楊 廷，楊 科，施務(wù)務(wù)

（1.蚌埠豐原醫(yī)藥科技發(fā)展有限公司,安徽蚌埠233010；2.蚌埠市第一人民醫(yī)院,安徽蚌埠233000）

丙氨酰谷氨酰胺注射液是一類腸外營(yíng)養(yǎng)藥物，廣泛用于臟器移植、腫瘤、嚴(yán)重感染、燒傷、創(chuàng)傷、中大型手術(shù)后等處于應(yīng)急狀態(tài)的病人。本品臨床上單次常用劑量為100mL，相當(dāng)于丙氨酰谷氨酰胺20g，劑量較大。另外，由于肽類藥物的特殊性質(zhì)，其在生產(chǎn)和儲(chǔ)存過程中，容易形成各種工藝雜質(zhì)和降解雜質(zhì)，增加毒副作用[1-3]。因此，從用藥安全性的角度考慮，本品雜質(zhì)控制尤為重要。研究顯示，丙氨酰谷氨酰胺注射液中除了常見的二肽降解雜質(zhì)，還有如L-丙氨酰-L-谷氨酸-L-丙氨酰-L-谷氨酰胺、L-丙氨酰-L-谷氨酸-（L-丙氨酰-L-谷氨酰胺）等四肽降解雜質(zhì)[4]，結(jié)構(gòu)式如圖1所示。然而，關(guān)于本品雜質(zhì)定量研究的文獻(xiàn)報(bào)道主要集中于二肽降解雜質(zhì)，并未見對(duì)四肽降解雜質(zhì)的定量研究。

本文采用高效液相色譜法對(duì)上述兩種四肽降解雜質(zhì)進(jìn)行分離測(cè)定，操作簡(jiǎn)便，專屬性強(qiáng)。

圖1四肽降解雜質(zhì)結(jié)構(gòu)式

1 儀器與試藥

Agilent1260高效液相色譜儀（美國安捷倫公司）；Waters2489高效液相色譜儀（美國沃特世公司）；Delta320酸度計(jì)（梅特勒托利多公司）。

丙氨酰谷氨酰胺注射液自制樣品（批號(hào)：20170504、20170505、20170506），安徽豐原藥業(yè)股份有限公司；丙氨酰谷氨酰胺注射液參比制劑（批號(hào)：80KL082），華瑞制藥有限公司；L-丙氨酰-L-谷氨酰胺（Ala-Gln）、環(huán)-（L-丙氨酰-L-谷氨酰胺）[cyclo(Ala-Gln)]、環(huán)-（L-丙氨酰-L-谷氨酸）[cyclo(Ala-Glu)]、L-焦谷氨酰-L-丙氨酸（pyroGlu-Ala）、L-焦谷氨酸（pyroGlu）、D-丙氨酰-L-谷氨酰胺（D-Ala-Gln）、L-丙氨酰-L-谷氨酸（Ala-Glu）對(duì)照品，BACHEM公司；L-丙氨酰-L-谷氨酸-（L-丙氨酰-L-谷氨酰胺）[Ala-Glu-(Ala-Gln)]、L-丙氨酰-L-谷氨酸-L-丙氨酰-L-谷氨酰胺（Ala-Glu-Ala-Gln）對(duì)照品，深圳博泰爾生物技術(shù)有限公司；乙腈為色譜純（DIKMA）；甲酸、氨水為分析純，國藥集團(tuán)；水為純凈水，屈臣氏。

2 方法與結(jié)果

2.1 測(cè)定方法

2.1.1 色譜條件

色譜柱為氨基鍵合硅膠柱（Thermo Fisher Hypersil APS-2NH2，4.6mm×250mm，5μm），檢測(cè)波長(zhǎng)為215 nm，流速為0.8mL/min，柱溫為35℃，進(jìn)樣量為20μL，流動(dòng)相為0.1mol/L甲酸溶液（用氨水調(diào)pH至3.5）-乙腈（32∶68）。

2.1.2 溶液配制

對(duì)照品儲(chǔ)備液：精密稱取四肽雜質(zhì)Ala-Glu-(Ala-Gln)、Ala-Glu-Ala-Gln對(duì)照品適量，分別加流動(dòng)相溶解并稀釋制成濃度約為0.5mg/mL的溶液。

雜質(zhì)對(duì)照品溶液：精密量取各對(duì)照品儲(chǔ)備液適量，分別加流動(dòng)相溶解并稀釋成濃度約為20μg/mL的溶液。

供試品溶液：精密量取本品1mL，置50mL量瓶中，用流動(dòng)相稀釋至刻度，作為供試品溶液。

2.2 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

分別精密稱取主成分和各雜質(zhì)對(duì)照品適量，加流動(dòng)相溶解并稀釋制成各成分濃度約為20μg/mL的溶液，作為系統(tǒng)適用性溶液。取此溶液注入液相色譜儀，計(jì)算各相鄰雜質(zhì)之間、主成分與相鄰雜質(zhì)之間的分離度。結(jié)果表明，空白溶劑無干擾，各組份分離良好。系統(tǒng)適用性色譜圖見圖2。

圖2系統(tǒng)適用性色譜圖

2.3 定量限和檢測(cè)限

取對(duì)照品儲(chǔ)備液逐級(jí)稀釋，并分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖，按信噪比10∶1計(jì)算，兩種四肽雜質(zhì)的定量限均約為20ng；按信噪比3∶1計(jì)算，兩種四肽雜質(zhì)的定量限均約為5ng，說明本方法滿足檢測(cè)要求。

2.4 線性和范圍

取對(duì)照品儲(chǔ)備液，分別加流動(dòng)相逐級(jí)稀釋制成濃度為1μg/mL、10μg/mL、20μg/mL、30μg/mL、40μg/mL、50μg/mL的溶液，分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖，以峰面積為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸。結(jié)果表明，兩種四肽雜質(zhì)在相應(yīng)濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好?？疾榻Y(jié)果見表1。

表1線性關(guān)系考查結(jié)果（n=6）

2.5 準(zhǔn)確度

精密量取本品1mL，置50mL量瓶中，分別加入對(duì)照品儲(chǔ)備液1mL、2mL、3mL，制成低、中、高濃度混合溶液各3份，加流動(dòng)相稀釋至刻度。精密量取上述各溶液及雜質(zhì)對(duì)照品溶液，分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖，計(jì)算兩種四肽雜質(zhì)的回收率。結(jié)果顯示，雜質(zhì)Ala-Glu-(Ala-Gln)、Ala-Glu-Ala-Gln的平均回收率分別為101.13%、100.96%，說明本方法準(zhǔn)確度較高。

2.6 重復(fù)性

按“2.1.2”平行配制供試品溶液6份，精密量取上述各溶液及雜質(zhì)對(duì)照品溶液，分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖，按外標(biāo)法計(jì)算各四肽雜質(zhì)含量和RSD（n=6）。結(jié)果表明，雜質(zhì)Ala-Glu-(Ala-Gln)、Ala-Glu-Ala-Gln重復(fù)性測(cè)定RSD分別為0.78%、1.02%，重復(fù)性良好。

2.7 溶液穩(wěn)定性

取供試品溶液，室溫放置，并分別于0h、4h、8h、12 h、16h和20h取樣測(cè)定。結(jié)果表明，主成分和各雜質(zhì)峰面積RSD均小于2.0%，且無新增雜質(zhì)出現(xiàn)，供試品溶液在20h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.8 樣品測(cè)定

精密量取三批自制樣品和參比制劑各1mL，分別置于50mL量瓶中，用流動(dòng)相稀釋至刻度，作為樣品溶液。分別取各樣品溶液、雜質(zhì)對(duì)照品溶液注入液相色譜儀，記錄色譜圖，按外標(biāo)法計(jì)算各四肽雜質(zhì)含量。結(jié)果顯示，自制樣品與參比制劑兩種四肽雜質(zhì)含量相當(dāng)，測(cè)定結(jié)果見表2。

表2自制樣品與參比制劑測(cè)定結(jié)果

3 結(jié)論與討論

3.1 流動(dòng)相選擇

方法篩選過程中，首先參考了中國藥典丙氨酰谷氨酰胺注射液有關(guān)物質(zhì)測(cè)定方法[5]，使用0.05mol/L磷酸二氫鉀緩沖液（用磷酸調(diào)pH至4.0）-乙腈（35∶65）作為流動(dòng)相，結(jié)果顯示，此方法能夠較好地分離主成分、二肽類雜質(zhì)，但四肽類雜質(zhì)無法完全分離且有拖尾現(xiàn)象。后來又根據(jù)吳強(qiáng)、劉偉、何廣衛(wèi)的研究[6]，使用0.0005mol/L硫酸溶液作為流動(dòng)相，試驗(yàn)表明此方法根本無法檢出四肽類雜質(zhì)。最后，在中國藥典的基礎(chǔ)上，將流動(dòng)相調(diào)整為0.1mol/L甲酸溶液（用氨水調(diào)pH至3.5）-乙腈（32∶68），并對(duì)柱溫、流速進(jìn)行了微調(diào)，結(jié)果顯示，此方法能夠同時(shí)有效分離主成分和各類降解雜質(zhì)，峰型完美。驗(yàn)證結(jié)果表明該方法準(zhǔn)確可靠。

3.2 雜質(zhì)譜分析

丙氨酰谷氨酰胺是由L-丙氨酸和L-谷氨酰胺縮合形成的二肽類藥物，對(duì)高溫、高濕均非常敏感，制成注射液后，高溫滅菌和長(zhǎng)期儲(chǔ)存更易導(dǎo)致降解雜質(zhì)產(chǎn)生[7]。通過本研究，對(duì)丙氨酰谷氨酰胺注射液雜質(zhì)譜進(jìn)行了溯源分析，主要降解雜質(zhì)有：①氨基酸單體：如L-丙氨酸、L-谷氨酰胺等，由水解產(chǎn)生；②二肽類雜質(zhì)：如cyclo(Ala-Gln)、cyclo(Ala-Glu)、pyroGlu-Ala等，由脫水環(huán)合產(chǎn)生；如D-Ala-Gln等，由高溫下構(gòu)型翻轉(zhuǎn)產(chǎn)生；③四肽類雜質(zhì)：如Ala-Glu-(Ala-Gln)、Ala-Glu-Ala-Gln等，由兩分子二肽酰胺化反應(yīng)產(chǎn)生。