唐吉偉，鄭 叁，曹學(xué)帥，張柏銀，顧 暉，郭亦杰

(1.湖南省第二人民醫(yī)院麻醉手術(shù)科，湖南 長沙410011； 2.湖南中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，湖南 長沙 410208)

近年來，乳腺癌在我國的發(fā)病率逐漸升高，每年以3%的速率增長，成為女性人群中發(fā)病率增長最快的惡性腫瘤；同時，發(fā)病人群也越來越年輕化，給患者帶來了極大的心理負(fù)擔(dān)，讓患者家庭承受了重大的經(jīng)濟(jì)和生活壓力，降低了人們生活的幸福水平[1]。目前，乳腺癌的治療方法主要是綜合手術(shù)、化療及放療手段，但上述方法仍然面臨著巨大的挑戰(zhàn)，在治療乳腺疾病的同時也影響了其他系統(tǒng)的健康，容易發(fā)生手術(shù)創(chuàng)口大恢復(fù)慢、體型發(fā)生較大改變、肝腎損傷、影響機(jī)體代謝和嚴(yán)重脫發(fā)等并發(fā)癥，給患者的身心帶了極大的傷害[2-3]。因此，亟待找到一種不良反應(yīng)小、適用范圍廣的治療方法，中醫(yī)藥治療以其不良反應(yīng)小、療效好的特點(diǎn)帶來了新的治療思路。

蒲公英為菊科植物蒲公英TaraxacummongolicumHand.-Mazz.、堿地蒲公英TaraxacumborealisinenseKitam.或同屬數(shù)種植物的干燥全草，《新修本草》記載其“婦人乳癰腫，水煮汁飲之，立消”，可治療瘰疬、疔毒瘡腫及急性乳腺炎等癥；夏枯草為唇形科植物夏枯草PrunellavulgarisL.的干燥果穗，《神農(nóng)本草經(jīng)》記載其“味苦、辛，寒，主治寒熱，瘰疬，鼠瘺，頭瘡，破癥，散癭結(jié)氣，腳腫濕痹”，可治療乳癰、乳癖及乳腺增生等癥?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究結(jié)果表明，上述2味中藥有強(qiáng)大的抗腫瘤活性[4]。兩者相須配對在臨床上應(yīng)用廣泛，主治肝膽熱毒、濕熱郁結(jié)之黃疸、脅助疼痛；肝經(jīng)實火、熱毒內(nèi)蘊(yùn)所致咽喉腫痛、目赤腫脹，火熱邪毒郁結(jié)所致疔瘡癕腫、瘰疬痰核及乳癰初起等癥[5]。尚勇[6]發(fā)現(xiàn)，“蒲公英-夏枯草”藥對與其他中藥配伍還能改善乳腺增生癥?！侗静輩R言》記載，“治乳癰初起：蒲公英、夏枯草各等分，酒煎服”。

新興生物信息技術(shù)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)集合各類中藥、有效成分、蛋白及基因等信息，以“多靶點(diǎn)、多通路、多途徑”的手段分析和構(gòu)建“藥物-靶點(diǎn)-疾病”網(wǎng)絡(luò)預(yù)測模型，挖掘傳統(tǒng)藥物的作用機(jī)制[7]。其能從系統(tǒng)水平發(fā)現(xiàn)中藥活性成分，并提示中藥作用靶點(diǎn)及機(jī)制。“蒲公英-夏枯草”藥對在臨床上治療乳腺癌有療效[8-10]，但其機(jī)制尚不明確。本研究將基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，篩選“蒲公英-夏枯草”藥對的有效成分，構(gòu)建有效成分-抗惡性腫瘤靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)，初步探討該藥對的抗惡性腫瘤機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 “夏枯草-蒲公英”藥對成分虛擬篩選

整合中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫和分析平臺(traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP)(http：//ibts.hkbu.edu.hk/LSP/tcmsp.php)、中藥分子機(jī)制生物信息學(xué)分析工具(bio-informatics analysis tool for molecular mechanism of traditional Chinese medicine，BATMAN -TCM)(http：//bionet.ncpsb.org/batman-tcm)，結(jié)合中國天然產(chǎn)物化學(xué)成分庫的數(shù)據(jù)分析，全面檢索夏枯草、蒲公英的全部化學(xué)成分。

1.2 閾值篩選及靶點(diǎn)預(yù)測

整理數(shù)據(jù)庫中夏枯草、蒲公英所有化學(xué)成分?jǐn)?shù)據(jù)，并以化合物口服生物利用度(oral bioavailability，OB)≥30%、類藥性(drug-likeness，DL)≥0.18為閾值進(jìn)行篩選，最終得出優(yōu)選化合物。通過TCMSP平臺，將篩選出的成分在其對應(yīng)的靶點(diǎn)數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行靶點(diǎn)的收集以獲得成分的靶點(diǎn)。

1.3 “成分-靶點(diǎn)”蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用(protein-protein interaction，PPI)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將搜集得到的成分及靶點(diǎn)整理后導(dǎo)入Cytoscape 3.4.0軟件(http：//www.Cytoscape.org/)，生成“蒲公英-夏枯草”藥對的“活性成分-靶點(diǎn)”PPI網(wǎng)絡(luò)，使“蒲公英-夏枯草”藥對的藥理學(xué)作用機(jī)制可視化。

1.4 “疾病-靶點(diǎn)”PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

利用比較毒理基因組學(xué)數(shù)據(jù)庫(comparative toxicogenomics database，CTD)(http：//ctd.mdibl.org/)，以關(guān)鍵詞“乳腺癌“及“breast cancer”進(jìn)行搜集，得到98 252個靶點(diǎn)，根據(jù)“Inference score”，取數(shù)據(jù)庫中前500個靶點(diǎn)。

1.5 網(wǎng)絡(luò)合并

為了直觀地得到靶蛋白之間的相互聯(lián)系與作用，將收集得到的乳腺癌靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING 10.0數(shù)據(jù)庫(https：//string-db.org/)，構(gòu)建乳腺癌相關(guān)靶標(biāo)蛋白的PPI網(wǎng)絡(luò)；再將其導(dǎo)入Cytoscape 3.6.1軟件，與“成分-靶點(diǎn)”PPI網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行相交合并，得到“蒲公英-夏枯草”藥對作用于乳腺癌的靶標(biāo)蛋白；最終在靶標(biāo)蛋白導(dǎo)入STRING 10.0數(shù)據(jù)庫中得到“蒲公英-夏枯草”藥對作用于乳腺癌靶標(biāo)蛋白的PPI網(wǎng)絡(luò)后，將網(wǎng)絡(luò)導(dǎo)入Cytoscape軟件進(jìn)行拓?fù)鋵W(xué)性質(zhì)的觀察與分析。

1.6 富集分析

將上述分析得到核心靶點(diǎn)導(dǎo)入DAVID數(shù)據(jù)庫(https：//david.ncifcrf.gov/)進(jìn)行基因本體(gene ontology，GO)功能分析，以了解“蒲公英-夏枯草”藥對的主要成分對于乳腺癌的GO功能；再利用Reactome數(shù)據(jù)庫(https：//reactome.org)對上述分析得到的核心靶點(diǎn)進(jìn)行京都基因與基因組百科全書(Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG)通路富集分析，以了解“蒲公英-夏枯草”藥對主要成分的靶標(biāo)蛋白在信號通路中的作用，直觀地得到“蒲公英-夏枯草”藥對作用于乳腺癌發(fā)揮作用的途徑；最后利用Omicshare軟件(http：//www.omicshare.com/tools/index.php/)可視化處理富集分析的結(jié)果。

1.7 動物實驗驗證

1.7.1 實驗動物：本實驗研究的小鼠均來自長沙斯萊克景達(dá)實驗動物中心，將30只體質(zhì)量18～22 g雌性SPF級BABL/c小鼠(6～8周，健康狀態(tài)良好；許可證編號：SCXK(湘)2018-0005)圈養(yǎng)在無特定病原體設(shè)施中(湖南中醫(yī)藥大學(xué)SFP級動物實驗中心)，并在整個研究期間維持室溫在23～25 ℃，提供高壓滅菌的食物和蒸餾水。

1.7.2 實驗建模：建立對照組、模型組與治療組，將30只BABL/c小鼠隨機(jī)平均分配至對照組、模型組和治療組，每組10只。適應(yīng)性飼養(yǎng)所有BABL/c小鼠7 d，將 4T1細(xì)胞200 μl(1.0×105個細(xì)胞)皮下注射于模型組、治療組小鼠的右側(cè)腋下，以此構(gòu)建乳腺癌小鼠模型[11]。

1.7.3 實驗方法：建模成功后，給予三組小鼠連續(xù)灌胃25 d，每日早晚各1次。對照組、模型組小鼠每次給予0.9%氯化鈉注射液2.5 ml灌胃，治療組小鼠每次給予夏枯草、蒲公英按生藥4 g/kg溶于0.9%氯化鈉注射液2.5 ml灌胃。處死小鼠前采取眼眶靜脈血，采用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附測定法(enzyme-linked immuno sorbent assay，ELISA)，將血清以1 000 r/min的轉(zhuǎn)速離心10 min以去除沉淀和細(xì)胞碎片。根據(jù)說明書，用ELISA試劑盒進(jìn)行平衡、標(biāo)記、混合、沖洗滴加基質(zhì)試劑并于室溫下避光放置15 min等操作，以測定白細(xì)胞介素6(IL-6)含量。斷頸處死小鼠后，摘取接種皮下腫瘤組織，進(jìn)行蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin，HE)染色、TUNEL染色，以完成有關(guān)病理學(xué)檢測及原位細(xì)胞凋亡檢查。

2 結(jié)果

2.1 “夏枯草-蒲公英”藥對化學(xué)成分虛擬篩選

共檢索出“夏枯草-蒲公英”藥對中74種化學(xué)成分，其中夏枯草有60種，蒲公英有14種；以O(shè)B≥30%、DL≥0.18為閾值共篩選出16種優(yōu)選化合物，其中夏枯草有11種，蒲公英有5種。

2.2 優(yōu)選化合物靶點(diǎn)預(yù)測

通過對TCMSP、BATMAN-TCM數(shù)據(jù)庫數(shù)據(jù)的整理歸納，共檢索出靶點(diǎn)蛋白594個(夏枯草377個，蒲公英217個)，并通過Uniprot數(shù)據(jù)庫(http：//www.uniprot.org/)將預(yù)測出的靶點(diǎn)蛋白名稱轉(zhuǎn)換為基因名稱。

2.3 “蒲公英-夏枯草”藥對“成分-靶點(diǎn)”PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

通過收集查找TCMSP數(shù)據(jù)庫中“蒲公英-夏枯草”藥對主要化合物的對應(yīng)靶點(diǎn)，將結(jié)果導(dǎo)入Cytoscape 3.6.1構(gòu)建“主要化合物-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)，得到了383個節(jié)點(diǎn)(包含17個活性成分節(jié)點(diǎn)、366個預(yù)測靶標(biāo)節(jié)點(diǎn))和594條相互作用關(guān)系，見圖1；圖中，深色節(jié)點(diǎn)代表藥對的主要化合物，淺色節(jié)點(diǎn)代表化合物對應(yīng)的靶點(diǎn)。

圖1 “蒲公英-夏枯草”藥對“成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)Fig 1 “Composition-Target” network of the herbal pair of “dandelion-selfheal”

2.4 乳腺癌“疾病-靶點(diǎn)”PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將CTD數(shù)據(jù)庫中檢索得到的前500個乳腺癌相關(guān)基因輸入 Cytoscape 3.6.1 軟件，使用DAVID數(shù)據(jù)庫檢索PPI，并將該相互作用關(guān)系導(dǎo)入cytoscape，制作乳腺癌“疾病-靶點(diǎn)”PPI網(wǎng)絡(luò)，見圖2。

圖3 “蒲公英-夏枯草”藥對治療乳腺癌的“成分-核心靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)Fig 3 “Composition-Core target” network of the herbal pair of “dandelion-selfheal”

2.5 網(wǎng)絡(luò)合并

利用Cytoscape 3.6.1軟件的Merge功能，將“蒲公英-夏枯草”藥對“成分-靶點(diǎn)”PPI網(wǎng)絡(luò)和乳腺癌“疾病-靶點(diǎn)”PPI網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行有效合并，構(gòu)建“成分-靶點(diǎn)-疾病”網(wǎng)絡(luò)。按照度值排列，得到61個核心靶點(diǎn)組成的核心網(wǎng)絡(luò)，見圖3。61個核心靶點(diǎn)包括TP53、JUN、ESR1、IL6、AKT1、CCND1、HSP90AA1、FOS、AR、EGF及PTEN等。

2.6 GO功能富集分析

利用DAVID平臺對“蒲公英-夏枯草”藥對作用于乳腺癌的PPI網(wǎng)絡(luò)中涉及的61個核心靶點(diǎn)進(jìn)行GO功能富集分析。以校正后P為標(biāo)準(zhǔn)升序選取前25條，分別為對脂質(zhì)的反應(yīng)、生物過程的積極調(diào)節(jié)、細(xì)胞過程的積極調(diào)節(jié)、對有機(jī)環(huán)狀化合物的反應(yīng)、對含氧化合物的反應(yīng)、對有機(jī)物的反應(yīng)、細(xì)胞對化學(xué)刺激的反應(yīng)、對化學(xué)品的反應(yīng)、細(xì)胞對刺激的反應(yīng)、代謝過程的積極調(diào)節(jié)、細(xì)胞代謝過程的積極調(diào)節(jié)、對刺激的反應(yīng)、細(xì)胞死亡、細(xì)胞增殖、細(xì)胞對有機(jī)物的反應(yīng)、調(diào)節(jié)代謝過程、細(xì)胞凋亡過程、程序性細(xì)胞死亡、調(diào)節(jié)細(xì)胞代謝過程、生物調(diào)節(jié)、單一細(xì)胞過程、細(xì)胞通訊、細(xì)胞對有機(jī)環(huán)狀化合物的反應(yīng)、調(diào)節(jié)細(xì)胞死亡和發(fā)展過程，均屬于GO功能中的生物學(xué)過程，見表1。

2.7 KEGG通路富集分析

利用Reactome數(shù)據(jù)庫對“蒲公英-夏枯草”藥對作用于乳腺癌的PPI網(wǎng)絡(luò)中的核心靶點(diǎn)蛋白進(jìn)行KEGG通路富集分析，以P<0.01、錯誤發(fā)現(xiàn)率<0.05對結(jié)果進(jìn)行篩選，選取前20條通路導(dǎo)入Omicshare平臺進(jìn)行可視化處理，見表2、圖4。

表1 GO功能富集分析Tab 1 Enrichment analysis of Go function

表2 “蒲公英-夏枯草”藥對治療乳腺癌靶點(diǎn)的KEGG富集通路Tab 2 KEGG enrichment pathway of the herbal pair of “dandelion-selfheal” in treatment of breast cancer

通過Reactome數(shù)據(jù)庫對核心通路進(jìn)行注釋，見圖5。由圖4可見，“蒲公英-夏枯草”藥對作用于乳腺癌的PPI網(wǎng)絡(luò)中的核心靶點(diǎn)主要參與的通路有免疫系統(tǒng)中的細(xì)胞因子信號、免疫系統(tǒng)、白細(xì)胞介素4(IL-4)和白細(xì)胞介素13(IL-13)途徑、雌激素受體(ESR)介導(dǎo)信號途徑、非基因組雌激素信號傳導(dǎo)、核受體的信號傳導(dǎo)、細(xì)胞衰老、ESR-膜信號傳導(dǎo)下游的雌激素依賴性核事件、細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)、白細(xì)胞介素10(IL-10)途徑、癌基因誘導(dǎo)的細(xì)胞衰老、泛素化E3連接酶靶蛋白、雌激素依賴性基因表達(dá)、類泛素化、人C型凝集素域7家族成員A/炎癥通路、細(xì)胞對外界刺激的反應(yīng)、PIP3激活A(yù)KT信號傳導(dǎo)、衰老相關(guān)分泌表型和TP53的調(diào)控表達(dá)，提示了“蒲公英-夏枯草”藥對可通過多種途徑對乳腺癌進(jìn)行多方面的干預(yù)。由圖5可見，“蒲公英-夏枯草”藥對作用于乳腺癌的PPI網(wǎng)絡(luò)中的核心靶點(diǎn)主要涉及白細(xì)胞介素途徑、雌激素信號途徑、細(xì)胞衰老及基因轉(zhuǎn)錄等多個方面。圖4—5中最右方的顏色帶表示主要的富集通路，而P隨顏色的加深而逐漸增大，提示“蒲公英-夏枯草”藥對對于乳腺癌的干預(yù)涉及多個復(fù)雜的生物過程。

2.8 動物實驗結(jié)果

2.8.1 蒲公英配伍夏枯草對小鼠血清IL-6含量的影響：對照組、模型組和治療組小鼠平均血清IL-6含量分別為(0.26±0.03)、(1.02±0.04)和(1.78±0.03)ng/ml；與對照組比較，模型組、治療組小鼠血清IL-6含量均明顯升高，且治療組升高更明顯，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，表明蒲公英配伍夏枯草能促進(jìn)乳腺癌小鼠血清免疫因子的釋放。

圖4 KEGG富集通路可視化Fig 4 Visualization of KEGG enrichment pathway

2.8.2 蒲公英配伍夏枯草對小鼠腫瘤組織病理學(xué)結(jié)構(gòu)的影響：為了解腫瘤組織病理學(xué)改變，本實驗采用HE染色進(jìn)行觀察。結(jié)果顯示，治療組乳腺細(xì)胞排列整齊；模型組腫瘤細(xì)胞分布密集、排列緊湊且呈現(xiàn)細(xì)胞異型性，內(nèi)部腫瘤細(xì)胞表現(xiàn)旺盛生長；與模型組比較，治療組腫瘤組織松散，腫瘤細(xì)胞排列稀疏，可見壞死區(qū)域、部分細(xì)胞壞死以及炎性細(xì)胞浸潤，說明蒲公英配伍夏枯草能夠抑制腫瘤增殖，具有顯著的抗腫瘤作用，見圖6。

2.8.3 蒲公英配伍夏枯草對小鼠原位腫瘤細(xì)胞凋亡的影響：為了解原位腫瘤細(xì)胞凋亡情況，本實驗采用TUNEL染色進(jìn)行檢測[12-13]。結(jié)果顯示，空白組僅見極少數(shù)TUNEL陽性細(xì)胞；模型組可見少量散在分布的TUNEL陽性細(xì)胞；與模型組比較，治療組可見大量的TUNEL陽性細(xì)胞，整個細(xì)胞著色較深，細(xì)胞核內(nèi)有較強(qiáng)的棕色顆粒，見圖7。對照組、模型組和治療組小鼠腫瘤組織細(xì)胞凋亡指數(shù)(TUNEL陽性率)分別為(1.2±0.3)%、(4.2±0.5)%和(8.6±0.6)%；與對照組比較，模型組、治療組小鼠腫瘤組織細(xì)胞凋亡指數(shù)均明顯升高，且治療組升高更明顯，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，表明蒲公英配伍夏枯草具有顯著的抗腫瘤活性，可促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞凋亡。

3 討論

乳腺癌在中醫(yī)學(xué)中屬于“乳巖”“乳核”及“石癰”等范疇，其病名首見于宋代陳自名的《婦人大全良方》，其中記載：“若初起，內(nèi)結(jié)小核，或如鱉棋子，不赤不痛，積之歲月漸大，崢巖崩破如熟石榴，或內(nèi)潰深洞……名曰乳巖”。乳巖的病因多與肝胃相關(guān)，《瘍醫(yī)大全》曾記載“乳頭屬肝，乳房屬胃”，肝失疏泄、氣機(jī)郁滯，脾胃納運(yùn)失調(diào)、升降失常，導(dǎo)致氣血化生不足、痰濁內(nèi)阻甚至氣滯血瘀，氣、痰和瘀交阻于乳房，久而不散則形成乳巖。此外，乳腺癌還與正氣不足、情志不暢和沖任失調(diào)等其他因素密切相關(guān)。乳腺癌的臨床表現(xiàn)主要為乳房可觸及明顯腫塊、質(zhì)硬且痛，并伴有皮膚橘皮樣改變等?！捌压?夏枯草”藥對出自《本草匯言》，具有清熱解毒、清肝瀉火和消腫散結(jié)之功，主治乳癰初期、目赤腫痛，現(xiàn)被廣泛用于瘰疬、痰核即各種惡性腫瘤等疾病的治療，但具體作用機(jī)制仍不清楚。本研究為探索“蒲公英-夏枯草”藥對治療乳腺癌的作用靶點(diǎn)及作用機(jī)制，運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)、生物信息學(xué)技術(shù)進(jìn)行了更深入的分析。

圖5 富集通路注釋Fig 5 Annotation of enrichment pathway

A.空白組；B.模型組；C.治療組A.blank group; B.model group; C.treatment group圖6 蒲公英配伍夏枯草對小鼠腫瘤組織病理學(xué)結(jié)構(gòu)的影響Fig 6 Effect of dandelion compatible with selfheal on the pathological structure of tumor tissue of mice

A.空白組；B.模型組；C.治療組A.blank group; B.model group; C.treatment group圖7 蒲公英配伍夏枯草對小鼠腫瘤組織細(xì)胞凋亡的影響Fig 7 Effect of dandelion compatible with selfheal on the cell apoptosis of tumor tissue of mice

本研究中，將得到的61個核心靶點(diǎn)通過GO功能富集分析發(fā)現(xiàn)，“蒲公英-夏枯草”藥對治療乳腺癌的主要生物學(xué)過程涉及細(xì)胞過程、代謝過程、細(xì)胞代謝過程、細(xì)胞通訊及細(xì)胞凋亡過程的調(diào)節(jié)等方面；分子功能涉及對脂質(zhì)、有機(jī)物、有機(jī)環(huán)狀化合物、含氧化合物及刺激的反應(yīng)、細(xì)胞對有機(jī)物、有機(jī)環(huán)狀化合物及刺激的反應(yīng)等方面。通過KEGG通路富集分析發(fā)現(xiàn)，“蒲公英-夏枯草”藥對治療乳腺癌主要通過影響免疫系統(tǒng)中的IL-4、IL-10和IL-13等細(xì)胞因子信號途徑，ESR介導(dǎo)的信號途徑，非基因組雌激素與核受體的信號傳導(dǎo)，泛素化E3連接酶靶蛋白，人C型凝集素域7家族成員A/炎癥通路，PIP3激活A(yù)KT信號傳導(dǎo)，TP53的調(diào)控表達(dá)，細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)以及細(xì)胞衰老等方面。

近年來，對蒲公英和夏枯草抗腫瘤作用的相關(guān)研究結(jié)果提示，蒲公英有抑制腫瘤細(xì)胞增殖、改善腫瘤細(xì)胞微環(huán)境以及減輕抗腫瘤藥不良反應(yīng)的作用[14]；夏枯草含有眾多抗腫瘤活性成分，其抗腫瘤作用是通過多種機(jī)制協(xié)同實現(xiàn)的，有實驗結(jié)果證明促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡是夏枯草抗腫瘤的主要機(jī)制[15-16]。然而，鮮見將夏枯草、蒲公英組成藥對運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法研究其抗腫瘤機(jī)制的研究。本研究結(jié)果顯示，“蒲公英-夏枯草”藥對主要是通過免疫系統(tǒng)、性激素代謝和腫瘤細(xì)胞的增殖與凋亡等3個方面發(fā)揮抗乳腺癌作用。(1)免疫系統(tǒng)方面：“蒲公英-夏枯草”藥對治療乳腺癌主要是促進(jìn)細(xì)胞因子IL-6的釋放。IL-6是吞噬細(xì)胞活化后釋放的細(xì)胞因子，在機(jī)體免疫和炎癥反應(yīng)中起到非常重要的作用，還能激活JAK/STAT信號通路，將免疫信號傳遞到免疫細(xì)胞，介導(dǎo)與免疫和炎癥相關(guān)的免疫應(yīng)答[17]。蒲公英配伍夏枯草可以增強(qiáng)小鼠的免疫系統(tǒng)，通過自身免疫系統(tǒng)延緩腫瘤的發(fā)展過程，平衡機(jī)體內(nèi)免疫微環(huán)境，從根本上改變腫瘤細(xì)胞的生長與生存環(huán)境，初步闡釋了該藥對發(fā)揮抗乳腺癌優(yōu)效性的機(jī)制。(2)性激素代謝方面：“蒲公英-夏枯草”藥對治療乳腺癌主要通過影響ESR和雌激素的表達(dá)。ESR可分為許多類，其中EGR3的編碼基因定位于人染色體8p21—23，編碼蛋白包含387個氨基酸，而EGR3是ESRα的下游效應(yīng)基因，故在雌激素的誘導(dǎo)下，EGR3可在與乳腺癌相關(guān)的信號通路上發(fā)揮重要作用[18]。Suzuki等[18]針對190例乳腺癌患者進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)99例患者有EGR3免疫反應(yīng)性；進(jìn)一步分析結(jié)果表明，這種免疫反應(yīng)性的強(qiáng)弱與乳腺癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、ESRα或同一患者非同步復(fù)發(fā)等有關(guān)，還與患者預(yù)后不良有關(guān)。以上結(jié)果表明，EGR3在雌激素介導(dǎo)的乳腺癌侵襲和轉(zhuǎn)移中具有重要作用，并可作為乳腺癌患者預(yù)后的一個獨(dú)立預(yù)測因子。(3)腫瘤細(xì)胞的增殖與凋亡：“蒲公英-夏枯草”藥對治療乳腺癌主要通過抑制腫瘤細(xì)胞增殖、促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡。細(xì)胞凋亡對維持組織器官的正常形態(tài)和功能以及在機(jī)體生長發(fā)育和生殖衰老等生理過程中都有重要作用，腫瘤的發(fā)生發(fā)展與細(xì)胞惡性增殖或者細(xì)胞凋亡顯著減少也密不可分，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡是預(yù)防或者治療腫瘤的重要手段[19-20]。

綜上所述。本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探究“蒲公英-夏枯草”藥對的主要活性成分作用于乳腺癌的靶點(diǎn)和作用通路，再經(jīng)小鼠模型實驗證實，“蒲公英-夏枯草”藥對可對乳腺癌的生長起到明顯的抑制作用，其作用機(jī)制主要涉及白細(xì)胞介素途徑、雌激素信號途徑、細(xì)胞衰老及基因轉(zhuǎn)錄等方面，為臨床指導(dǎo)用藥提供了理論依據(jù)。中藥成分復(fù)雜，作用靶點(diǎn)多，途徑豐富，相關(guān)研究方向可能不明確。通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)平臺對中藥作用靶點(diǎn)及機(jī)制進(jìn)行探討，可使“藥物-靶點(diǎn)-疾病”網(wǎng)絡(luò)可視化，也為未來的研究指明了方向，在臨床研究中具有重大意義。本研究為后續(xù)研究“蒲公英-夏枯草”藥對治療乳腺癌的作用機(jī)制提供了理論依據(jù)，也為未來探討中醫(yī)中藥的科學(xué)性提供了研究方法。