郭 鈴,方文婉,葛 峰,戴亦軍

(1.南京師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院/ 江蘇省微生物與功能基因組學(xué)重點實驗室/ 江蘇省微生物資源產(chǎn)業(yè)化工程技術(shù)研究中心,江蘇 南京 210023;2.生態(tài)環(huán)境部南京環(huán)境科學(xué)研究所,江蘇 南京 210042)

腈類物質(zhì)是一類含有氰基基團的有機化合物,天然存在于在土壤、植物和微生物中,也可以通過人工合成應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn),但大多數(shù)腈類化合物具有高毒性[1]。苯甲腈因其在工業(yè)生產(chǎn)中的廣泛應(yīng)用被認為是最重要的腈類物質(zhì)之一,它可以作為溶劑和中間體廣泛應(yīng)用于藥物、香水、染料、橡膠、紡織品、樹脂等,用于干燥丙烯酸纖維和生產(chǎn)三聚氰胺。除此以外,苯甲腈還是廣泛使用的除草劑如二氯苯腈、溴苯腈和碘苯腈的主要成分。但是苯甲腈會對人體帶來嚴重危害,如運動能力下降和高鐵血紅蛋白血癥,還可通過皮膚直接吸收造成神經(jīng)麻痹和動物組織痙攣,一旦經(jīng)由工業(yè)生產(chǎn)進入環(huán)境后,將對人體健康和環(huán)境保護帶來嚴重的危害[2]。

生物降解苯甲腈因為其溫和、價格低廉、對環(huán)境危害小的特點受到廣泛關(guān)注[3]。微生物降解腈類物質(zhì)有2條途徑:一是在腈水合酶(Nitrile hydratase,EC 4.2.1.84)作用下生成苯甲酰胺,再在酰胺酶(Amidase,EC 3.5.1.4)作用下生成苯甲酸和氨[4-5]。二是苯甲腈直接通過腈水解酶(Nitrilase, EC 3.5.5.1)水解生成苯甲酸和氨[6]。目前報道很多菌株可以通過腈水合酶/酰胺酶途徑進行腈類降解,MicrobacteriumimperialeCBS 498-74、Rhodococcussp. MTB5、Rhodococcussp. BX2和RhodococcusequiTG 328的基因組中存在腈水合酶和酰胺酶,兩者共表達轉(zhuǎn)化腈類[7]。BradyrhizobiumjaponicumUSDA 110 中有2個腈水解酶基因(blr3397和bll6402),兩者都對苯乙腈表現(xiàn)出活性,其中blr3397同時對肉桂腈表現(xiàn)出高活性[8]。同時已經(jīng)在一些菌中發(fā)現(xiàn)多酶代謝系統(tǒng),如BacillussubtilisZJB-063含有2條代謝途徑,腈水解酶是組成型酶,腈水合酶/酰胺酶是誘導(dǎo)型酶[9]。RhodococcusrhodochrousJ1 也含有2條腈類代謝途徑,分別由尿素和環(huán)己烷-卡波沙酰胺-巴豆酰胺誘導(dǎo)表達[10-11]。

在被腈轉(zhuǎn)化酶(腈水合酶/酰胺酶和腈水解酶)代謝的過程中,苯甲腈會降解為另一種常見污染物苯甲酸。苯甲酸可用作抑菌劑,還可用作藥物的助溶劑隨工廠廢水排出[12]。多種芳香族化合物苯甲基脂肪酸、甲苯、酚等在降解過程中也會生成苯甲酸中間體,這一過程又增加了苯甲酸在環(huán)境中的危害程度[13]。苯甲酸類化合物的代謝主要可以分成好氧降解和厭氧降解[14]。好氧降解途徑又可分為鄰位途徑、間位途徑、龍膽酸途徑和原兒茶酸途徑[15],有些細菌可以同時有多種代謝途徑。一些光合細菌、反硝化細菌和硫鐵還原細菌等通過厭氧途徑對苯甲酸進行降解[16]。因此開展苯甲酸的微生物降解途徑及機理的研究,對于闡明很多環(huán)境污染物的降解、治理環(huán)境污染有重要的指導(dǎo)作用。

筆者實驗室篩選到一株可降解腈類化合物的暗灰鏈霉菌(Streptomycescanus)CGMCC 13662,該菌株有很強的苯甲腈降解能力,但目前尚無相關(guān)研究的報道。因此筆者進一步開展了暗灰鏈霉菌降解苯甲腈和苯甲酸的降解特性和降解途徑研究。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1試劑

試驗所用藥品苯甲腈、苯甲酰胺、苯甲酸、兒茶酚、原兒茶酸購買自上海Sigma-Aldrich公司,高效液相色譜(HPLC)所使用的試劑乙腈購買自TEDIA公司(Fairfield, OH, USA),其他試劑為分析純。

1.1.2菌株與培養(yǎng)基

暗灰鏈霉菌(Streptomycescanus)CGMCC 13662從土壤中篩選獲得,菌株保藏在中國普通微生物菌種保藏管理中心(CGMCC,北京)。

LB培養(yǎng)基:NaCl 10 g·L-1,胰蛋白胨10 g·L-1,酵母粉5 g·L-1,pH值為7.2。

高氏一號培養(yǎng)基:可溶性淀粉10 g·L-1,NaCl 0.5 g·L-1,KNO31 g·L-1,K2HPO4·3H2O 1 g·L-1,MgSO4·7H2O 0.5 g·L-1,FeSO4·7H2O 0.01 g·L-1,pH值為7.0。

ISP4改良培養(yǎng)基:可溶性淀粉10 g·L-1,K2HPO4·3H2O 1 g·L-1,MgSO41 g·L-1,NaCl 1 g·L-1,(NH4)2SO42 g·L-1,CaCl22 g·L-1, FeSO40.001 g·L-1,MnCl20.001 g·L-1,ZnSO4·7H2O 0.001 g·L-1,CoCl20.013 g·L-1,pH值為7.2。

YEME:酵母提取物 3 g·L-1,胰蛋白胨 5 g·L-1,麥芽提取物3 g·L-1,葡萄糖10 g·L-1,蔗糖 340 g·L-1,pH值保持自然狀態(tài)。

TSDY培養(yǎng)基:葡萄糖10 g·L-1,酸水解酪蛋白2 g·L-1,牛肉膏1 g·L-1,酵母粉 1 g·L-1。

1.2 試驗方法

1.2.1暗灰鏈霉菌 CGMCC 13662孢子懸液的制備、菌體培養(yǎng)與靜息細胞的制備

暗灰鏈霉菌CGMCC 13662在高氏一號固體培養(yǎng)基平板30 ℃生長7 d,用無菌水收集孢子并用無菌尼龍過濾網(wǎng)去除培養(yǎng)基中的雜質(zhì),4 ℃條件下以6 000 r·min-1的轉(zhuǎn)速離心5 min(離心半徑為10.8 cm),棄上清液,在沉淀孢子中加入含φ=20%甘油的無菌水,輕輕混勻后置于-80 ℃冰箱中保存。

為探究暗灰鏈霉菌CGMCC 13662在高氏一號、ISP4、YEME和TSDY培養(yǎng)基中的生長情況,首先調(diào)節(jié)孢子懸液到600 nm波長處的光密度值(OD600)為0.1,按φ=1%接種到含有100 mL不同培養(yǎng)基的500 mL三角瓶中,三角瓶置于30 ℃、220 r·min-1的搖床中振蕩培養(yǎng),每隔6～12 h取樣測量菌體生長量。測量方法為:取20 mL發(fā)酵液用布氏漏斗抽濾收集菌絲體。將收集菌絲體的濾紙在100 ℃的烘箱中干燥至恒重,記錄菌絲體的干重,計算菌體生長量(菌絲體干重/發(fā)酵液體積)。

制備靜息細胞(resting cell)的方法為:先將OD600為0.1的孢子懸液按φ=1%接種到含有100 mL ISP4種子培養(yǎng)液的500 mL三角瓶中,于30 ℃、220 r·min-1搖床中振蕩培養(yǎng)4 d;取50 mL菌液(菌絲體干重約為0.5 g),4 ℃條件下以10 000 r·min-1的轉(zhuǎn)速離心10 min(離心半徑為10.8 cm),棄上清液,菌體收集于50 mL離心管中,用20 mL濃度為50 mmol·L-1磷酸鹽緩沖液(pH=7.5)洗滌2次后得到靜息細胞。

1.2.2苯甲腈的降解

(1)生長細胞降解苯甲腈:把OD600為0.1的孢子懸液按φ=1%接種到上述ISP4 改良液體培養(yǎng)基中,加入0.5 g·L-1苯甲腈。三角瓶于30 ℃、220 r·min-1的搖床中振蕩培養(yǎng),同時設(shè)置菌體對照組和底物對照組,每12 h取樣,樣品以10 000 r·min-1的轉(zhuǎn)速離心10 min (離心半徑為10.8 cm),上清液稀釋5倍,用0.22 μm孔徑的微孔濾膜過濾后進行HPLC分析。

(2)靜息細胞降解苯甲腈:將上述制備的靜息細胞懸浮于10 mL(含0.5 g·L-1苯甲腈)轉(zhuǎn)化液中,取出1 mL作為0 d樣品,剩余樣品按每管3 mL分裝于3個50 mL的尖底離心管內(nèi),稱重、封口并戳孔通氣,于30 ℃、220 r·min-1條件下轉(zhuǎn)化,定時取樣進行HPLC鑒定。試驗過程中設(shè)置菌體對照和底物對照。每次取樣前需先用無菌水補足蒸發(fā)水分,樣品處理方式同生長細胞降解苯甲腈。

在靜息細胞降解苯甲腈的過程中,為探究鈷離子對苯甲腈代謝的影響,在ISP4改良培養(yǎng)基中去除CoCl2;探究pH值對苯甲腈代謝過程的影響,靜息轉(zhuǎn)化液的pH值分別設(shè)置為5、6、7、7.5和8;探究不同共代謝基質(zhì)對苯甲腈代謝過程的影響,在轉(zhuǎn)化液中分別加入w=2%的葡萄糖、蔗糖、琥珀酸鈉和蘋果酸鈉,同時設(shè)置不添加共代謝基質(zhì)的對照組。

1.2.3苯甲腈中間產(chǎn)物降解

分別以苯甲酰胺、苯甲酸、兒茶酚、原兒茶酸為底物進行暗灰鏈霉菌CGMCC 13662降解,方法與苯甲腈降解相同。

1.2.4HPLC分析

HPLC分析采用安捷倫1200型高效液相色譜儀,分析條件為:安捷倫HC-C18反相柱(4.6 mm×250 mm×5 μm);檢測器為Agilent G1314A可變紫外檢測器,紫外吸收波長設(shè)定為231 nm;進樣器為安捷倫7725i手動進樣器;進樣體積為20 μL;柱溫為30 ℃;流動相A為經(jīng)0.22 μm微孔過濾膜過濾的雙蒸水(含φ=1‰色譜級乙酸),流動相B為色譜級乙腈,V(A)∶V(B)=45∶55;流速為1 mL·min-1。 HPLC數(shù)據(jù)在Agilent ChemStation工作站上進行分析。苯甲腈和苯甲酸的定量方法為外標法。

1.2.5半衰期的計算

苯甲腈降解半衰期方程式為

ln (I/I0)=-kt。

(1)

式(1)中,I為苯甲腈殘余質(zhì)量濃度,g·L-1;I0為苯甲腈起始質(zhì)量濃度,g·L-1;k為表觀常數(shù);t為時間, h。

降解半衰期(t1/2)的計算公式為

t1/2=(ln 2)/k。

(2)

式(2)中,k為表觀常數(shù),R2>0.9。

1.2.6試驗的重復(fù)數(shù)以及檢驗方法

相關(guān)試驗均開展3次獨立重復(fù)實驗,使用IBM SPSS Statistics 25.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計及單因素方差分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 暗灰鏈霉菌CGMCC 13662在不同培養(yǎng)基中的生長及其對苯甲腈的耐受性

暗灰鏈霉菌CGMCC 13662 在ISP4、高氏一號、YEME和TSDY這4種培養(yǎng)基中的生長如圖1所示,在ISP4培養(yǎng)基中菌體生長最好,培養(yǎng)120 h后的菌體干重達到10 g·L-1;在YEME和TSDY中菌體生長情況相仿,但與在ISP4培養(yǎng)基中生長相比,這2種培養(yǎng)基培養(yǎng)的菌絲的最大生物量僅為6 g·L-1。暗灰鏈霉菌CGMCC 13662在高氏一號培養(yǎng)液中生長緩慢,培養(yǎng)120 h的生物量僅為4 g·L-1。

暗灰鏈霉菌CGMCC 13662的生長過程分為遲緩期、對數(shù)生長期和穩(wěn)定期,按φ=1%接種量接種后,在30 ℃、220 r·min-1條件下培養(yǎng),50 h內(nèi)菌體生長緩慢處于遲緩期,之后進入對數(shù)期,100 h以后菌體進入穩(wěn)定期。因為菌體在ISP4中生物量最大,因此選其作為暗灰鏈霉菌CGMCC 13662后續(xù)研究的生長培養(yǎng)基。

在ρ(苯甲腈)為1～10 g·L-1的ISP4液體培養(yǎng)基中研究其對暗灰鏈霉菌CGMCC 13662菌體生長的影響,結(jié)果發(fā)現(xiàn)在ρ(苯甲腈)為3 g·L-1時菌體生長量最高,達(10.16±1.71) g·L-1,當(dāng)苯甲腈濃度大于此值時菌體的生長逐漸受到抑制,當(dāng)苯甲腈濃度到達8 g·L-1時菌體生長被完全抑制。

直方柱上方英文字母不同表示不同培養(yǎng)時間和苯甲腈濃度下暗灰鏈霉菌的生物量差異顯著(P<0.05)。

2.2 暗灰鏈霉菌CGMCC 13662生長細胞和靜息細胞降解苯甲腈

暗灰鏈霉菌 CGMCC 13662的生長細胞和與靜息細胞均可降解苯甲腈,HPLC分析結(jié)果如圖2所示。降解過程中產(chǎn)生2個新產(chǎn)物P1和P2,菌體對照與苯甲腈底物對照均無這2個峰出現(xiàn)。P1和P2的出峰時間分別為3.25和4.27 min,P1和P2出峰時間與標準品苯甲酰胺和苯甲酸出峰時間相同,因而P1和P2產(chǎn)物分別是苯甲酰胺和苯甲酸。

圖2 暗灰鏈霉菌CGMCC 13662降解苯甲腈的HPLC分析

暗灰鏈霉菌CGMCC 13662的生長細胞與靜息細胞對苯甲腈的代謝能力不同,生長細胞在ISP4液體培養(yǎng)基中完全降解0.5 g·L-1苯甲腈需要120 h,生成的ρ(苯甲酰胺)達到最高〔(0.47±0.02) g·L-1〕后不再降解〔圖3(a)〕。靜息細胞能在20 h內(nèi)完全降解0.5 g·L-1苯甲腈,ρ(苯甲酰胺)在20 h達到最高值〔(0.42±0.02) g·L-1〕后則不斷被降解,在45 h被完全降解〔圖3(b)〕。無論生長細胞還是靜息細胞在降解苯甲腈的過程中產(chǎn)生的苯甲酸質(zhì)量濃度均很低(<10 mg·L-1)。

圖3 暗灰鏈霉菌 CGMCC 13662 生長細胞和靜息細胞降解苯甲腈

2.3 暗灰鏈霉菌CGMCC 13662對苯甲腈中間代謝產(chǎn)物的降解

分別以苯甲酰胺〔圖4(a)〕和苯甲酸〔圖4(b)〕為底物進行靜息細胞轉(zhuǎn)化,結(jié)果表明暗灰鏈霉菌CGMCC 13662對苯甲酰胺和苯甲酸有較高的降解能力。不同濃度苯甲酰胺在暗灰鏈霉菌CGMCC 13662轉(zhuǎn)化下初期降解緩慢,0.2 g·L-1苯甲酰胺在18 h后才開始快速降解,30 h左右完全降解。ρ(苯甲酰胺)為5 g·L-1時60 h的降解率僅為19.5%。暗灰鏈霉菌CGMCC 13662能快速降解苯甲酸,0.2 g·L-1苯甲酸能在10 h內(nèi)被完全降解,其對高濃度苯甲酸也有高效降解能力,5 g·L-1苯甲酸在48 h內(nèi)能完全降解。暗灰鏈霉菌CGMCC 13662在代謝苯甲腈過程中能快速利用掉生成的苯甲酸,因此檢測到的苯甲酸濃度始終處于較低水平。

圖4 暗灰鏈霉菌CGMCC 13662降解苯甲腈中間代謝產(chǎn)物苯甲酰胺和苯甲酸

分別以苯甲酸代謝途徑中的中間物原兒茶酸和兒茶酚為底物,發(fā)現(xiàn)暗灰鏈霉菌CGMCC 13662能完全降解原兒茶酸和兒茶酚(圖5),因而推測暗灰鏈霉菌CGMCC 13662 可能同時通過兒茶酚途徑、原兒茶酸途徑進行苯甲酸代謝。兒茶酚降解途徑包括鄰位途徑和間位途徑,有報道發(fā)現(xiàn)這2條途徑同時存在且受底物濃度調(diào)控,惡臭假單胞菌(Pseudomonasputida)P8在ρ(苯甲酸)較低時(<200 mg·L-1)代謝通過臨位降解途徑,當(dāng)ρ(苯甲酸)高于300 mg·L-1時2種途徑同時進行[17]。某些生物體中還同時存在其他多種代謝通路,如伯克霍爾德菌(Burkholderiaxenovorans)LB400同時存在兒茶酚途徑中的鄰位途徑以及2條不同的苯甲酸-CoA途徑[18],解鳥氨酸拉烏爾菌(Raoultellaornithinolytica)S12存在鄰位途徑和原兒茶酸途徑[19];紅球菌(Rhodococcussp.)R04代謝主要通過兒茶酚鄰位途徑、間位途徑以及原兒茶酸途徑共同完成[20]。暗灰鏈霉菌CGMCC 13662可以同時降解兒茶酚和原兒茶酸,但確定其代謝通路還需結(jié)合基因組測序和相關(guān)基因簇分析。

圖5 暗灰鏈霉菌CGMCC 13662靜息細胞降解苯甲酸的中間代謝產(chǎn)物兒茶酚和原兒茶酸

2.4 鈷離子對暗灰鏈霉菌CGMCC 13662靜息細胞降解苯甲腈的影響

暗灰鏈霉菌CGMCC 13662代謝苯甲腈過程中產(chǎn)生苯甲酰胺,表明菌體中存在腈水合酶。腈水合酶是金屬離子酶,根據(jù)結(jié)合在金屬活性中心的輔助因子,腈水合酶可分為鈷離子型和鐵離子型。經(jīng)腈水合酶基因克隆、誘導(dǎo)表達以及腈水合酶活性分析,暗灰鏈霉菌CGMCC 13662腈水合酶是鈷離子型腈水合酶,即鈷離子能調(diào)控腈水合酶代謝途徑。因此研究鈷離子對暗灰鏈霉菌CGMCC 13662靜息細胞降解苯甲腈的影響能有效反映相關(guān)酶代謝系統(tǒng)代謝苯甲腈的情況。圖6是CoCl2對菌體代謝苯甲腈的影響。添加CoCl2培養(yǎng)的菌體靜息細胞降解ρ(苯甲腈)在20 h時為(0.042±0.012) g·L-1,而未添加CoCl2的對照組為(0.081±0.001) g·L-1,初始ρ(苯甲腈)為0.55 g·L-1,結(jié)果表明CoCl2能提高腈水合酶活性。CoCl2除了改變苯甲酰胺生成速率,還對代謝過程中苯甲酸的生成有顯著影響。不加CoCl2時在8 h內(nèi)最高ρ(苯甲酸)可達0.094 g·L-1,而加入CoCl2后12 h僅生成0.016 g·L-1苯甲酸。但CoCl2對苯甲腈的降解速率影響不大,添加CoCl2與不添加時的降解半衰期分別為5.8 和6.7 h。

圖6 添加CoCl2對暗灰鏈霉菌CGMCC 13662靜息轉(zhuǎn)化苯甲腈的影響

這是由于暗灰鏈霉菌CGMCC 13662測序的基因組(全長10 656 045 bp)中同時含有腈水合酶/酰胺酶、腈水解酶2條途徑,鈷離子能激活腈水合酶活性,增強了腈水合酶/酰胺酶代謝途徑,因而苯甲酰胺的最高濃度高于不加鈷離子的對照組;反之,在不加鈷離子的對照組,苯甲腈經(jīng)由腈水解酶途徑的代謝流比例增加,因此苯甲酸濃度隨之升高。

2.5 pH值對暗灰鏈霉菌CGMCC 13662 靜息細胞代謝苯甲腈的影響

pH值對暗灰鏈霉菌CGMCC 13662降解苯甲腈和產(chǎn)物苯甲酰胺的影響如圖7所示。pH值為7.5時苯甲腈降解速率最高,降解半衰期為5.4 h;pH值為7和8時苯甲腈降解半衰期分別為6.4 和9.9 h;當(dāng)pH值為6時苯甲腈降解能力開始顯著下降,降解半衰期延長為13.0 h;pH值為5時降解半衰期達15.6 h,結(jié)果表明腈水合酶在酸性條件下活性受到抑制。pH值為7.5時苯甲酰胺降解速率達到最大,在50 h以內(nèi)完全降解;pH值為7和8時生成的苯甲酰胺要在60 h以后才可完全降解;然而當(dāng)pH值為6時苯甲酰胺達到最高值的時間延長至50 h左右,然后才被降解,70 h的降解率僅為50%。當(dāng)pH值為5時苯甲酰胺緩慢生成且不發(fā)生降解。上述結(jié)果表明產(chǎn)物苯甲酰胺的進一步降解對pH值的變化非常敏感,僅在pH值為7.5時達到最佳水平,偏酸偏堿都會抑制苯甲酰胺的降解。

圖7 pH值對暗灰鏈霉菌CGMCC 13662靜息轉(zhuǎn)化苯甲腈的影響

2.6 共代謝基質(zhì)對暗灰鏈霉菌CGMCC 13662代謝苯甲腈的影響

共代謝基質(zhì)(co-substrate)通常能促進有機污染物的降解,因而在靜息細胞轉(zhuǎn)化液中分別加入蘋果酸鈉、琥珀酸鈉、葡萄糖、蔗糖來研究其對苯甲腈降解的影響。苯甲腈和產(chǎn)物苯甲酰胺的變化如圖8所示。未添加其代謝基質(zhì)的對照組的苯甲腈降解半衰期為5.4 h,苯甲酰胺生成量在25 h達到最高后在50 h內(nèi)完全降解。添加蘋果酸鈉后,苯甲腈代謝速率明顯加快,降解半衰期減少到3.8 h,同時苯甲酰胺含量在12 h達到最高,在40 h內(nèi)完全降解。葡萄糖、蔗糖、琥珀酸鈉對苯甲腈代謝速率幾乎沒有影響,苯甲酰胺都在25 h達到最高,但共代謝基質(zhì)對之后苯甲酰胺降解的影響不同。葡萄糖、蔗糖減緩了苯甲酰胺的降解速度,苯甲酰胺在60 h后才完全降解,但添加琥珀酸鈉后苯甲酰胺的降解與對照組沒有差別。上述結(jié)果中蘋果酸鹽能顯著促進腈水合酶的活性,加速苯甲酰胺的生成,但對苯甲酰胺代謝沒有影響;葡萄糖和蔗糖對腈水合酶活性沒有影響,但卻抑制苯甲酰胺的代謝,其降解機制需進一步深入研究。

圖8 共代謝基質(zhì)對暗灰鏈霉菌CGMCC 13662靜息轉(zhuǎn)化苯甲腈的影響

3 結(jié)論

通過暗灰鏈霉菌CGMCC 13662代謝苯甲腈及其中間產(chǎn)物確定其代謝通路,并探究鈷離子、pH值和共代謝物質(zhì)對代謝途徑的影響,得到以下結(jié)論:

(1)暗灰鏈霉菌CGMCC 13662同時通過腈水合酶/酰胺酶、腈水解酶2條代謝途徑對苯甲腈進行降解,生成的苯甲酸可通過兒茶酚途徑和原兒茶酸途徑進一步代謝。

(2)CoCl2激活暗灰鏈霉菌 CGMCC 13662中腈水合酶活性,增強了腈水合酶/酰胺酶代謝途徑;在無CoCl2時通過腈水解酶代謝苯甲腈的途徑增加。

(3)酸性條件下苯甲腈降解減慢,腈水合酶活性受到抑制;苯甲酰胺的降解對pH值變化敏感,僅在pH值為7.5時降解速率最快,偏酸偏堿條件下都會被抑制。

(4)蘋果酸鹽促進苯甲腈的降解和加速苯甲酰胺的生成,對腈水合酶活性有促進作用,葡萄糖和蔗糖抑制苯甲酰胺的進一步降解。