王曦暉 薛成 周諒仙 程俊杰

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎 ( rheumatoid arthritis，RA ) 是一種以關(guān)節(jié)病變?yōu)橹鞯穆匀碜陨砻庖咝约膊?，目前尚無有效的根治方法[1]。B 細(xì)胞在 RA 發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮著關(guān)鍵性的作用，通過抑制 B 細(xì)胞的增殖和分化能夠有效地緩解 RA 的進(jìn)展[2]。軸突導(dǎo)向因子 ( Netrin-1 ) 是層粘連蛋白家族的成員之一，近期的研究發(fā)現(xiàn) Netrin-1 能夠抑制免疫細(xì)胞向炎癥部位遷移和募集，進(jìn)而避免局部炎癥反應(yīng)過度，引起組織的損傷[3-5]。本研究擬探討了解 Netrin-1 在 RA 患者的滑膜組織中的表達(dá)，并探討其在 B 細(xì)胞免疫中的作用，以期為 RA 的治療提供一個(gè)新的靶點(diǎn)。

材料與方法

一、納入標(biāo)準(zhǔn)與排除標(biāo)準(zhǔn)

1. 納入標(biāo)準(zhǔn)：RA 組：( 1 ) 符合《 2018 年中國類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎診療指南》診斷標(biāo)準(zhǔn)[6]；( 2 ) 在我院就診且行關(guān)節(jié)鏡穿刺活檢后病理學(xué)檢測后確診的 RA 患者；( 3 ) 年齡在 18～70 歲；( 4 ) 確診前 6 個(gè)月內(nèi)，未經(jīng)過免疫抑制治療。對照組：( 1 ) 于我院就診的外傷性截肢患者；( 2 ) 年齡在 18～70 歲；( 3 ) 未患有 RA 等疾病；( 4 ) 滑膜組織完整。

2. RA 組排除標(biāo)準(zhǔn)：( 1 ) 合并慢阻肺、糖尿病等慢性疾病者；( 2 ) 艾滋病患者；( 3 ) 乙肝病毒等感染患者；( 4 ) 長期吸煙；( 5 ) 酗酒者。對照組排除標(biāo)準(zhǔn)同 RA 組。

二、一般資料

選取 2012 年 7 月至 2017 年 10 月于本院就診的經(jīng)關(guān)節(jié)鏡穿刺活檢進(jìn)行病理學(xué)檢測證實(shí)的膝 RA 患者10 例，作為類風(fēng)濕組，年齡 21～45 歲，平均 ( 30.3±9.1 ) 歲。同時(shí)選取 2012 年 7 月至 2017 年 10 月于本院住院的 10 例外傷性截肢的健康人的滑膜組織作為對照組，年齡 22～43 歲，平均 ( 28.6± 8.5 ) 歲，兩組患者一般資料比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＞0.05 )。

三、研究方法

1. 免疫組化：石蠟切片脫蠟至水后，加入 3% 的過氧化氫，室溫反應(yīng) 3 min。之后用 PBS 清洗，羊血清工作液封閉 30 min，滴加 Netrin-1 或者 CD19 的一抗工作液，4 ℃ 過夜。PBS 清洗 3 次后，加入生物素標(biāo)記二抗工作液，37 ℃ 孵育 30 min，PBS 清洗。加入堿性磷酸酶標(biāo)記的鏈霉卵白素工作液， 37 ℃ 孵育 15 min，PBS 清洗。顯色劑顯色 10 min，清水沖洗，蘇木精復(fù)染，脫水、透明、封片、拍照后使用 IPP 軟件計(jì)算各組的平均光密度 ( IOD ) 或者計(jì)算陽性細(xì)胞的數(shù)目。

2. 流式檢測外周血中 Breg 的比例：采用梯度離心法分離外周血中的淋巴細(xì)胞，PBS 清洗 3 次后，加入 CD19 抗體，室溫孵育 20 min 后，PBS 清洗 3 次，之后破膜 30 min，PBS 清洗 3 次后，加入 IL-10 的抗體，室溫孵育后 30 min，PBS 洗 3 次，流式檢測 CD19＋I(xiàn)L-10＋Breg 的比例。

3. 淋巴細(xì)胞的分離和培養(yǎng)：收集 RA 患者的外周血，采用人淋巴細(xì)胞分離液分離外周血中的淋巴細(xì)胞，收集淋巴細(xì)胞，將其置于含有 10% 胎牛血清的 RPMI1640 培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。之后分成 3 組：對照組 ( 加入相同體積的 PBS )、低濃度 Netrin-1 組 ( 加入終濃度為 10 ng / ml 的 Netrin-1 ) 和高濃度 Netrin-1 組 ( 加入終濃度為 50 ng / ml 的 Netrin-1 )，刺激 48 h，流式檢測 B 細(xì)胞和 Breg 的比例。

四、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

使用 SPSS 15.0 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料用±s表示，采用t檢驗(yàn)進(jìn)行組之間的比較，相關(guān)性分析采用 Spearman 分析法，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、RA 患者滑膜組織 Netrin-1 表達(dá)顯著降低

免疫組化的結(jié)果顯示，經(jīng)過二氨基聯(lián)苯胺染色劑將辣根過氧化物酶染成棕色，從圖片中能夠看出，對照組染色后棕色物質(zhì)顯著對于 RA 組，即相對于對照組，RA 患者滑膜組織中的 Netrin-1 表達(dá)顯著的降低 ( 圖 1 )。

二、RA 患者滑膜組織 B 細(xì)胞的數(shù)目顯著升高

免疫組化的結(jié)果顯示，RA 組及對照組患者滑膜組織中的 CD19＋B 細(xì)胞的數(shù)目分別為 ( 64.24± 7.41 ) mm2、( 4.40±1.34 ) mm2，與對照組比較，RA 組滑膜組織中的 CD19＋B 細(xì)胞的數(shù)目升高了 14.6 倍，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (t＝7.471，P＜0.001 )。相關(guān)性分析的結(jié)果顯示 Netrin-1 的表達(dá)與 B 細(xì)胞的數(shù)目，有明顯的負(fù)相關(guān)性 (r＝-0.8049，P＜0.001 ) ( 圖 2 )。

三、RA 患者外周血中 Breg 的比例顯著降低

流式結(jié)果顯示，RA 組與對照組患者外周血中 CD19＋B 細(xì)胞的比例分別為 ( 2.64±0.38 ) %、( 1.73± 0.22 ) %，與對照組比較，RA 組患者外周血中 CD19＋ B 細(xì)胞的比例升高了 1.53%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (t＝ 4.013，P＜0.001 )。RA 組與對照組患者 CD19＋I(xiàn)L-10＋Breg 數(shù)目分別為 ( 1.86±0.38 ) %、( 6.58± 0.87 ) %，相對于對照組，RA 組患者 CD19＋I(xiàn)L-10＋ Breg 數(shù)目降低了 3.54%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (t＝6.526，P＜0.001 )。相關(guān)性分析的結(jié)果顯示 Netrin-1 的表達(dá)與外周血中 Breg 比例具有顯著的正相關(guān)性 (r＝0.7256，P＜0.001 ) ( 圖 3 )。

圖 1 RA 患者滑膜組織 Netrin-1 表達(dá)顯著降低 a ～b：采用 HE 染色，× 200 倍；c～d：采用免疫組化染色，× 200Fig.1 The expression of Netrin-1 in synovial tissues of RA patients was significantly decreased a - b: Stained with HE, × 200; c - d: Stained with immunohistochemical staining, × 200

圖 2 RA 患者滑膜組織 B 細(xì)胞的數(shù)目顯著升高 ( *vs. 對照組， P ＜ 0.05；免疫組化染色，× 200 ) Fig.2 The number of B cells in synovial tissues of RA patients was significantly increased ( *vs. control group, P ＜ 0.05; immunohistochemical staining, × 200 )

四、Netrin-1 促進(jìn) Breg 比例的升高

體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，RA 組、Netrin-1 低濃度組及 Netrin-1 高濃度組 B 細(xì)胞比例分別為 ( 16.27± 3.45 ) %、( 7.33±1.02 ) %、( 4.24±0.68 ) %，與 RA 組比較，Netrin-1 低濃度組及 Netrin-1 高濃度組 B 細(xì)胞的比例分別降低了 2.22% 和 3.84%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (t＝3.320，P＝0.029；t＝4.858，P＝ 0.008 )。RA 組、Netrin-1 低濃度組及 Netrin-1 高濃度組 Breg 比例分別為 ( 2.23±0.25 ) %、( 3.57± 0.39 ) %、( 4.61±0.86 ) %，與 RA 組比較，Netrin-1 低濃度組及 Netrin-1 高濃度組 Breg 比例分別上升了 1.60% 和 2.08%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (t＝4.899，P＜0.001；t＝6.887，P＜0.001 ) ( 圖 4 )。

討 論

RA 是一種全身系統(tǒng)性的疾病，目前尚無有效的根治方法，臨床上主要進(jìn)行免疫抑制治療緩解病情的進(jìn)展，然而其副作用很大[7]。RA 常常合并神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的損害，RA 合并神經(jīng)系統(tǒng)病變可累及中樞神經(jīng)、植物神經(jīng)等。研究表明，通過神經(jīng)電生理檢查發(fā)現(xiàn)，RA 患者外周神經(jīng)病變檢測率高達(dá) 39.19%[8]。 可見 RA 合并神經(jīng)疾病病變是 RA 常見的關(guān)節(jié)外表現(xiàn)之一，但神經(jīng)分子在 RA 發(fā)生和發(fā)展中的作用目前還未見相關(guān)的報(bào)道[9]。本研究了神經(jīng)分子 Netrin-1 與 RA 的關(guān)系，為 RA 的靶向治療提供了一個(gè)新的可能的靶點(diǎn)。

本研究發(fā)現(xiàn)，免疫組化結(jié)果顯示 Netrin-1 在 RA 組患者中表達(dá)顯著降低。說明 RA 患者呈現(xiàn) Netrin-1 低表達(dá)。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，RA 組 CD19＋B 細(xì)胞的數(shù)目及外周血 CD19＋B 細(xì)胞比例顯著高于對照組，CD19＋I(xiàn)L-10＋Breg 數(shù)目顯著低于對照組。研究發(fā)現(xiàn)，與正常人比較，RA 患者外周血中 Breg 的比例顯著降低[10]，與本研究結(jié)果類似。Breg 是一類具有免疫抑制作用的 B 細(xì)胞，能夠通過分泌 IL-10 和 TGF-β 等免疫抑制分子，維護(hù)機(jī)體免疫系統(tǒng)的平衡和穩(wěn)定[11]。Breg 在 RA 的發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮著關(guān)鍵性作用[12]。

圖 3 RA 患者外周血中 Breg 的比例顯著降低 ( *vs. 對照組，P ＜ 0.05 ) Fig.3 The proportion of Breg in the peripheral blood of RA patients was significantly decreased ( *vs. control group, P ＜ 0.05 )

圖 4 Netrin-1 促進(jìn) Breg 比例的升高 ( *vs. RA 組，P ＜ 0.05 ) Fig.4 Nettrin-1 promoted an increase of Breg proportion ( *vs. RA group, P ＜ 0.05 )

本研究發(fā)現(xiàn) RA 患者滑膜組織中 Netrin-1 表達(dá)與外周血中 Breg 的比例呈負(fù)相關(guān)，體外的研究發(fā)現(xiàn) Netrin-1 能夠促進(jìn) Breg 比例的升高，且具有濃度相關(guān)性。Breg 比例的升高能夠顯著增加 IL-10 的分泌，抑制 Th1 細(xì)胞的分化，減少 RA 的發(fā)生率[13-14]。 進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，Netrin-1 濃度的升高可以顯著的降低 B 細(xì)胞的比例，Netrin-1 高濃度可以顯著提高 Breg 比例。這說明 Netrin-1 可能在 RA 的發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮著重要的作用。Netrin-1 是一種神經(jīng)分子，具有顯著的誘導(dǎo)神經(jīng)生長和再生的作用[15]。近期的研究發(fā)現(xiàn) Netrin-1 具有強(qiáng)大的免疫調(diào)節(jié)功能，能夠發(fā)揮細(xì)胞保護(hù)和誘導(dǎo)免疫耐受的作用[16]。通過本研究得出的結(jié)果，Netrin-1 可能是通過改變 Breg 比例、B 細(xì)胞比例等發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用，進(jìn)一步發(fā)揮對 RA 的作用。

綜上所述，Netrin-1 在 RA 滑膜組織中低表達(dá)，Netrin-1 可能通過促進(jìn) Breg 的分化，對 RA 的治療具有一定的作用。本研究為 RA 的靶向治療提供了一個(gè)新的可能的靶點(diǎn)。