肖楚麗， 滕 林， 李金成， 肖煦暉， 于旭東

((邵陽學院基礎醫(yī)學院， 湖南 邵陽422000)

抑郁癥是一種常見的神經精神疾病，其癥狀表現(xiàn)為興趣喪失，睡眠障礙，無助感增加，自信心低下，甚至是自殺傾向。根據(jù)世界衛(wèi)生組織的估計，2015年抑郁癥患者約占全球人口的4.4%，而抑郁癥的總數(shù)在2005年至2015年期間增長了18.4%。抑郁癥已成為我國人口死亡的第十大原因和第二大致殘因素[1,2]。雖然作用于“單胺能”的抗抑郁藥物在臨床上廣泛應用,然而，由于抑郁癥的復雜性和異質性，大量抑郁癥患者仍無藥可治[3]。

對香豆酸(p-Coumaric acid，p-CA)是一種衍生自芳香族氨基酸的苯丙酸，廣泛分布于許多植物和人類飲食中，如谷物，水果和蔬菜，具有多種藥用活性，包括抗氧化，心臟保護，抗瘧原蟲，抗突變，抗血小板，抗炎癥和免疫調節(jié)作用[4-6]。在中樞神經系統(tǒng)中，研究表明p-CA可改善腦缺血/再灌注損傷,改善東莨菪堿誘導的記憶障礙[7,8]。然而p-CA在抑郁癥中的作用卻研究滯緩，尤其是在應激性抑郁行為的作用并無報道。

原肌球蛋白激酶B(tyrosine kinase receptor B，TrkB)受體為腦源性神經營養(yǎng)因子(brain-derived neurotrophic factor，BDNF)的受體，可通過其下游信號級聯(lián)影響基因表達，神經遞質釋放，突觸蛋白運輸來調節(jié)神經發(fā)育和突觸可塑性，進而參與抑郁癥的發(fā)生發(fā)展[9]。TrkB受體拮抗劑ANA-12，可選擇性與TrkB受體結合，抑制TrkB下游通路，可阻斷多種藥物的抗抑郁樣作用[10]。p-CA可上調BDNF[11]，然而p-CA和TrkB關系未見報道。本文擬基于慢性束縛應激(chronic restraint stress, CRS)誘導的小鼠抑郁模型探索p-CA在強迫游泳測試和懸尾測試中的抗抑郁作用，此外，我們應用TrkB受體拮抗劑ANA-12觀察其對p-CA抗抑郁樣作用的影響，以期明確TrkB受體是否介導了p-CA的這種作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

雄性ICR小鼠(雄性，體重30～35 g，許可證號：SCXK湘2019-0004)，購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司。2只每籠，均飼養(yǎng)于標準實驗動物環(huán)境(環(huán)境溫度：(23±2)℃；光照周期：12 h/12 h)中，并保證小鼠可自由攝食和飲水。所有ICR小鼠在實驗處理之前飼養(yǎng)一周，以適應新環(huán)境。所有實驗程序均完全按照美國國家衛(wèi)生研究院關于和使用實驗室動物的指南進行。

1.2 試劑

p-CA(阿拉丁，上海)分散于10%的吐溫80中，劑量為100 mg/kg[11]；ANA-12(selleck)分散于1% DMSO中，劑量為0.5 mg/kg；以上藥物均經腹腔注射，藥物及溶媒的注射體積為10 ml/kg。

1.3 實驗設計及流程

1.3.1 實驗1 p-CA對CRS誘導小鼠抑郁樣行為的影響。小鼠隨機分成對照組(Control)，慢性束縛應激組(CRS)和慢性束縛應激+p-CA組(CRS+p-CA)，每組8只，其中慢性束縛應激小鼠每天接受4 h的束縛應激，連續(xù)束縛21 d，而對照組小鼠留在籠中不被打擾。第22日小鼠腹腔注射溶媒(10%吐溫80)或p-CA(100 mg/kg)，注射后1 h進行自發(fā)活動測試(locomotor activity test, LMA)，注射后4 h強迫游泳測試(forced swimming test, FST)，注射后24 h進行懸尾測試。觀察小鼠在行為測試中的表現(xiàn)。

1.3.2 實驗2 ANA-12對p-CA改善CRS應激小鼠抑郁行為的影響。小鼠隨機分成慢性束縛應激組(CRS) ，慢性束縛應激+ANA-12組(CRS+ANA-12)和慢性束縛應激+p-CA組(CRS+ p-CA)慢性束縛應激+p-CA +ANA-12組(CRS+ p-CA +ANA-12)，每組8只，4組小鼠每天接受4 h的束縛應激，連續(xù)束縛21 d。第22日小鼠腹腔注射溶媒(10%吐溫80)或p-CA(100 mg/kg)，ANA-12在p-CA注射前30 min給藥。注射后1 h進行LMA，注射后2 h進行強迫游泳測試(FST)，注射后24 h進行懸尾測試(tail suspension test, TST)。分別觀察小鼠在各行為測試中的表現(xiàn)。

1.4 慢性束縛應激(CRS)

小鼠束縛在50 ml的透明塑料管內進行，塑料管均勻分布直徑為4 mm的透氣孔并放置于鼠籠附近。每天上午10:00將小鼠放入塑料管內，并使其保持頭部朝上，每天束縛4 h，連續(xù)束縛21 d。

1.5 自發(fā)活動測試(LMA)

自發(fā)活動測試在昏暗的隔音箱(長60 cm，寬40 cm，高50 cm)中進行，將小鼠輕輕地放入隔音箱中10 min，通過行為分析軟件Anymaze 6.10統(tǒng)計小鼠10 min的活動距離。每次測試前，使用75%的乙醇溶液清潔隔音箱底部。

1.6 懸尾測試(TST)

距離小鼠尾尖約1 cm處使用膠帶將鼠尾固定于繩上并懸掛在離地面50 cm的隔音箱箱頂。測試持續(xù)6 min，記錄并分析后4 min內小鼠的不動時間。

1.7 強迫游泳測試(FST)

將小鼠置于裝有水的透明玻璃桶中(直徑：15 cm，高度：20 cm)，放入水溫(25±1)℃的水至15 cm高。每只小鼠被迫游泳6 min并在測試結束后換水，記錄測試中最后4 min的不動時間。

1.8 統(tǒng)計學處理

2 結果

2.1 p-CA改善CRS誘導小鼠抑郁樣行為的作用

實驗結果顯示(表1)：在FST中，與Control組相比，CRS明顯增加小鼠不動時間(P<0.05)，而p-CA明顯減少CRS誘導的小鼠不動時間增加(P<0.05)。在TST中，與Control組相比，CRS明顯增加小鼠不動時間(P<0.05)，而p-CA明顯減少CRS誘導的小鼠不動時間增加(P<0.01)。在LMA中，各種處理均不影響小鼠的活動距離(P>0.05)。這些結果表明， p-CA改善 CRS誘導小鼠FST和TST中的抑郁樣行為。

Tab. 1 Effects of p-CA on depression-like behaviors induced by CRS in mice n=8)

2.2 ANA-12阻斷p-CA 改善CRS小鼠抑郁樣行為的作用

實驗結果顯示(表2)：在FST中，與CRS組相比，CRS+ p-CA組小鼠不動時間明顯減少(P<0.05)，而與CRS+ p-CA組相比，CRS+ ANA-12+ p-CA組小鼠不動時間顯著性增多(P<0.05)。在TST中，與CRS組相比，CRS+ p-CA組小鼠不動時間明顯減少(P<0.05)，而與CRS+ p-CA組相比，CRS+ ANA-12+ p-CA組小鼠不動時間顯著性增多(P<0.01)。在LMA中，各種處理均不影響小鼠的活動距離(P>0.05)。這些結果表明，ANA-12阻斷p-CA對 CRS小鼠FST和TST中抑郁樣行為的改善作用。

Tab. 2 Effects of ANA-12 on p-CA improved depression-like behaviors in CRS mice n=8)

3 討論

與急性應激相比，慢性應激誘導的抑郁模型和人類抑郁癥發(fā)病更加接近，不同的慢性應激模型在模擬不同的抑郁類型上各有側重。如慢性社會挫敗抑郁模型主要模擬由社會攻擊所造成的抑郁癥，慢性不可預測應激主要模擬不同應激性生活事件引起的抑郁癥，而慢性束縛應激則主要模擬相同的重復的應激事件所造成的抑郁癥[12]。慢性束縛應激作為慢性應激的一種，與慢性不可預測應激和慢性社會挫敗應激相比具有操作簡單、工具易得、成模率高、可重復性強的優(yōu)點，如今已作為一種經典的嚙齒類抑郁模型被廣泛應用[13]。FST及TST是初步評價嚙齒類的抑郁樣行為的常用模型，也是其他抑郁模型中評估動物抑郁樣水平的常用測試方法。嚙齒類在強迫游泳測試中和懸尾測試中試圖逃脫，多次失敗后出現(xiàn)的不動行為被視為“絕望”，這與抑郁癥病人的主要癥狀相似[13]。

之前證據(jù)表明慢性不可預測應激、慢性社會挫敗等抑郁模型中，小鼠在強迫游泳和懸尾測試中均表現(xiàn)出抑郁樣行為[14]。確實，當前研究發(fā)現(xiàn)小鼠經歷21 d束縛應激后在強迫游泳和懸尾測試中不動時間增加。此外，由于動物FST和TST中的不動時間受其活動水平的影響。因此，常進行自發(fā)活動測試排除活動水平對其潛在的影響[15]。結果顯示，慢性束縛應激不影響自發(fā)活動測試中小鼠的活動水平，這些證據(jù)表明慢性束縛應激誘導小鼠抑郁樣行為,進一步支持了應激對小鼠抑郁樣行為的影響。

P-CA在中樞疾病中發(fā)揮廣泛的神經保護作用[6-8]。P-CA可改善小鼠氧化應激及腦缺血/再灌注損傷，東莨菪堿誘導大鼠被動回避和水迷宮測試中記憶障礙[7,8]。重要的是，P-CA可改善炎性抑郁大鼠強迫游泳及懸尾測試中的抑郁樣行為[11]。一致的是，當前研究結果顯示p-CA一次給藥后4 h明顯減少CRS誘導的小鼠FST不動時間增加。并且給藥后24 h仍可明顯減少CRS誘導的小鼠TST不動時間增加。此外， p-CA不影響小鼠的自發(fā)活動測試中的活動水平，表明p-CA不是通過增加小鼠活動水平來減少小鼠不動時間的。這些結果拓展了p-CA的神經保護作用并進一步支持了p-CA的抗抑郁樣作用。

目前亟需快速的抗抑郁作用藥物，即藥物在注射后幾小時內起效[16]。如，潛在的快速抗抑郁藥物氯胺酮、越鞠醇提物等均可在給藥后2 h內改善小鼠的抑郁樣行為[17]。p-CA給藥后4 h顯著性降低小鼠FST中不動時間，并且，p-CA具有吸收快，生物利用度高的特點[18]，提示其可能具有快速的抗抑郁樣作用。

TrkB受體通過調節(jié)激活多種下游信號分子MAPK / ERK，PI3K和PLCγ信號級聯(lián)從而影響基因表達，神經遞質釋放，突觸蛋白運輸并且在抑郁癥發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用[19]。在慢性溫和應激、慢性社會挫敗等抑郁模型中均觀察到腦中TrkB受體活性降低[20]。一些抗抑郁藥物可激活TrkB受體。并且TrkB受體拮抗劑阻斷藥物的抗抑郁作用[21]。一致的是，TrkB受體拮抗劑ANA-12單獨給藥不影響慢性應激小鼠抑郁樣行為[21]。而ANA-12預處理阻斷p-CA對應激性誘導抑郁樣行為的改善作用。這些結果表明p-CA促應激性學習記憶可能依賴于TrKB，進一步支持TrKB信號在抑郁癥中的作用。然而本研究仍缺乏生化指標，在將來的研究中應進一步檢測p-CA對TrKB和TrKB磷酸化水平的影響。

本研究基于慢性束縛應激抑郁模型，運用FST、TST等測試方法，觀察到p-CA可改善應激誘導小鼠抑郁樣行為，其作用可能依賴于TrKB受體；為進一步明確p-CA抗抑郁的普遍性，在今后的研究中還應運用慢性社會挫敗抑郁模型等進一步評價p-CA的抗抑郁作用。