王剛 祝雁冰 關(guān)中偉

膝關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)病是一種常染色體顯性遺傳性骨軟骨發(fā)育不良，其特征在于關(guān)節(jié)軟骨的退化，軟骨下骨的重塑，骨贅形成和硬化[1]。多種致病機制與膝關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)炎的嚴重程度和進展有關(guān)，早熟性膝關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)炎是指在 40 歲之前發(fā)生的病癥，有很強的遺傳相關(guān)性[2]。從疾病的第一個癥狀開始，通常需要 10～15 年才能變得嚴重和衰弱[3-4]。許多候選基因，主要是那些編碼細胞外基質(zhì)結(jié)構(gòu)蛋白的基因，已經(jīng)被鑒定為特發(fā)性膝關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)病的潛在易感基因座[5]。軟骨寡聚基質(zhì)蛋白 ( cartilage oligomeric matrix protein，COMP ) 是一種細胞外基質(zhì)蛋白，主要在軟骨和骨組織中表達[6]。假性軟骨發(fā)育不全 ( pseudoachondroplasia，PSACH ) 和多發(fā)性骨骺發(fā)育異常 ( muffiple epiphyseal dysplaais，MED ) 的患者報告了 100 多種 COMP 突變，但在已鑒定出 COMP 的外顯子 15，17 和 19 中沒有任何突變[7]。COMP 基因突變與常染色體顯性早熟性膝關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)病可能存在關(guān)聯(lián)[8]，而且目前的研究認為基因多態(tài)性可以影響基因的表達水平。膝關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)病的診斷通常主要基于家族史，臨床表現(xiàn)，體格檢查，放射學評估和基因診斷。然而，膝關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)病的準確診斷有時可能很困難，特別是對于非專業(yè)醫(yī)生而言，并且由于臨床表現(xiàn)在膝關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)病個體之間存在顯著差異，因此大多數(shù)放射學檢查變化并非疾病特異性且 DNA 檢測費用昂貴且未廣泛使用[9]。然而，尚未探索 COMP 水平變化作為膝關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)病患者的診斷標志物。本研究擬探討 COMP 基因多態(tài)性與常染色體顯性早熟性膝關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)病的關(guān)系和 COMP 水平作為膝關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)病生物標志物的潛在效用。

資料與方法

一、納入標準與排除標準

1. 納入標準：( 1 ) 確診為膝關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)病患者；患者來自于同一家族；( 2 ) 受試者自愿加入本研究。

2. 排除標準：( 1 ) 風濕性關(guān)節(jié)炎者；( 2 ) 痛風性關(guān)節(jié)炎的者；( 3 ) 不同意參加該研究者；( 4 ) 患有嚴重的精神疾病者。

二、一般資料

2017 年 3 月至 2018 年 2 月，我院鑒定并招募具有常染色體顯性早熟性膝關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)病的六代家族，招募了來自該家族的 32 例膝關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)病患者，用于表型評估和基因分型，還招募了 55 名年齡匹配的健康對照受試者。所有參與本研究的受試者，均行 X 線片檢查評估關(guān)節(jié)受損情況 ( 注：獲得六代家族的臨床資料的途徑是本研究團隊所在科室多年來持續(xù)隨訪關(guān)注該家族的工作成果 )。

本研究得到了機構(gòu)審查委員會的批準，每位參與者或其法定代表人均簽署書面知情同意書。

三、方法

1. 體格檢查和實驗室檢查：所有研究參與者均接受常規(guī)病史和體格檢查，由 3 名副主任醫(yī)師在本院風濕免疫學系獨立風濕病專家的監(jiān)督下進行。記錄患者的年齡，疾病持續(xù)時間，晨僵持續(xù)時間，關(guān)節(jié)壓痛指數(shù)、關(guān)節(jié)腫脹指數(shù)、關(guān)節(jié)活動疼痛指數(shù)和關(guān)節(jié)靜息疼痛指數(shù)。使用 Axiom Aristos VX Plus 手部 X 線片數(shù)字 X 線攝影系統(tǒng) ( 西門子 )，以確定關(guān)節(jié)骨損傷的程度。

2. 基因多態(tài)性分型：使用 Puregene DNA Isolation Kit ( Gentra Systems，Minneapolis，MN，USA ) 根據(jù)制造商的說明提取基因組 DNA。使用 ABI PRISM Linkage Mapping Set v 2.5 HD5 ( Applied Biosystems，F(xiàn)oster City，CA，USA ) 對 400 個高度多態(tài)性微衛(wèi)星標記進行基因分型。標記物的平均雜合度為 0.72%，估計間距為 10 cm。使用 GeneMapper 軟件程序 ( Applied Biosystems ) 計算等位基因大小。使用 SAS 程序執(zhí)行等位基因呼叫和分級。

3. DNA 測序：使用 Applied Biosystems 3730 DNA 分析儀通過直接測序確定所有 19 個外顯子和外顯子-內(nèi)含子連接的 COMP DNA 序列變體。使用 Primer3 程序 ( http://frodo.wi.mit.edu/primer3/ ) 設(shè)計用于聚合酶鏈反應 ( PCR ) 的引物。PCR 反應在 50 μl 的最終體積中進行，每個引物含有 0.2 μM， 5 mm Tris-HCl ( pH 8.3 )，5 mm KCl，1.5 mm Mgcl2，0.01 mm EDTA，0.05 mm DTT，200 μM dNTP 和 2.5 μl 位 Taq。擴增條件包括在 94 ℃ 下初始變性 3 min，然后在 94 ℃ 下進行 20 個觸地 PCR 循環(huán) 30 s，在 65 ℃ 下 30 s ( 每個循環(huán)降低 0.5 ℃ )，在 72 ℃ 下 40 s，最后 20 個循環(huán)，在 94 ℃ 下 30 s，在 55 ℃ 下 30 s，在 72 ℃ 下 40 s ( 表 1 )。

表 1 RT-PCR 引物序列Tab.1 RT-PCR primer sequence

4. 血漿 COMP 和抗 CCP 抗體測定：選擇 32 名膝關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)病家族的第 4 代、第 5 代、第 6 代膝關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)病患者。對照組是從醫(yī)院隨機選擇的，所選擇的參與者分別與 32 例膝關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)病個體的年齡相匹配。將 5 ml 靜脈血樣品收集到 IMPROVACUTER?EDTAK2 管 ( IMPROVE MEDICAL Technology，Guangzhou，China ) 中。將血液樣品在室溫下以 2000 g 離心 20 min，在 BY-320C 離心機 ( Baiyang Medical Instrument Company，Beijing，China ) 中保存，并在 -80 ℃ 下保存直至分析。根據(jù)制造商的說明，使用 ImmunoscanCCPlus?酶聯(lián)免疫吸附測定 ( Euro Diagnostica，Malmo，Sweden ) 分析抗 CCP 水平，并且最小可檢測濃度為 0.1 U / L。使用 Human COMP 酶聯(lián)免疫吸附測定法 ( Kamiya Biomedical Company，Seattle，WA，USA ) 根據(jù)制造商的說明書測量血清 COMP 水平。最低可檢測濃度為 0.4 ng / ml，并且測定內(nèi)和測定間變異系數(shù)均＜5%。每個測量一式三份進行。

5. 膝關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)炎指數(shù)評分：為了評價膝骨關(guān)節(jié)的功能，使用西安大略省和麥克馬斯特大學 ( The Western Ontario and McMaster Universities，WOMAC ) 膝關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)炎指數(shù)評分，這是一種經(jīng)過驗證且廣泛使用的測量膝關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)炎患者下肢疼痛和功能狀態(tài)的方法。對疼痛和功能分別使用線性變換對響應進行求和并縮放為 0～100。WOMAC 膝關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)炎評分包含三個分量表，即僵硬亞表 ( 范圍 0～8，最高僵硬水平 8 )，功能亞表 ( 范圍 0～68，最低功能水平 68 ) 和疼痛亞表 ( 范圍 0～20，疼痛最高水平 20 )，分數(shù)越高表示疼痛越大，功能越差。

四、統(tǒng)計學處理

使用 SPSS Version 17.0 軟件 ( SPSS Inc.，Chicago，IL，US ) 進行統(tǒng)計學分析。使用 GraphPad Prism 5.0 軟件將所有數(shù)據(jù)表示為±s。使用非參數(shù) Mann-WhitneyU檢驗和 Student’st檢驗確定組間差異。分類數(shù)據(jù)以n個患者 ( % ) 表示，使用 Pearsonχ2檢驗或 Fisher 精確檢驗分析分類變量之間的差異。P值＜0.05，被認為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

一、患者一般情況

本實驗共納入 87 名受試者，其中 32 名根據(jù)體格檢查和影像學檢查結(jié)果被診斷為膝關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)病患者，平均年齡為 ( 44.16±9.27 ) 歲，膝關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)病組性別、年齡、體重和身體質(zhì)量指數(shù)與對照組相比，差異無統(tǒng)計學意義P＞0.05 )，而膝關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)病患者身高較低，臂跨度較窄，差異有統(tǒng)計學意義 (P＜0.05 ) ( 表 2 )。

二、COMP 蛋白結(jié)構(gòu)

COMP 是一種模塊蛋白，由氨基末端卷曲螺旋寡聚化結(jié)構(gòu)域、4 種表皮生長因子重復結(jié)構(gòu)域，8 種鈣調(diào)蛋白重復結(jié)構(gòu)域和羧基末端球狀結(jié)構(gòu)域組成，COMP 在哺乳動物物種中是非常保守的，并且在不同發(fā)育階段表現(xiàn)出不同的表達模式，表明其在轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)過程中受到嚴格控制，并且它是哺乳動物軟組織發(fā)育中的重要調(diào)節(jié)因子 ( 圖 1 )。

三、COMP 多態(tài)性

圖 1 COMP 蛋白結(jié)構(gòu)Fig. 1 COMP protein structure

表 2 患者身體指標統(tǒng)計Tab.2 Statistics of body indices

通過基因型檢測，在本研究條件下，膝關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)病家族的 COMP 外顯子 15 中鑒定發(fā)現(xiàn)一個新的變體 ( 1675 堿基-G 突變?yōu)?A，559 氨基酸-谷氨酸突變?yōu)橘嚢彼?)，統(tǒng)計所有受試者 COMP 基因型，膝關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)病組 COMP 基因突變頻率高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義 (P＜0.05 ) ( 表 3 )。

表 3 COMP 基因突變頻率與膝關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)病關(guān)系Tab.3 Relationship between COMP gene mutation frequency and knee osteoarthritis

四、WOMAC 膝關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)炎指數(shù)評分

WOMAC 膝關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)炎指數(shù)評分結(jié)果顯示，COMP 突變 A 等位基因與 COMP 正常 G 等位基因相比，WOMAC 膝關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)炎指數(shù)評分增加，膝關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)病組 WOMAC 膝關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)炎指數(shù)評分高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義 (P＜0.05 ) ( 表 4 )。

表 4 WOMAC 膝骨關(guān)節(jié)炎指數(shù)評分Tab.4 WOMAC knee osteoarthritis index

五、膝關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)病患者骨骼放射學檢查

本實驗通過放射學檢查受試者骨骼，X 線片顯示，膝關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)病患者手很小，趾骨和掌骨短而粗，有錐形的骨骺；脊柱側(cè)凸，上下脊柱的距離變寬；脛骨和腓骨輕度縮短，膝內(nèi)翻；骨盆無線電圖顯示髖臼角增大，髖關(guān)節(jié)間隙變窄，股骨頭變平，股骨頭不規(guī)則，頸部縮短 ( 圖 2 )。

六、膝關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)病家族代數(shù)與發(fā)病年齡關(guān)系

COMP 基因突變和發(fā)病年齡因家庭成員而異。隨著家族代數(shù)增加，COMP 基因突變頻率增加，平均發(fā)病年齡降低，第 4 代發(fā)病年齡為 ( 39.17± 8.64 ) 歲，第 5 代發(fā)病年齡為 ( 28.36±6.43 ) 歲，第 6 代發(fā)病年齡為 ( 14.13±3.51 ) 歲，差異有統(tǒng)計學意義 (P＜0.05 ) ( 表 5 )。

表 5 膝關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)病家族代數(shù)與發(fā)病年齡關(guān)系Tab.5 Relationship between family algebra and age at onset

七、血漿 COMP 和抗 CCP 抗體水平

使用酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒檢測 COMP 和抗 CCP 抗體水平，與對照組相比，膝關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)病組 COMP 和抗 CCP 抗體水平均明顯升高，膝關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)病組 COMP 突變 A 等位基因 COMP 和抗 CCP 抗體水平均高于 COMP 正常 G 等位基因，差異有統(tǒng)計學意義 (P＜0.05 ) ( 表 6 )。

表 6 血漿 COMP 和抗 CCP 抗體水平Tab.6 Plasma COMP and anti-CCP levels

圖 2 膝關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)病患者骨骼放射學檢查Fig.2 Radiographs of patients with knee osteoarthritis

討 論

COMP 基因含有 19 個外顯子，編碼 552 kDa 五聚體黏附糖蛋白，主要在軟骨，韌帶和肌腱中表 達[10]。COMP 是一種模塊蛋白，含有氨基末端結(jié)構(gòu)域，4 個表皮生長因子重復序列，8 個鈣調(diào)蛋白重復序列以及 1 個大的羧基末端球狀結(jié)構(gòu)域[11-12]。絕大多數(shù)先前鑒定的 COMP 突變 ( 約 95% ) 聚集在外顯子 8-14 內(nèi)，其余 5% 的突變位于外顯子 16 和 18 中[7,13]。這些包括點突變，其導致保守殘基的單氨基酸取代和刪除一個或多個殘基的密碼子的框內(nèi)缺 失[14-16]。位于染色體 19p12 上的 COMP 基因的外顯子 18 中鑒定的 c.2152 C＞T 取代導致 718 位的疏水性色氨酸對于帶正電荷的精氨酸的非保守取代，該突變位于 COMP 的 C 末端球狀結(jié)構(gòu)域中[17]。雖然沒有對色氨酸取代進行功能分析，但精氨酸的 718 位置在整個物種中是保守的，包括倭黑猩猩、牛科動物、馬、小鼠和大鼠[18]。本研究發(fā)現(xiàn) 32 個個體在 COMP 基因中攜帶 c.1675G＞ A 突變，其中 19 個受影響并顯示經(jīng)典的膝關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)病表型，13 個沒有突變，但具有膝關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)病的共同特征和放射學研究，平均發(fā)病年齡為 ( 30.26±3.68 ) 歲，可能是具有多因素遺傳的膝關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)病。外顯子 15 本課題組長期隨訪篩選的關(guān)鍵突變位點。

膝關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)病組 COMP 水平均明顯升高，表明 COMP 可作為區(qū)分膝關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)病患者和健康個體的有用實驗室標志物，也可用于判斷疾病的嚴重程度。在本研究中，抗 CCP 水平也被測量，與健康對照受試者相比，OA 患者的抗 CCP 水平顯著升高，抗 CCP 水平顯示出高特異性和低敏感性，用于區(qū)分膝關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)病患者和健康對照受試者。骨骼的成像特征在骨骼的骨破壞階段經(jīng)常發(fā)生變化，基于體格檢查，X 線片結(jié)果的早期診斷可能對建立治療策略沒有用。因此，骨關(guān)節(jié)功能障礙的早期評估需要具有高靈敏度和特異性的方法。在本研究中，血清 COMP 水平證明了用于區(qū)分膝關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)病患者和健康對照受試者的可接受的診斷性能。COMP 水平為 21.51 ng / ml 是區(qū)分 OA 患者和健康個體的最佳臨界值。

本研究有一些局限性。首先，樣本是從當?shù)蒯t(yī)院中選出的，這可能會對結(jié)果的推斷產(chǎn)生一些限制。因此，在推斷本研究結(jié)果時，應考慮樣本的代表性。其次，研究中的患者持續(xù)時間相對較長，因此個體的 COMP 值可能受多種因素的影響，這可能會影響最佳的臨界值。

綜上所述，本研究表明 COMP 基因多態(tài)性與常染色體顯性早熟性膝關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)病緊密相關(guān)，血清 COMP 水平有可能被用作 RA 中軟骨代謝的生物學標志物。血清 COMP 的臨界值為 21.51 ng / ml 可用于區(qū)分 RA 患者和健康個體。