陳萍，王篤雄，羅健，張健，葉天文，袁德義

1.中南林業(yè)科技大學(xué) 經(jīng)濟(jì)林育種與栽培國(guó)家林業(yè)局重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南長(zhǎng)沙 410004；

2.澄邁樂香種苗管理有限公司，海南澄邁 571900；

3.信陽農(nóng)林學(xué)院園藝學(xué)院，河南信陽 465200

油茶是中國(guó)特有的木本油料樹種，也是海南島的傳統(tǒng)植物資源，海南島特有的氣候環(huán)境條件孕育了豐富而具有特色的油茶資源[1-2]。海南種植油茶歷史悠久，品質(zhì)優(yōu)良，所產(chǎn)茶籽油的口感與品質(zhì)有別于內(nèi)地，茶油具有獨(dú)特的香味，在當(dāng)?shù)乇环Q為“山柚油”[3-5]，價(jià)格較為昂貴。

葉片是植物進(jìn)行光合作用、呼吸作用和水分交換最主要的器官，對(duì)溫度、水分、光照等環(huán)境因子的反應(yīng)較為明顯[6-7]。一般認(rèn)為，耐熱性較強(qiáng)的植物種具有較大的葉片厚度、柵欄組織厚度、柵海比以及較大的氣孔密度，并且關(guān)于植物葉片解剖結(jié)構(gòu)與高溫脅迫的研究已在杜鵑（Rhododendron simsii Planch）、珙桐（Davidia involucrata Baill）、報(bào)春（Primula malacoides Franch）等植物中有相關(guān)報(bào)道。張騰駒[8]等，采用石蠟切片法、NaCIO 法觀察，結(jié)果表明珙桐種群植物葉片耐熱性主要有柵海比、柵欄組織厚度、氣孔密度、下表皮角質(zhì)厚度、主脈凸起度、上表皮角質(zhì)層厚度、下表皮細(xì)胞厚度等指標(biāo)；申惠翡等[9]等對(duì)杜鵑花通過對(duì)葉片電鏡掃描對(duì)15 個(gè)品種葉片的17 項(xiàng)解剖結(jié)構(gòu)研究，利用變異系數(shù)、相關(guān)分析和聚類分析對(duì)杜鵑花葉片解剖結(jié)構(gòu)與其植株耐熱性的關(guān)系。曾慧敏等[10]研究了28 個(gè)八仙花（Hydrangea macrophylla）品種葉片的解剖結(jié)構(gòu)指標(biāo)進(jìn)行觀察，通過聚類分析及隸屬函數(shù)的方法研究了八仙花葉片解剖結(jié)構(gòu)與其耐旱性的關(guān)系。

有研究表明油茶在0℃以下的長(zhǎng)期寒冷，或35℃以上的高溫，都會(huì)對(duì)油茶花造成凍害、灼傷、落花落蕾、花芽無法正常分化。油茶在最高月平均氣溫為31.0℃，絕對(duì)最高氣溫42.0℃以上，生長(zhǎng)便受到抑制，葉片萎靡，果實(shí)脫落，甚至死亡，會(huì)直接影響油茶的產(chǎn)量和質(zhì)量[11]。課題組自承擔(dān)國(guó)家林業(yè)公益性行業(yè)科研專項(xiàng)以來，對(duì)海南油茶資源進(jìn)行了深入調(diào)研，發(fā)現(xiàn)并收集了一批優(yōu)質(zhì)海南油茶資源。通過對(duì)收集的種質(zhì)資源利用高接換冠技術(shù)嫁接后發(fā)現(xiàn)，不同無性系油茶的耐熱性不同，所反映出的生長(zhǎng)變化也不同，所以通過探討油茶葉片組織結(jié)構(gòu)與耐熱性的關(guān)系，并篩選出耐熱性強(qiáng)的種質(zhì)資源，建立一套完備快捷的耐熱性評(píng)價(jià)指標(biāo)體系是十分必要的基礎(chǔ)工作。因此，研究通過對(duì)高接換冠后的海南油茶優(yōu)質(zhì)資源的葉片解剖結(jié)構(gòu)特征進(jìn)行差異比較及相關(guān)性分析，將其耐熱能力進(jìn)行綜合排序，以期為海南油茶種質(zhì)資源良種選育和擴(kuò)繁提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)地概況

試驗(yàn)地設(shè)在海南省澄邁縣福山鎮(zhèn)的中南林業(yè)科技大學(xué)教學(xué)實(shí)習(xí)基地，地處19°56′45″N、109°45′56″E，屬熱帶季風(fēng)氣候，長(zhǎng)夏無冬，熱雨同季，年平均氣溫23.8℃。土壤為赤紅壤，pH 值為5.0～5.5，且富硒程度高，具備油茶栽培的優(yōu)良環(huán)境[5，12]。

1.2 試驗(yàn)材料

2017 年4 月在該基地應(yīng)用高接換冠技術(shù)對(duì)10個(gè)海南油茶無性系進(jìn)行高接換冠，接后2a 基本恢復(fù)樹勢(shì)，選取生長(zhǎng)旺盛，樹冠豐滿，無病蟲害，株體大小、土壤和光照條件基本一致的植株采集葉片固定保存。

1.3 葉片組織結(jié)構(gòu)觀察

采用石蠟切片法[13-14]，乙醇梯度脫水，浸蠟、包埋，Leica RM 切片，切片厚度8μm，番紅—固綠雙重染色，中性樹膠封片。在OLYMPUS-BX53 型顯微鏡及其成像系統(tǒng)下觀察、拍照，采用Image-Pro-plus 軟件測(cè)量其葉片厚度（Leaf thickness）、主脈厚度（MT）、上表皮角質(zhì)層厚度（Cuticle thickness of upper epidermis）、下表皮角質(zhì)層厚度（Cuticle thickness oflower epidermis）、角 質(zhì) 層 厚 度（Stratum corneum thickness）、上表皮細(xì)胞厚度（Thickness of upper epidermis）、下表皮細(xì)胞厚度（Thickness of lower epidermis）、柵欄組織厚度（Thickness of palisade tissue）與海綿組織厚度（Thickness of snoopy tissue），計(jì)算柵/ 海（P/S）=柵欄組織厚度（TP）/海綿組織厚度（TS）；組織結(jié)構(gòu)緊密度（Tightness of leaf structure）=柵欄組織厚度（TP）/葉片厚度（LT）×100%；組織結(jié)構(gòu)疏松度（Looseness of leaf structure）=海綿組織厚度（TS）/葉片厚度（LT）×100%，變異系數(shù)（CV）=（標(biāo)準(zhǔn)差/平均值）×100%[15-16]。每1 植株觀察10 張切片，每個(gè)制片選3 個(gè)視野進(jìn)行測(cè)量，所有數(shù)據(jù)為30 個(gè)視野的平均值。

1.4 氣孔觀察

采用無色透明的指甲油印跡法制片[17-18]，進(jìn)行氣孔密度測(cè)定；在OLYMPUS-BX53 型顯微鏡及其成像系統(tǒng)下觀察、拍照，采用Image-Pro-plus 軟件測(cè)量氣孔長(zhǎng)度（Stoma length）及氣孔密度（Stoma density）。每個(gè)材料觀測(cè)5 個(gè)典型視野中氣孔，并求其平均值。

1.5 數(shù)據(jù)分析

采用Excel 2016 進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，運(yùn)用SPSS 21.0 進(jìn)行單因素方差、差異顯著性（P＜0.05）及線性相關(guān)關(guān)系分析。利用模糊數(shù)學(xué)中的隸屬函數(shù)法綜合評(píng)價(jià)10 個(gè)海南油茶種質(zhì)材料的耐熱性[19]。

式中：Ri2為每類中第i 類中各項(xiàng)指標(biāo)的相關(guān)指數(shù)；n 為每類中的指標(biāo)個(gè)數(shù)(i=1，2，3，…，n)；r 為每類中各項(xiàng)指標(biāo)與同類其他指標(biāo)的相關(guān)系數(shù)，指標(biāo)的相關(guān)指數(shù)越大，典型性越強(qiáng)。

隸屬函數(shù)公式為：

式中：f(Xi)為某一種群某一項(xiàng)耐熱指標(biāo)的隸屬函數(shù)值；Xi為該項(xiàng)耐熱指標(biāo)觀測(cè)值；Xmax和Xmin分別為10 個(gè)種質(zhì)資源內(nèi)該項(xiàng)耐熱指標(biāo)的最大值和最小值。

根據(jù)上述公式計(jì)算篩選出海南不同油茶資源葉片耐熱性解剖結(jié)構(gòu)指標(biāo)的平均隸屬度，以平均隸屬度評(píng)價(jià)油茶的耐熱性，平均隸屬度越大，耐熱性越強(qiáng)。同時(shí)，參照靳路真等[20]的方法，按照平均隸屬度將耐熱性分為耐熱類型（R）、中耐熱類型（MR）、低耐熱類型（LR）和不耐熱類型（S）。

2 結(jié)果與分析

2.1 葉片組織結(jié)構(gòu)比較

2.1.1 葉片生長(zhǎng)參數(shù)

如表1 所示，試驗(yàn)選擇的10 份海南省本地油茶資源，由于生長(zhǎng)環(huán)境不同，不同油茶資源的葉片形態(tài)表現(xiàn)出顯著差異（見表1）。MTP-61 的葉長(zhǎng)、葉寬、葉面積干重均高于其它無性系，而QZCZ-4 的葉長(zhǎng)、葉寬，葉面積干重最低。

表1 10 個(gè)海南油茶無性系葉片生長(zhǎng)情況比較Tab.1 Comparison of leaf growth of 10 Camellia hainanica materials

2.1.2 葉片厚度比較

葉片厚度常作為植物耐熱性指標(biāo)之一。葉片厚度越大，水分散失越慢，在炎熱的環(huán)境下可降低水分蒸騰速率，緩解高溫對(duì)葉片的傷害程度。由表2 可見，10 個(gè)海南油茶無性系葉片厚度在340.41μm～457.46μm 之間，平均葉片厚度為394.59μm，最厚葉片與最薄葉片相差117.05μm，變異系數(shù)為10.39%，存在極顯著差異（p＜0.01）。不同種質(zhì)材料葉片厚度大小依次為：QZCZ-4＞TCPX-6＞MX-2＞TCPX-7 ＞CMWR-16 ＞BFC-CDL ＞CSC-1 ＞MTP-61 ＞CMJL-6＞QZCZ-3。

表2 10 個(gè)海南油茶無性系葉片表皮特征比較Tab.2 Comparison of epidermis characteristics of 10 Camellia hainanica leaves

2.1.3 葉表皮特征比較

表皮是植物的保護(hù)組織，是植物抵御外界不良環(huán)境的屏障。葉表皮包括上表皮和下表皮。由圖1 可見，10 個(gè)海南油茶無性系葉片表皮均為單層細(xì)胞且呈長(zhǎng)方形或者不規(guī)則扁長(zhǎng)方形排列構(gòu)成，上表皮細(xì)胞比下表皮細(xì)胞大，表皮外覆角質(zhì)層，表皮無毛，表皮細(xì)胞垂周壁略呈波浪狀。而CMWR-16 中上表皮細(xì)胞為規(guī)則的扁長(zhǎng)方形，排列緊密。由表2 可知，10 個(gè)海南油茶無性系的上表皮均厚于下表皮，差異均達(dá)到極顯著水平。上表皮厚度在25.67μm～45.50μm之間，最厚上表皮是最薄上表皮的1.78 倍，變異系數(shù)為18.14%和16.82%，存在極顯著差異（p＜0.01）。上表皮厚度和下表皮厚度分別在33.47μm ～20.75μm，其中CMWR-16 上表皮最薄，TCPX-6 最厚，其相應(yīng)平均值為25.67μm 和45.50μm。下表皮細(xì)胞厚度最厚的是BFC-CDL，CSC-1 最薄，其平均值為24.56μm 和14.58μm，其中TCPX-7、TCPX-6，上表皮細(xì)胞垂周壁略呈波浪狀(圖1)；葉片的表皮細(xì)胞壁外覆有一層4.91μm～8.08μm 的上表皮角質(zhì)層和1.79μm～3.87μm 的下表皮角質(zhì)層，而這種角質(zhì)層是一層不透水的脂肪性物質(zhì)，起防止水分散失的作用，通常角質(zhì)層厚度越大，表明其耐熱性越強(qiáng)。不同油茶種質(zhì)品種角質(zhì)層平均厚度為1.68μm，MX-2最厚，CSC-1 最薄，變異系數(shù)為42.57%

圖1 10 個(gè)海南油茶無性系葉片橫切Fig.1 Cross section of 10 Camellia hainanica leaves

2.1.4 葉片的葉肉特征比較

植物葉片主要通過葉肉組織完成各種生理機(jī)能。葉肉組織主要包括柵欄組織和海綿組織，其分化程度可以間接反應(yīng)植物對(duì)外界環(huán)境適應(yīng)的強(qiáng)弱。由圖1 可知，海南油茶種質(zhì)資源葉肉均有明顯的柵欄組織和海綿組織的分化，柵欄組織是由緊密的柱狀細(xì)胞排列，海綿組織主要由排列疏松的橢球和球型細(xì)胞形成。對(duì)葉肉組織觀察（圖1），10 個(gè)海南油茶無性系的葉肉組織解剖結(jié)構(gòu)存在極顯著差異。不同種質(zhì)資源的柵欄組織厚度的變化范圍為84.81μm～179.95μm，其中CMWR-16 最大(179.95μm)，CMJL-6最小（84.81μm）。葉片海綿組織厚度明顯大于柵欄組織，且排列較為疏松，其中，TCPX-6 的海綿組織厚度最大為226.87μm，MTP-61 最小為158.24μm。各種群間葉肉組織結(jié)構(gòu)緊密度變化范圍為0.24～0.45，CMWR-16 最大，QZCZ-4 最小。

表3 10 個(gè)海南油茶無性系葉片解剖結(jié)構(gòu)及氣孔比較Tab.3 Comparison of anatomical structure and stomata of 10 Camellia hainanica

2.1.5 葉片氣孔特征比較

氣孔是植物與外界進(jìn)行氣體交換的孔道和控制蒸騰的結(jié)構(gòu)。一般認(rèn)為，植物葉片氣孔小且密度大的植物在炎熱條件下可降低水分損耗。由表3 可知，海南省油茶不同品種的葉片氣孔特征存在極顯著差異(P＜0．01)。10 個(gè)油茶品種葉片的氣孔長(zhǎng)度在31.03μm ～42.82μm，最大的和最小的分別是MTP-61 和TCPX-7，其平均值為35.41μm 變異系數(shù)為10.73%；氣孔平均密度為128.50μm，CMJL-6 最大，MTP-61 最小，變異系數(shù)為18.58%。

圖2 10 個(gè)海南油茶無性系葉片下表皮氣孔顯微結(jié)構(gòu)Fig.2 Stomatal microscopic images in leaf lower epidermis of 10 10 Camellia hainanica

2.1.6 主脈維管束特征比較

主脈維管束主要由機(jī)械組織、木質(zhì)部、韌皮部構(gòu)成。反映植物對(duì)環(huán)境中水分和營(yíng)養(yǎng)條件的適應(yīng)。各油茶品種的中脈結(jié)構(gòu)如圖2 所示，且中脈厚度存在極顯著差異(P＜0.01，表3)。中脈厚度從CMJL-6 的478.84μm 到CMWR-16 的706.96μm，最厚中脈是最薄中脈的1.48 倍，變異系數(shù)為10.35%。

圖3 10 個(gè)海南油茶無性系葉片主脈橫切面Fig.3 Cross sections of leaf midrib of 10 Camellia hainanica

2.2 不同海南油茶耐熱性綜合評(píng)價(jià)

2.2.1 葉片耐熱性解剖結(jié)構(gòu)指標(biāo)篩選

對(duì)10 個(gè)海南油茶無性系葉片解剖結(jié)構(gòu)進(jìn)行聚類分析發(fā)現(xiàn)（圖4），14 項(xiàng)指標(biāo)距離為10 的時(shí)候可分為4 類：第1 類包括8 項(xiàng)指標(biāo)上表皮厚度、下表皮厚度、角質(zhì)層厚度、柵海比、組織結(jié)構(gòu)緊密度、組織結(jié)構(gòu)疏松度、下表皮角質(zhì)層厚度、氣孔長(zhǎng)度；第2 類為海綿組織和柵欄組織厚度；上表皮角質(zhì)層厚度、氣孔密度為第3 類；主脈厚度和葉片厚度為第4 類。

圖4 10 個(gè)無性系海南油茶葉片14 項(xiàng)指標(biāo)的聚類分析Fig.4 Variable cluster analysis of 14 Indexes of 10 Camellia hainanica

表4 葉片結(jié)構(gòu)指標(biāo)的相關(guān)矩陣Tab.4 Correlative matrix of leaf structure parameters

2.2.2 不同油茶品種葉片耐熱性評(píng)價(jià)

根據(jù)各指標(biāo)間相關(guān)性分析矩陣（表4）與上述聚類分析圖（圖4），對(duì)相關(guān)性的各指標(biāo)與其耐熱性進(jìn)行綜合性分析，可將其分為4 大類種抗熱性劃分為抗熱類型(R，0．550～1．000)有CMWR-16；中度抗熱類型（MR，0．500～0．549）有QZCZ-4、CMJL-6、；低抗熱類型（LR，0．450 ～0．499） 有BFC-CDL、MX-2；不熱類型（S0．400～0．449）TCPX-6、CSC-1、TCPX-7、MTP-61、QZCZ-3。

表5 10 個(gè)海南油茶耐熱性綜合評(píng)價(jià)Tab.5 Comprehensive evaluation of heat resistance of 10 Camellia hainanica

3 討論

植物葉片的耐熱性反應(yīng)了植物葉片在光合作用、氣體交換以及蒸騰作用后一種特性，而葉片本身形態(tài)結(jié)構(gòu)是在自身遺傳特性和不斷受自然選擇而適應(yīng)環(huán)境的結(jié)果[21-22]。葉片作為植物體暴露于環(huán)境中最大的器官，是對(duì)自然界中的光照、水份、溫度等主要生態(tài)因子的變化較為直觀感應(yīng)[23]。研究學(xué)者證明植物解剖結(jié)構(gòu)中的耐熱性與葉片厚度、氣孔密度、組織結(jié)構(gòu)疏松度、柵欄組織厚度、柵海組織比、上、下表皮角質(zhì)層厚度、角質(zhì)層厚度、組織結(jié)構(gòu)疏松度等指標(biāo)相關(guān)[10-12、24-25]；耐熱植物的特點(diǎn)之一就是柵欄組織厚度越緊密，海綿組織相對(duì)不發(fā)達(dá)[26]。研究發(fā)現(xiàn)耐熱性較強(qiáng)的葉片厚度和柵欄組織厚度都較大，發(fā)達(dá)的柵欄組織能夠增強(qiáng)植物的光合作用，也能將水分進(jìn)行高效運(yùn)輸。

10 個(gè)海南油茶無性系的耐熱性由強(qiáng)到弱排列為：CMWR-16＞QZCZ-4＞CMJL-6＞BFC-CDL＞MX-2＞TCPX-6 ＞CSC-1 ＞TCPX-7 ＞MTP-61 ＞QZCZ-3。CMWR-16 的耐熱性最強(qiáng)，其氣孔密度小，柵欄組織、海綿組織發(fā)達(dá)，葉片厚度大因此葉肉細(xì)胞間的側(cè)向接觸面積增加，增強(qiáng)了植物在水平方向上的運(yùn)輸能力。同時(shí)，中度耐熱的CMJL-6 葉片表皮厚度低、組織結(jié)構(gòu)疏松度較高，氣孔密度高，利于葉片內(nèi)部水分利用；而耐熱性較差的QZCZ-3、MTP-61，其葉肉組織薄，氣孔密度小。但MTP-61 的氣孔最長(zhǎng)，這可能是因?yàn)椴煌贩N（系）在不同環(huán)境中采取的耐熱機(jī)制不同。結(jié)合葉片解剖結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)，CSC-1 的上表皮角質(zhì)層、氣孔密度大，說明其抗旱機(jī)制除了增加葉片角質(zhì)層厚度及葉片中柵欄組織比例外，還包括控制氣孔大小和密度；油茶無性系葉片各項(xiàng)指標(biāo)的大小順序并不一致，可見在研究耐熱性時(shí)，不能單憑某一項(xiàng)指標(biāo)來進(jìn)行評(píng)價(jià)［27］。結(jié)合海南省的亞熱帶季風(fēng)氣候特征，為海南省種質(zhì)資源的選育推廣栽培及今后選育耐熱性的種質(zhì)資源提供參考。