炎性體是目前研究較多的炎性小體，大量活性氧(ROS)產(chǎn)生后能夠激活NLRP3，而NLRP3激活后可以活化caspase-1，引起細(xì)胞焦亡。細(xì)胞焦亡是近年來的研究熱點(diǎn)，NLRP3在焦亡通路中扮演著重要角色，目前在眼部疾病中對(duì)其的相關(guān)研究較少，對(duì)NLRP3的進(jìn)一步研究對(duì)眼科疾病的診療有著重要意義。

1含Pryrin結(jié)構(gòu)域蛋白炎性體

核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域(NOD) 樣受體家族NLRP3炎性體是針對(duì)廣泛的微生物病原體和醫(yī)學(xué)相關(guān)物質(zhì)(例如結(jié)晶)而組裝的。組裝后，炎性體可作為pro-caspase-1的活化平臺(tái)。然后，活化的caspase-1將IL-1β/ 18的前體加工成成熟形式[3]。NLRP3炎性體的形成和活化可能是許多退行性疾病的關(guān)鍵致病機(jī)制，如動(dòng)脈粥樣硬化、阿爾茨海默病、腎小球硬化、肺纖維化和肝硬化[4-7]等。

NLRP3炎性體的激活需要兩個(gè)信號(hào)：信號(hào)1是來自TLR或細(xì)胞因子受體的引發(fā)信號(hào);信號(hào)2是來自危險(xiǎn)信號(hào)或微生物產(chǎn)物的激活信號(hào)，通常導(dǎo)致細(xì)胞鉀外流和線粒體ROS產(chǎn)生[8]。引起NLRP3炎性體激活的形式包括：ATP和K+外排、溶酶體不穩(wěn)定和無效的吞噬作用、ROS、ER應(yīng)激和未折疊蛋白反應(yīng)(UPR)、Ca2+信號(hào)傳導(dǎo)、去泛素化、微小RNA(miRNA)，其中最重要的是ROS[1]。

2細(xì)胞焦亡

焦亡(pyroptosis)是細(xì)胞死亡的促炎形式，并且依賴于IL-1β、IL-18和警報(bào)HMGB-1。Caspase-1是炎癥性半胱天冬酶的前體，以pro-caspase-1(一種無活性的酶原)的形式存在于細(xì)胞胞質(zhì)中。pro-IL-1β和pro-IL-18切割成成熟的促炎細(xì)胞因子IL-1β和IL-18需要caspase-1的激活?；罨腸aspase-1可引起細(xì)胞焦亡，其特征是細(xì)胞裂解和細(xì)胞質(zhì)內(nèi)容物釋放到細(xì)胞外空間。

形態(tài)學(xué)上，細(xì)胞焦亡似乎是細(xì)胞凋亡和細(xì)胞壞死的組合，涉及質(zhì)膜完整性的破壞和細(xì)胞質(zhì)內(nèi)容物向細(xì)胞外空間釋放。焦亡細(xì)胞的質(zhì)膜出現(xiàn)破裂，隨后迅速重新密封和腫脹，并在細(xì)胞核周圍形成一個(gè)球狀的囊泡。在細(xì)胞焦亡期間，垂死細(xì)胞的大小會(huì)出現(xiàn)顯著的增加。隨著焦亡細(xì)胞的膨脹，細(xì)胞核變圓、皺縮。與凋亡細(xì)胞相反，焦亡細(xì)胞保持了核的完整性； 與凋亡細(xì)胞相同，焦亡細(xì)胞的DNA片段化，在TUNEL染色下表達(dá)陽性[2]。

3 NLRP3炎癥小體與細(xì)胞焦亡的關(guān)系

除了IL-1β和IL-18的成熟之外，焦亡還與炎性體的激活有關(guān)[9]。焦亡的特點(diǎn)包括caspase-1依賴，DNA片段化，細(xì)胞膜完整性的快速喪失和炎性細(xì)胞因子釋放[10]。炎性體的生化功能是激活caspase-1使IL-1β和IL-18成熟以及誘導(dǎo)細(xì)胞焦亡。細(xì)胞被外界刺激誘導(dǎo)caspase-1活化的過程離不開炎癥小體的調(diào)節(jié)與控制，所以炎癥小體的激活與活化是細(xì)胞焦亡的關(guān)鍵步驟。

4眼部相關(guān)疾病的研究

4.1 NLRP3與年齡相關(guān)性黃斑變性年齡相關(guān)性黃斑變性(age-related macular degeneration，ARMD)是一種神經(jīng)退行性疾病，可侵襲黃斑，造成不可逆轉(zhuǎn)的失明。對(duì)于干性ARMD，目前沒有有效的方法可以緩解和治療，視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞(retinal pigment epithelium，RPE)死亡和繼發(fā)性光感受器變性這兩種特征性變化導(dǎo)致干性ARMD晚期的中心視力喪失。因此，了解對(duì)視網(wǎng)膜造成破壞性影響的基本機(jī)制及因素至關(guān)重要[11]。

ARMD中RPE細(xì)胞死亡的機(jī)制尚未完全闡明。幾項(xiàng)臨床和實(shí)驗(yàn)證據(jù)表明，氧化和脂褐素介導(dǎo)的光氧化損傷具有重要的病理生理作用[12]。NLRP3炎性體也有助于繼發(fā)于ARMD的RPE細(xì)胞死亡[13-14]。實(shí)際上，已經(jīng)在受ARMD影響的RPE細(xì)胞中證實(shí)了NLRP3炎性體的激活[13,15],并且有報(bào)道發(fā)現(xiàn)ARMD患者的玻璃體內(nèi)和全身的IL-1β和IL-18的水平增加[16-17]。Carolina 等[10]發(fā)現(xiàn)未接觸炎性小體的細(xì)胞表現(xiàn)出延遲的細(xì)胞裂解、質(zhì)膜起泡和細(xì)胞收縮，TUNEL陽性DNA片段化，膜聯(lián)蛋白V陽性/ PI陰性細(xì)胞染色，以及缺乏IL-1β和IL-18釋放。 相反，接觸炎性小體的細(xì)胞表現(xiàn)出細(xì)胞腫脹和早期細(xì)胞裂解，TUNEL陽性DNA降解，PI陽性細(xì)胞染色，caspase-1活化和IL-1β和IL-18的釋放[18]。研究結(jié)果表明，接觸炎性小體可以將RPE細(xì)胞中光氧化損傷誘導(dǎo)細(xì)胞的死亡機(jī)制從細(xì)胞凋亡轉(zhuǎn)變?yōu)榧?xì)胞焦亡。Wang等[19]觀察到ARMD患者中NLRP3、pro-IL-1β和pro-IL-18的mRNA水平增加。在體外，成體視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞(ARPE-19)細(xì)胞系中的氧化應(yīng)激或脂多糖(LPS)刺激引起類似的增加，并且siRNA轉(zhuǎn)染的敲除NLRP3的細(xì)胞中這種增加受到抑制。 表明外源性炎癥刺激和氧化應(yīng)激都可以通過caspase-1激活觸發(fā)人RPE細(xì)胞中的NLRP3炎性體激活。以上數(shù)據(jù)表明，NLRP3及細(xì)胞焦亡在ARMD的發(fā)生機(jī)制中起到了關(guān)鍵的作用，讓我們對(duì)未來ARMD的治療有了新的想法和思路，NLRP3可以作為以后ARMD研究與治療的新的靶點(diǎn)。

4.2 NLRP3與年齡相關(guān)性白內(nèi)障年齡相關(guān)性白內(nèi)障多見于50歲以上的中老年人，是目前全球主要的致盲原因，但其發(fā)病機(jī)制至今尚未闡明，了解白內(nèi)障的發(fā)病機(jī)制及其通路中的相關(guān)因子，可以為今后預(yù)防及治療白內(nèi)障提供新的有效方式。

Alexander[20]的研究顯示VEGF-A的增加足以引起眼部的多種老化疾病，包括白內(nèi)障以及ARMD。在晶狀體中，VEGF-A的增加誘導(dǎo)了與ERK過度活化相關(guān)的年齡相關(guān)性混濁，氧化損傷和IL-1β的更高表達(dá)。靶向NLRP3炎性體組分或Il1r1不僅強(qiáng)烈抑制VEGF-A誘導(dǎo)的白內(nèi)障形成，而且強(qiáng)烈抑制ARMD的形成。這些發(fā)現(xiàn)表明VEGF-A誘導(dǎo)的和NLRP3炎性體介導(dǎo)的IL-1β激活對(duì)多種不同的眼部老化疾病具有共同的致病作用，靶向NLRP3或Il1r1可以抑制VEGF-A誘導(dǎo)的年齡相關(guān)的白內(nèi)障發(fā)生。據(jù)報(bào)道NLRP3炎性體的特定化學(xué)抑制劑可用于治療這些老化疾病[21]。IL-1β阻斷劑在預(yù)防或抑制ARMD或與年齡相關(guān)性白內(nèi)障形成方面也具有臨床益處[22]。在年齡相關(guān)性白內(nèi)障的形成機(jī)制中，NLRP3占有重要的中心地位，NLRP3抑制劑可以有效抑制這個(gè)過程的發(fā)生，所以NLRP3抑制劑可以作為年齡相關(guān)性白內(nèi)障的一種新型治療與緩解方式給我們新的啟發(fā)與探索的方向。

4.3 NLRP3與翼狀胬肉翼狀胬肉是一種眼表疾病，特征在于鼻側(cè)結(jié)膜上的翼狀增殖組織，能阻礙視力，引起炎癥并影響外觀[23]?，F(xiàn)在手術(shù)仍然是翼狀胬肉的主要治療方法，但會(huì)引起復(fù)發(fā)，移植物壞死和形成肉芽腫等并發(fā)癥[24]。盡管已經(jīng)用了很多方法來避免復(fù)發(fā)，但效果并不明顯[25]。 因此，了解翼狀胬肉的形成機(jī)制對(duì)于治療和降低其發(fā)病率至關(guān)重要。

Sun等[23]通過原代培養(yǎng)人結(jié)膜上皮細(xì)胞(HConECs)和人翼狀胬肉成纖維細(xì)胞(HPF)，檢測(cè)出與結(jié)膜細(xì)胞相關(guān)的因子水平。抑制caspase-1以限制caspase-1依賴性的細(xì)胞凋亡后，測(cè)量下游因子IL-18和IL-1β。發(fā)現(xiàn)翼狀胬肉中的炎性因子表達(dá)顯著增加，并且在H2O2處理的HPF和HConECs中存在caspase-1依賴性的上皮細(xì)胞焦亡，炎性因子的表達(dá)顯著升高并且下游因子IL-18和IL-1β也升高。在caspase-1抑制后，IL-18和IL-1β的增加受到抑制。焦亡在翼狀胬肉形成和進(jìn)展的病理過程中發(fā)揮作用。

翼狀胬肉的常見原因如紫外線輻射和其他類型的氧化應(yīng)激，可以作為DAMPs引發(fā)細(xì)胞焦亡。在發(fā)生焦亡后，IL-18和IL-1β被激活并大量釋放。激活的IL-18和IL-1β引起各種變化，例如纖維化、EMT、細(xì)胞凋亡和異常細(xì)胞增殖，所有這些都包括在翼狀胬肉發(fā)生的機(jī)制中。因此，HPFs中這些焦亡因子的升高，是翼狀胬肉的主要組成部分，可能在翼狀胬肉的進(jìn)展中起相當(dāng)大的作用。NLRP3參與的細(xì)胞焦亡在翼狀胬肉形成和進(jìn)展中的重要作用使我們更好地了解翼狀胬肉，并發(fā)現(xiàn)了翼狀胬肉治療的新的可能性，這將為今后翼狀胬肉的治療提供新的方法和思路。

4.4 NLRP3與糖尿病視網(wǎng)膜病變糖尿病視網(wǎng)膜病變(diabetic retinopathy，DR)是一種多因素疾病，具有微血管、神經(jīng)變性，遺傳/表觀遺傳，免疫和炎癥相關(guān)因子的復(fù)雜相互作用。 根據(jù)微血管變性和缺血性損傷的程度，DR可分為非增殖期(NPDR)和增殖期(PDR)[26]。

Sirpa等[27]研究結(jié)果支持NLRP3炎性體在PDR中是激活狀態(tài)。 抗VEGF治療降低了NPDR患者玻璃體中caspase-1的水平，提示炎癥小體激活也參與NPDR，并且也支持炎性體和VEGF之間存在聯(lián)系。 在患有牽拉性視網(wǎng)膜脫離(TRD)和新生血管形成等嚴(yán)重形式的PDR患者眼中觀察到高水平的NLRP3。 與NPDR玻璃體樣本相比，在PDR眼中檢測(cè)到更高水平的IL-18。Mcc950是NLRP3炎性體的有效特異性抑制劑，Zhang 等[28]評(píng)估了Mcc950對(duì)高葡萄糖誘導(dǎo)的人視網(wǎng)膜內(nèi)皮細(xì)胞(HRECs)的抗炎作用以及潛在的相關(guān)機(jī)制。在來自DR患者的手術(shù)切除的增殖膜中，觀察到NLRP3、caspase-1和IL-1β的高表達(dá)。在高葡萄糖刺激的HRECs中，Mcc950抑制了NLRP3炎性體的激活和細(xì)胞凋亡。Chen 等[29]發(fā)現(xiàn)從DR患者獲得的外周血單核細(xì)胞(PBMC)中NLRP3炎性體的表達(dá)升高; 在PBMC和玻璃體液中也觀察到包括IL-1β和IL-18的促炎細(xì)胞因子水平升高。 這些數(shù)據(jù)表明NLRP3炎性體的激活可能促進(jìn)DR的進(jìn)展。這些發(fā)現(xiàn)使我們對(duì)DR的發(fā)病機(jī)制和發(fā)生發(fā)展有了進(jìn)一步了解，其中NLRP3作為DR治療的潛在因子，需要我們進(jìn)一步闡明及探索NLRP3炎性體在DR形成過程中的分子機(jī)制。

4.5 NLRP3與干眼癥干眼癥(dry eye，DE)是最常見的眼表疾病之一，嚴(yán)重影響人的生活質(zhì)量。 盡管尚未明確干眼癥的發(fā)病機(jī)制，但越來越多的證據(jù)表明，眼表面的免疫炎癥可能在干眼癥的病理損害中起著重要作用[30-31]。但干眼癥炎癥發(fā)生發(fā)展的確切機(jī)制現(xiàn)在仍不清楚。

活性氧物質(zhì)可激活NLRP3炎癥小體并導(dǎo)致干眼小鼠模型中caspase-1自身激活和促炎細(xì)胞因子IL-1β的成熟[32]。Niu 等[33]的研究顯示干燥綜合征干眼癥(SSDE)受試者中NLRP3 mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)與對(duì)照組相比顯著增加。非干燥綜合征干眼癥(NSSDE)的受試者也顯示出高水平的NLRP3 mRNA表達(dá)。這些發(fā)現(xiàn)表明NLRP3炎性體可能與干眼癥眼表炎癥的發(fā)展有關(guān)。SSDE組的基線淚膜破裂時(shí)間(tear break-up time，TBUT)，熒光素染色(fluorescein，F(xiàn)L)和Schirmer測(cè)試值均顯著低于NSSDE組中的數(shù)據(jù)。SSDE和NSSDE中NLRP3的表達(dá)水平可能與干眼癥的嚴(yán)重程度有關(guān)。Zheng 等[32]用智能控制環(huán)境系統(tǒng)(intelligent controlled environmental system，ICES)誘導(dǎo)雌性4～6周齡C57BL/6小鼠的蒸發(fā)過強(qiáng)型DE。在ICES暴露1wk后發(fā)生ROS的升高，其在三種NLRP3炎性體組分(即NLRP3、ASC和caspase-1)的基因表達(dá)增加之前導(dǎo)致IL-1β釋放的增加。 ICES暴露2wk后發(fā)生caspase-1活性增加。將含有0.3% N-乙?；?L-半胱氨酸(NAC)的滴眼液用于在ICES中飼養(yǎng)2wk的小鼠。NAC減少角膜熒光素染色并減少ROS產(chǎn)生，還下調(diào)NLRP3、ASC、caspase-1和IL-1β mRNA以及它們免疫染色的水平。它明顯減弱炎性體介導(dǎo)的caspase-1的催化活性。干眼癥小鼠模型顯示，ROS生成的增加引發(fā)NLRP3炎性體的復(fù)合和活化，導(dǎo)致生物活性IL-1β分泌增加。NLRP3表達(dá)的增加也與環(huán)境誘導(dǎo)的DE疾病的嚴(yán)重性相關(guān)。以上這些研究結(jié)果為發(fā)現(xiàn)干眼病的患者的治療提供了新的策略，開發(fā)抑制NLRP3復(fù)合物形成和活化的藥物可能為治療環(huán)境誘導(dǎo)的DE疾病提供新的治療選擇。

5小結(jié)

NLRP3炎癥小體在許多眼部疾病中起著至關(guān)重要的作用，是危險(xiǎn)信號(hào)誘導(dǎo)疾病發(fā)生發(fā)展的中心環(huán)節(jié)。而炎性體的激活與活化是細(xì)胞焦亡發(fā)生的關(guān)鍵步驟，NLRP3 炎性小體是炎癥反應(yīng)的核心，故而 NLRP3 炎性體與細(xì)胞焦亡的發(fā)生具有密切關(guān)系。目前，對(duì)其通路的確切機(jī)制以及分子間相互作用的研究較少。因此，進(jìn)一步研究 NLRP3 介導(dǎo)的細(xì)胞焦亡通路在眼科疾病中的作用及機(jī)制，應(yīng)用相關(guān)生物制劑或生物學(xué)方法阻斷 NLRP3 的信號(hào)通路等研究，能夠?qū)ρ劭萍膊〉纳钊肓私饧爸委熖峁┬碌乃悸芳靶碌闹委煱悬c(diǎn)。