彭偉秋 張祥洪 韋釗嵐 丘立標(biāo) 張湘生 劉儻

骨關(guān)節(jié)炎 ( osteoarthritis，OA ) 是一種常見的關(guān)節(jié)疾病，是力學(xué)和生物學(xué)因素作用下軟骨細(xì)胞、細(xì)胞外基質(zhì)以及軟骨下骨三者降解和合成失衡的結(jié) 果[1]。OA 的生物學(xué)因素非常復(fù)雜，國內(nèi)外對生物學(xué)因素的研究主要針對一些細(xì)胞因子和炎癥介質(zhì)在 OA 的病理生理中的作用和相互關(guān)系，而對正常關(guān)節(jié)如何產(chǎn)生 OA 的始動病因缺乏有力依據(jù)。

早期的研究者認(rèn)為納米細(xì)菌 ( nanobacteria，NB ) 是一種人畜共患的致病原。新研究認(rèn)為，NB 是一種具有高仿生特性的有機(jī)顆粒 ( calcifying nanoparticles，CNPs )，這種顆粒在形態(tài)、生長、增殖和傳代培養(yǎng)特性上有著類似于細(xì)菌的生物特性，與人類許多病理性鈣化和退行性疾病相關(guān)[2]。

傳統(tǒng)觀點(diǎn)認(rèn)為 OA 是關(guān)節(jié)內(nèi)無菌性炎癥反應(yīng)，但卻無法解釋關(guān)節(jié)液中常規(guī)細(xì)菌培養(yǎng)陰性的 OA 患者，其關(guān)節(jié)液中常發(fā)現(xiàn)有膿球、局部發(fā)熱、腫痛等一系列“感染性”炎癥反應(yīng)，而且對軟骨下骨的硬化性病理改變也缺乏合理解釋。根據(jù) Tsurumoto 等報道在 2 例人膝 OA 患者的關(guān)節(jié)液中可檢測出 NB，我們分析 NB 可感染機(jī)體任何組織細(xì)胞的炎癥性疾病特性和生物礦化特點(diǎn)與 OA 患者不明原因的“感染性”炎癥反應(yīng)和軟骨下骨硬化的病理變化特點(diǎn)后推測：NB 有可能與 OA 的發(fā)病有關(guān)

本研究通過對膝關(guān)節(jié) OA 患者關(guān)節(jié)軟骨中 NB 的檢測以探討 NB 與 OA 的關(guān)系，為 OA 的研究提供新線索。

材料與方法

一、納入標(biāo)準(zhǔn)與排除標(biāo)準(zhǔn)

1. 納入標(biāo)準(zhǔn)：( 1 ) 2017 年 1 月至 2018 年 3 月，我院收治的晚期膝關(guān)節(jié) OA 患者；( 2 ) 膝關(guān)節(jié) X 線片示骨贅形成關(guān)節(jié)間隙狹窄符合膝關(guān)節(jié) OA 的診斷標(biāo)準(zhǔn)者；( 3 ) 近 1 個月大多數(shù)時間有膝關(guān)節(jié)疼痛者；( 4 ) 有骨摩擦音者；( 5 ) 關(guān)節(jié)液檢查符合 OA 者； ( 6 ) 簽署知情同意書者。

2. 排除標(biāo)準(zhǔn)：( 1 ) 類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者；( 2 ) 感染性關(guān)節(jié)炎患者；( 3 ) 痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎患者；( 4 ) 有嚴(yán)重并發(fā)癥及全身感染患者。

二、臨床資料

本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)。

本研究膝關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)炎組納入 30 例膝關(guān)節(jié) OA 患者的病變關(guān)節(jié)軟骨的標(biāo)本，正常膝關(guān)節(jié)組納入 30 例正常軟骨標(biāo)本。膝關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)炎組關(guān)節(jié)軟骨標(biāo)本來源于我院行膝關(guān)節(jié)表面置換術(shù)的患者。30 例膝關(guān)節(jié) OA 患者中男 12 例，女 18 例；右側(cè) 23 例，左側(cè) 7 例，平均 63.2 歲。正常膝關(guān)節(jié)組的正常軟骨標(biāo)本來源于急性髕骨脫位與膝外傷致軟骨損傷患者關(guān)節(jié)鏡檢時收集的創(chuàng)傷性剝脫的軟骨顆粒。30 例正常膝關(guān)節(jié)組男 21 例，女 9 例；右側(cè) 12 例，左側(cè) 18 例；平均 28.5 歲 ( 表 1 )。

表 1 膝關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)炎組與正常膝關(guān)節(jié)組關(guān)節(jié)軟骨的情況 Tab.1 Articular cartilage characteristics in knee OA group and normal group

三、研究方法

1. 培養(yǎng)方法：無菌條件下將膝關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)炎組和正常膝關(guān)節(jié)組的軟骨用生理鹽水反復(fù)清洗后用無菌玻璃棒皿研磨成直徑 0.5 mm 顆粒，生理鹽水稀釋過濾離心，取下清液 2 ml 經(jīng) 0.45 μm 的濾紙過濾。濾液再用生理鹽水稀釋、離心，取下清液 2 ml 經(jīng) 0.22 μm 的濾菌器過濾，取濾液 2 ml 與 8 ml 含 10% FBS 的 DMEM 培養(yǎng)基放在條件為 37 ℃、pH7.4、5% CO2和 95% 空氣的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；標(biāo)本每 6 周換培養(yǎng)液 1 次。

2. 電解質(zhì)動態(tài)監(jiān)測：每 2 周分別取膝關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)炎組和正常膝關(guān)節(jié)組的培養(yǎng)液檢測，每瓶 1 ml 離心，取上清液送檢。

3. NB 鑒定：( 1 ) 光鏡觀察：每周在光鏡下觀察膝關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)炎組和正常膝關(guān)節(jié)組培養(yǎng)液的變化。 ( 2 ) 免疫熒光染色鑒定：分別將培養(yǎng) 6 周膝關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)炎組和正常膝關(guān)節(jié)組的培養(yǎng)液常溫離心，轉(zhuǎn)速 13 200 rpm / min，時間 5 min，吸除上清液，沉淀物用無菌 PBS 液 1 ml 洗滌 2 次，每次洗滌后按上面轉(zhuǎn)速及時間離心，棄上清液，將沉淀用少量 PBS 稀釋后涂片，防塵自然風(fēng)干。用 300 μl 的 3% 的脫脂奶粉液封片 10 min；陽性片加 300 μl 一抗應(yīng)用液，陰性片加 300 μl 一抗稀釋液；防塵保存 1 h，吸干；300 μl PBS 洗 3 次×3 min，吸干；轉(zhuǎn)入暗室操作，加二抗應(yīng)用液 300 μl，染色 30 min，吸干；PBS 洗 3 次×3 min，在蒸餾水中漂洗 5 s，濾紙吸干后上熒光顯微鏡觀察。在 UV 光下觀察，發(fā)綠色熒光即為 NB。( 3 ) NB 電鏡檢查：培養(yǎng) 6 周的膝關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)炎組培養(yǎng)液離心，沉淀物用 3% 戊二醛固定送電鏡室進(jìn)行透視電鏡觀察。

四、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用 SPSS 21.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料采用±s表示，計(jì)量資料組間比較采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料采用χ2分析，檢驗(yàn)水準(zhǔn) α 值取雙側(cè) 0.05。

結(jié) 果

一、電解質(zhì)檢測結(jié)果

實(shí)驗(yàn)中每 2 周檢測 1 次兩組培養(yǎng)液中的 K、Na、Cl、Ca、Mg 和 P 的濃度。膝關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)炎組培養(yǎng) 2 周，全部 30 例標(biāo)本培養(yǎng)液中 Ca、P 的濃度開始下降，且隨時間延長其含量逐漸降低，每 2 周一個時間段進(jìn)行比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＝0.02 )，而 K、Na、Cl 和 Mg 沒有明顯的變化 (P＝0.52 ) ( 表 2 )。正常關(guān)節(jié)組 29 例標(biāo)本培養(yǎng)液中 K、Na、Cl、Ca、Mg 和 P 濃度 6 周內(nèi)無明顯變化，每 2 周為一個時間段，進(jìn)行比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＝0.51 ) ( 表 3 )。

二、光鏡觀察結(jié)果

膝關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)炎組：2 周時可以看到一些細(xì)小顆粒；4 周時小顆粒增多增大貼壁生長；6 周時小顆粒成團(tuán)片狀 ( 圖 1a，b )。正常膝關(guān)節(jié)組：29 例 2 周、4 周、6 周時培養(yǎng)液中沒有觀察到小顆粒； 1 例可以觀察到與膝關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)炎組相似結(jié)果。

三、免疫熒光染色鑒定結(jié)果

納米細(xì)菌的單克隆抗體行熒光染色鑒定結(jié)果：正常膝骨關(guān)節(jié)組 29 例標(biāo)本培養(yǎng)液中沒有發(fā)現(xiàn) NB ( 圖 2a )，1 例發(fā)現(xiàn)有發(fā)綠色光亮點(diǎn)的 NB，NB 陽性率 3.33%。膝關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)炎組 30 例標(biāo)本培養(yǎng)液中 NB 的單克隆抗體熒光染色鑒定均發(fā)現(xiàn)有發(fā)綠色光亮點(diǎn)的 NB ( 圖 2b )，NB 陽性率100%。兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＝0.043 ) ( 表 4 )。

四、透射電鏡鑒定結(jié)果

表 4 膝關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)炎組與正常關(guān)節(jié)組關(guān)節(jié)軟骨中 NB 檢測陽性率比較 ( χ2 )Tab.4 Comparison of the positive rate of NB between the knee OA group and the normal group ( χ2 )

表 2 膝關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)炎組 30 例標(biāo)本培養(yǎng)過程中電解質(zhì)隨時間的變化 ( x- ± s，mmol / L )Tab.2 Electrolyte changes with time in the culture process of the OA group ( x- ± s, mmol / L)

表 3 正常關(guān)節(jié)組 30 例標(biāo)本培養(yǎng)過程中電解質(zhì)隨時間的變化 ( x- ± s，mmol / L )Tab.3 Electrolyte changes with time in the culture process of the normal group ( x- ± s, mmol / L)

圖 1 培養(yǎng) 6 周時光鏡下觀察 a：正常關(guān)節(jié)組無小顆粒形成；b：膝關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)炎組小顆粒成團(tuán)片狀Fig.1 Observation under light microscope after 6 weeks’ culture a: No small particles were formed in the normal group; b: Small particles were clustered and flaky in the OA group

膝關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)炎組培養(yǎng) 6 周的標(biāo)本在 30 000 倍透射電鏡下可以觀察到大小不等、密度較高呈黑色的納米大小球狀或球桿狀微粒。同一標(biāo) 20 000 倍掃描電鏡下觀到灰白色的球狀或球桿狀的大小不等納米顆粒，大小為 80～400 nm ( 圖 3a、b )。

討 論

一、NB 的特性

NB 近年來廣受關(guān)注和爭議。它最先由芬蘭科學(xué)家 Kajander 發(fā)現(xiàn)并命名[3]。早期研究者認(rèn)為 NB 是一種革蘭氏陰性菌，廣泛存在于自然界，可感染任何機(jī)體的組織細(xì)胞致??；NB 除了具有革蘭氏陰性菌的特性外，還具有兩大基本特征：( 1 ) 菌體直徑小，約 50～500 nm；( 2 ) 菌體周圍可形成羥磷灰石碳酸鹽礦化外殼。最新的研究認(rèn)為，NB 體積太小，無法攜帶生命的大分子物質(zhì)核酸和蛋白質(zhì)，PCR 檢測也無法測出確定的 DNA 或 RNA；NB 屬非生物的鈣化有機(jī)納米顆粒，具有仿生特性，在形態(tài)、生長、增殖和傳代培養(yǎng)特性上有著類似于細(xì)菌生物特性[4]。盡管關(guān)于 NB 是否是微生物存在爭議，但是 NB 的支持者與反對者都一致認(rèn)為：NB 與人類結(jié)石類疾病和病理性鈣化類疾病密切相關(guān)，也與人類退化性疾病密切相關(guān)[5-6]。

二、NB 與 OA 的關(guān)系

骨是人體內(nèi)最大的鈣化組織，NB 可感染任何生物組織和細(xì)胞的特性和 NB 與人類病理性鈣化類疾病相關(guān)的特點(diǎn)，表明二者關(guān)系密切。NB 與骨關(guān)節(jié)疾病的關(guān)系國內(nèi)相關(guān)文獻(xiàn)報道少。Tsurumoto 等[7]報道在 2 例 OA 和 4 例類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者的關(guān)節(jié)液檢測出 NB，但樣本數(shù)量少，也沒有探討 NB 與 OA 的關(guān)系。張名均等[8]研究發(fā)現(xiàn) NB 對人成骨細(xì)胞 C3H10 具有細(xì)胞毒性作用，主要機(jī)制是通過促進(jìn)細(xì)胞凋亡發(fā)揮細(xì)胞毒作用。同時 NB 能促進(jìn)鈣化相關(guān)蛋白 BMP-2 的表達(dá)，也能引起凋亡相關(guān)蛋白 Bax 的表達(dá)升高。石慶新等[9]在探討類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者和正常人群血清標(biāo)本中 NB 分布情況時，對正常人群和類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者的血清進(jìn)行 NB 培養(yǎng)和檢測，結(jié)果正常人和類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者血清 NB 的陽性檢出率分別為 6.7% 和 30.0%，提示類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的發(fā)病和 NB 感染可能有關(guān)。

三、NB 與膝骨關(guān)節(jié)的關(guān)系

本研究通過對膝關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)炎組和正常膝關(guān)節(jié)組的關(guān)節(jié)軟骨培養(yǎng)液的電解質(zhì)的變化檢測，發(fā)現(xiàn)對人體必需的 K、Na、Cl 和 Mg 元素在兩個培養(yǎng)組中無明顯變化 (P＞0.05 )，但 Ca 和 P 元素在正常關(guān)節(jié)組中無明顯變化 (P＞0.05 ) 卻在膝關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)炎組濃度逐漸減少，且第 4 周與第 6 周分別與對照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＜0.05 )；這符合 NB 培養(yǎng)過程中需要 Ca、P 但不需要 K、Na、Cl 和 Mg 等元素的特性[10]。這一結(jié)果表明膝關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)炎組關(guān)節(jié)軟骨中有 NB 存在。

本研究膝關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)炎組和正常膝關(guān)節(jié)組標(biāo)本培養(yǎng) 6 周，進(jìn)行 NB 單克隆抗體免疫熒光染色鑒定，發(fā)現(xiàn)膝關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)炎組全部 30 例標(biāo)本都發(fā)現(xiàn)有發(fā)綠色光的 NB 存在，陽性率 100%；正常膝關(guān)節(jié)組只有 1 例發(fā)現(xiàn) NB，而其它 29 例標(biāo)本中沒有發(fā)現(xiàn) NB，陽性率僅為 3.33%。兩組 NB 檢測陽性率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＜0.05 )，表明 NB 與膝關(guān)節(jié) OA 有著密切關(guān)系。這一結(jié)果也與 Tsurumoto 等[11]報告的結(jié)果一。單克隆抗體免疫熒光染色結(jié)果證實(shí)膝關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)炎組關(guān)節(jié)軟骨中有 NB。

正常關(guān)節(jié)組中有 1 例也檢測到 NB 的可能原因有：( 1 ) 被檢測對象是 OA 的早期；( 2 ) 由于約 8% 的健康中國人血清中存在有 NB，被檢測對象是 NB 攜帶者；( 3 ) 培養(yǎng)標(biāo)本感染 NB[12]。

膝關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)炎組的 NB 電鏡檢測，可以觀察到球狀或球桿狀、具有礦化外殼的 NB 顆粒，測量其大小約為 80～400 nm，這與文獻(xiàn)報道的結(jié)果相似[10]。電鏡結(jié)果證實(shí)膝關(guān)節(jié) OA 患者的關(guān)節(jié)軟骨中有 NB。

雖然關(guān)于 NB 的討論還在繼續(xù)，但 NB 的腎結(jié)石動物模型[13]和膽囊結(jié)石動物模型[14]的成功復(fù)制為本研究提供了新方法。本研究結(jié)果顯示膝關(guān)節(jié) OA 患者關(guān)節(jié)軟骨中 NB 的培養(yǎng)檢測陽性率 100%，而正常膝關(guān)節(jié)軟骨中 NB 的檢測陽性率僅為 3.33%。表明 NB 與 OA 密切相關(guān)，NB 可能與 OA 的發(fā)病有關(guān)。