王 宇， 張利萍， 殷幼平

（1.攀枝花學院 醫(yī)學院，四川 攀枝花617000； 2.攀枝花學院 附屬醫(yī)院，四川 攀枝花617000；3.攀枝花學院 康養(yǎng)學院，四川 攀枝花617000； 4.重慶大學 生物工程學院，重慶400030）

斑蝥素主要來源于芫菁科昆蟲中的眼斑芫菁，是我國《藥典》里面記載的一種傳統(tǒng)動物藥材［1］.近年來發(fā)現(xiàn)，斑蝥素及其衍生物如去甲斑蝥素可以誘導腫瘤細胞凋亡或者抑制腫瘤細胞的擴散和增殖［2］，對于治療肝癌、淋巴癌、胃癌等腫瘤有很好的療效［3-5］.

眼斑芫菁斑蝥素合成具有性二型現(xiàn)象，雌性成蟲合成斑蝥素很少，主要由雄性成蟲合成.此外，雄性成蟲在不同發(fā)育階段其斑蝥素合成量具有顯著的差異.雄性成蟲羽化后第1—10 天雄性成蟲合成斑蝥素的質(zhì)量分數(shù)僅為0.114% ～0.237%，羽化后第20—25 天斑蝥素質(zhì)量分數(shù)急劇增加，從0.486%增加到0.942%，達到斑蝥素合成的高峰期［6］.同時，通過SDS-PAGE 和雙向電泳技術分析蘋斑芫菁在斑蝥素合成前期、大量合成早期和末期的蛋白質(zhì)組成的變化，發(fā)現(xiàn)3 個時期蛋白質(zhì)組成的變化趨勢與芫菁合成斑蝥素質(zhì)量分數(shù)顯著峰值變化相一致，表明芫菁體內(nèi)斑蝥素的合成是由多種蛋白質(zhì)參與的復雜過程［7］.目前，由于眼斑芫菁的斑蝥素合成途徑仍不清楚，所以本研究通過構建SSH篩選眼斑芫菁在斑蝥素合成期的差異表達基因，這為闡明斑蝥素合成途徑奠定基礎.

1 材料和方法

1.1 材料眼斑芫菁成蟲采自貴州省羅甸縣，采回后在實驗室內(nèi)以室溫（30 ± 1）℃、相對濕度75% ±5%、光周期14 hL/10 hD 的條件下飼養(yǎng)，收集羽化后第6—10 天和第21—25 天的雄性成蟲作為供試材料.

1.2 主要試劑和儀器主要試劑包括TRIzol試劑（購于Invitrogen公司）、PCR-Select cDNA Subtraction Kit 和SMART PCR cDNA Synthesis Kit（購于Clontech 公司）、RNase -free DNaseI（購于Fermentas公司）、mRNA純化試劑盒和pMD18 -T 克隆載體試劑盒（購于TaKaRa 公司）、標記探針的DIG High Primer Kit（購于Roche 公司）、熒光定量PCR試劑盒（購于Bio -RAD 公司）、DNA 純化試劑盒（購于AXYGEN 公司）.主要儀器包括凝膠成像系統(tǒng)（Bio-Rad）、PCR儀（Bio -Rad）、DU640 紫外分光光度計（Beckman）.菌株JM109 為本實驗室保存.所用引物及測序分別委托上海生工公司和華大基因公司完成.

1.3 方法

1.3.1 樣本采集 分別取隔離飼養(yǎng)羽化后第6—10 天的雄性成蟲（driver）和第21—25 天的雄性成蟲（tester），液氮速凍后保存于-80 ℃超低溫冰箱中，-80 ℃保存，供提取RNA.

1.3.2 總RNA 提取和mRNA 純化 按照Invitrogen 公司提供的操作指南提取總RNA，然后用RNase-free DNaseI 進行處理，隨后按照mRNA 純化試劑盒說明書要求純化mRNA，用瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計檢測總RNA 的完整性和純度.

1.3.3 消減雜交文庫的構建 參照消減文庫試劑盒說明進行.將實驗組（tester）和驅(qū)動組（driver）的cDNA用RsaⅠ酶酶切和連接頭，2 組混合經(jīng)2 次液相雜交和2 次PCR 擴增，最后將PCR 產(chǎn)物插入到pMD-18T載體中，導入感受態(tài)細胞JM109，構建成cDNA消減雜交文庫.

1.3.4 斑點雜交篩選 用巢式PCR引物對插入的cDNA進行擴增后，按照DIG High Primer Kit 說明進行斑點雜交，進一步去除假陽性克隆.

1.3.5 測序和序列分析 將點雜交陽性克隆送華大基因公司測序，用DNA Star軟件將測序序列除去兩端載體序列和接頭序列，即得到EST 序列；用PHRAP拼接程序?qū)㈩A處理后的EST序列進行聚類分析、數(shù)據(jù)拼接.將ESTs 提交到Genbank（http：/ /www.ncbi.nlm.nih.gov.）的BLASTN 和BLASTX，對拼接后所得非冗余序列進行同源性比對，確定各序列對應的基因功能.使用KEGG 數(shù)據(jù)庫（http：/ /www.genome.jp/kegg/）和AMIGO（http：/ /amigo.geneontology.org/cgi - bin/amigo/go.cgi）對所得ESTs進行基因功能分析，全部ESTs 提交NCBI 的dbEST數(shù)據(jù)庫.

1.3.6 差異表達基因的熒光定量檢測 隨機抽取9 個EST序列，使用Primer 5.0 軟件設計特異性定量PCR引物，在NCBI數(shù)據(jù)庫中進行引物特異性比對，引物具體信息見表1.以TAF5、UBE3A 和RPL22e為內(nèi)參基因，用qRT -PCR 對差異表達基因進行驗證.反應體系（25 μL）為：1 μL cDNA、12.5 μL SYBR?Premix Ex TaqTM II（2 ×）、上下游引物（10 μmol/L）各0.5和10.5 μL 水.反應體系為：95 ℃預變性10 min；然后95 ℃變性15 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s進行42 個循環(huán)，添加熔解曲線，確保擴增產(chǎn)物的特異性，每個樣品重復測定3次.采用IQ5 軟件對qRT-PCR得到的試驗數(shù)據(jù)進行分析.

表1 qRT-PCR分析中的基因的引物序列Tab.1 The primers of selected genes analyzed by qRT-PCR

2 結果

2.1 RNA的檢測經(jīng)紫外分光光度計檢測，tester和driver總RNA的A260/A280比值在1.85 ～2.0之間，表明純度較高.經(jīng)質(zhì)量分數(shù)1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，總RNA的18S和28S rRNA條帶清楚，無任何拖尾現(xiàn)象，表明沒有發(fā)生降解，完整性好（圖1）.用紫外分光光度計測定分離的mRNA，其A260/A280 比值在1.9 ～2.0 之間，mRNA 總量為3.0 μg，表明mRNA的純度和質(zhì)量滿足構建文庫的要求.

2.2 斑點雜交分別以正向消減和反向消減的cDNA作為正向和反向探針，利用斑點雜交對本文庫中的1 500 個克隆進行篩選，在正向探針的雜交結果中顯示為陽性信號，而在反向探針的雜交結果中顯示為陰性信號或正向探針雜交信號明顯強于反向探針雜交信號的克隆作為陽性克?。▓D2）.經(jīng)過篩選，選出陽性克隆285 個.

圖1 總RNA凝膠電泳鑒定Fig.1 The electrophoresis identification of total RNA

圖2 斑點雜交結果Fig.2 Differential screening of positive clones by dot blotting

2.3 測序結果和分析對文庫中的285 個差異表達克隆進行測序分析.利用DNAStar和PHRAP軟件對EST序列去除載體序列和接頭序列，聚類分析、數(shù)據(jù)拼接，共拼接成130條ESTs，其中72條singletons，58條contigs，將處理后的ESTs提交到Genbank進行blastn比對.在130條ESTs中，34條（26%）與假設蛋白質(zhì)基因有同源性；51 條（39%）與已知功能蛋白基因有同源性；而剩下的45 條（35%）與數(shù)據(jù)庫中的序列沒有發(fā)現(xiàn)同源性，可能代表了新的未知功能基因（圖3）.對51 條己知功能的同源ESTs 進行功能分析，這些基因涉及多種代謝和應答過程，如生物調(diào)控、應激反應和解毒、信號轉(zhuǎn)導、代謝和合成等（表2）.所有ESTs提交到NCBI中的dbEST數(shù)據(jù)庫，序列號為JZ139169-JZ139298.

圖3 130 條ESTs序列的功能分類Fig.3 Functional classification of 130 ESTs

2.4 差異表達基因的qRT -PCR 檢測為了準確鑒定SSH 文庫中差異表達基因的可靠性，使用qRT -PCR分析9個EST序列在第6—10天和第21—25 天的雄性成蟲中的表達變化.在這些EST序列中，有3 個基因是編碼已知蛋白的基因，分別預測的是轉(zhuǎn)錄因子myb（JZ139170）、細胞色素P450單加氧酶（JZ139184）、異檸檬酸脫氫酶（JZ139199）和3 個假設蛋白質(zhì)基因JZ139223、JZ139225、JZ139236）；其余3 個基因是未知功能基因.結果顯示這9 個基因在雄性成蟲不同發(fā)育階段的表達水平差異從（3.8 ±1.1）倍到（14.5 ±2.1）倍變化，差異顯著（圖4）.

表2 部分ESTs與已知基因的同源性比較Tab.2 Partial ESTs similarity analysis by comparing with the identified function genes in Genbank

表2 （續(xù)）

圖4 差異表達基因的qRT-PCR分析Fig.4 qRT-PCR analysis of differentially expressed genes

3 討論

通過構建SSH文庫，共篩選到130 個在眼斑芫菁雄性成蟲斑蝥素合成高峰期特異表達的基因，其中65%的ESTs與NR庫中的蛋白質(zhì)有高度的同源性，涉及多種代謝和應答過程，如生物調(diào)控、應激反應和解毒、信號轉(zhuǎn)導、代謝與合成等，表明芫菁體內(nèi)斑蝥素的合成是由多種蛋白質(zhì)參與的復雜過程.而35%的ESTs與數(shù)據(jù)庫中的序列沒有發(fā)現(xiàn)同源性，可能代表了新的未知功能基因，由于目前昆蟲的遺傳信息比較缺乏，而鞘翅目昆蟲的遺傳背景更為缺失，因此這些基因的功能尚不清楚.

現(xiàn)有研究表明斑蝥素是一類倍半萜的衍生物，而倍半萜的形成需要通過甲羥戊酸途徑（MVA）［8-10］.此外，McCormick 等［11］以原野豆芫菁雄性為材料，同位素18O 標記氧氣或水的實驗證明，原野豆芫菁的斑蝥素是由降解的法尼醇的碳骨架生成，斑蝥素中的四氫呋喃環(huán)上的氧原子及另外2 個氧原子都來自分子氧，另外一個氧原子來自于水，并提示斑蝥素可能是保幼激素（JH）的代謝產(chǎn)物.本文庫中也發(fā)現(xiàn)了幾個參與倍半萜合成及JH合成代謝的相關基因，這些基因可能參與了斑蝥素的合成.異戊烯基轉(zhuǎn)移酶基因，它能催化異戊烯醇焦磷酸（IPP）與二甲烯丙基二磷酸（DMAPP）合成牻牛兒焦磷酸（GPP），IPP和GPP被催化生成法尼焦磷酸（FPP）；FPP是合成倍半萜、法尼醇和JH 的前體物質(zhì)，倍半萜又能參與昆蟲防御物質(zhì)及激素的合成［12］.本實驗室已經(jīng)克隆到該基因的全長序列，在斑蝥素合成持續(xù)增長期內(nèi)（第5—25 天），該基因在雄蟲體內(nèi)的表達量也不斷升高并達到最大，而雌蟲的該基因在斑蝥素合成旺盛期（第22—25 天）的表達量極低，表明該基因在斑蝥素合成途徑中可能發(fā)揮重要作用［13］.EST（JZ139216）編碼乙醇脫氫酶，它能氧化法尼醇和法尼醛.法尼醇轉(zhuǎn)化為法尼醛、法尼醛轉(zhuǎn)化為法尼酸是JH 合成途徑中的2 個關鍵反應［14］.EST（JZ139184）編碼細胞色素P450單氧酶，該酶不僅在昆蟲解毒中發(fā)揮重要作用，而且在一些昆蟲中細胞色素P450 單氧酶能使甲基法尼醇環(huán)氧化，有助于JH合成［15-16］.同時，還有一個EST（JZ139186）編碼保幼激素酯酶（JHE），它參與JH 代謝，可以在昆蟲的不同時期調(diào)節(jié)JH 的水平［17］.

本研究不僅豐富了眼斑芫菁的遺傳信息，而且發(fā)現(xiàn)一些與斑蝥素合成的相關基因，這些基因可能在調(diào)控斑蝥素合成中發(fā)揮重要作用.本實驗室正在采用基因敲除、RNA 干擾［18］等技術對這些相關基因進行功能驗證，為最終揭示斑蝥素的合成機理奠定基礎.