張恒，孫宇，劉俊，陳尚威，周華富

1廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院，南寧 530021；2廣西醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院

非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)是多基因表達(dá)調(diào)控失衡共同作用得結(jié)果，由癌基因激活和抑癌基因失活引起分子方面的變異來啟動[1]，而抑癌基因異常甲基化是其發(fā)展的重要因素。DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(DNMTs)參與腫瘤發(fā)生發(fā)展，正是通過調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞內(nèi)甲基化實(shí)現(xiàn)的[2]，其中DNMT1是催化基因甲基化的關(guān)鍵酶。我們的前期實(shí)驗(yàn)顯示，NSCLC組織細(xì)胞抑癌基因啟動子區(qū)甲基化水平與DNMT1表達(dá)呈正相關(guān)性[3]。RNAi技術(shù)因其快速、高效、易于操作等優(yōu)點(diǎn)，在基因功能分析及基因治療等眾多領(lǐng)域廣泛應(yīng)用。絲裂原活化蛋白細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶MAPK/ERK通路調(diào)節(jié)多種生物學(xué)行為，其在真核生物中廣泛保守，并且在許多細(xì)胞程序如細(xì)胞增殖，細(xì)胞分化，細(xì)胞運(yùn)動和細(xì)胞死亡中起重要作用，是迄今發(fā)現(xiàn)的一種較重要的生長信號調(diào)節(jié)蛋白。近年研究顯示，ERK1/2通路依據(jù)細(xì)胞類型以及不同的細(xì)胞環(huán)境中激活的基因決定，促進(jìn)或抑制細(xì)胞增殖[4]。研究[5]表明，ERK激酶(MEK)/ERK信號通路的甲基化參與了癌癥的發(fā)生發(fā)展。進(jìn)一步研究表明，ERK激活缺陷可導(dǎo)致DNMT1下調(diào)[6]，此外包括E2F1和SP1在內(nèi)的多種轉(zhuǎn)錄因子通過激活的MEK/ERK途徑介導(dǎo)DNMT1的轉(zhuǎn)錄激活，鑒定了激活的MEK/ERK信號通路可作為DNMT1在癌癥中調(diào)控和異常過表達(dá)的驅(qū)動力[7]。2019年2～5月，我們選取NCI-H1299細(xì)胞，以細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶1基因RNA干擾慢病毒載體(LV-ERK1-RNAi)轉(zhuǎn)染，并觀察細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶1(ERK1)、ERK2、DNA甲基轉(zhuǎn)移酶1(DNMT1)mRNA及ERK1、磷酸化ERK1(p-ERK1)、DNMT1蛋白表達(dá)情況。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、病毒及主要試劑 人NSCLC細(xì)胞(NCI-H1299)。LV-ERK1-RNAi(55281-1)、對照病毒(CON077)(上海吉凱公司)。1640培養(yǎng)基(吉凱基因公司)；胎牛血清(Ausbian公司)；DMEM(Corning公司)；胰酶(上海生工)；Puromycin(Clontech公司)；D-Hanks(吉凱基因公司)；TRIzol(上海普飛)；M-MLV(Promega公司)；SYBR Master Mixture(TaKaRa公司)；引物(上海吉凱基因公司)；兔源性一抗ERK1及鼠源性一抗p-ERK1、DNMT1(Abcam公司)，GAPDH、二抗(Santa Cruz公司)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)、分組、LV-ERK1-RNAi轉(zhuǎn)染及轉(zhuǎn)染效率觀察 從液氮罐中取出細(xì)胞凍存管，迅速放入37 ℃水浴中，并不時搖動使其盡快解凍；完全解凍后，以1 300 r/min速度離心3 min，75%酒精擦拭凍存管消毒后，移至生物安全柜；吸去凍存液上清，加入1 mL新鮮的完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，將其培養(yǎng)于含10%胎牛血清的1640+10%FBS完全培養(yǎng)基中，放置在37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中。24 h后更換1次培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，保持細(xì)胞良好的生長狀態(tài)。將NCI-H1299細(xì)胞隨機(jī)分為3組，KD組和NC組按照慢病毒轉(zhuǎn)染細(xì)胞操作說明分別轉(zhuǎn)染LV-ERK1-RNAi、陰性對照病毒，CON組不作處理。參照預(yù)實(shí)驗(yàn)確定的MOI=10，加入最適病毒量轉(zhuǎn)染16 h更換培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，轉(zhuǎn)染72 h后采用熒光顯微鏡觀察細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率，轉(zhuǎn)染效率=(熒光視野下細(xì)胞數(shù)/普通光視野下細(xì)胞數(shù))×100%?？瞻讓φ战M細(xì)胞未見綠色熒光蛋白表達(dá)，陰性對照病毒組、LV-ERK1-RNAi組均見綠色熒光蛋白表達(dá)，且轉(zhuǎn)染72h后平均轉(zhuǎn)染效率達(dá)80%以上。

1.3 各組NCI-H1299細(xì)胞ERK1/2、DNMT1 mRNA檢測 轉(zhuǎn)染后72 h采用real time PCR法檢測。以TRIzol試劑提取RNA，Nanodrop 2000/2000C分光光度計分析測定所抽提RNA 的濃度及質(zhì)量。逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。SYBR Master Mixture試劑盒和 real time PCR儀器進(jìn)行分析。擴(kuò)增條件：95 ℃變性30 s，95 ℃變性5 s，60 ℃退火和延伸30 s，共40個循環(huán)。CAPDH：5′-TGACTTCAACAGCGACACCCA-3′，5′-CACCCTGTTGCTGTAGCCAAA-3′；ERK1：5′-ATGTCATCGGCATCCGAGAC-3′，5′-GGATCTGGTAGAGGAAGTAGCA-3′；ERK2：5′-TTACGACCCGAGTGACGA-3′，5′-CTGTATCCTGGCTGGAATCT-3′；DNMT1：5′-GGACAGG-GGACCCACGAAAG-3′，5′-CACACCTCACAGACGCCACAT-3′。采用相對定量分析F=2-ΔΔCt分析基因相對表達(dá)差異，ΔCt=目的基因Ct值-內(nèi)參基因Ct值；-ΔΔCt=NC組ΔCt平均值-各樣品ΔCt值；2-ΔΔCt反映各樣品相對NC組樣品目的基因的相對表達(dá)水平。

1.4 各組NCI-H1299細(xì)胞ERK1、p-ERK1、DNMT1蛋白檢測 轉(zhuǎn)染后72 h采用Western blotting法。接收細(xì)胞樣品，PBS洗滌兩次，加入裂解液；冰上裂解10～15 min后超聲破碎細(xì)胞，4 ℃、12 000 g，離心15 min；取上清，BCA法測定蛋白濃度，調(diào)整每個樣品蛋白濃度為2 μg/μL；制膠(濃度10%)、上樣(20 μg)、電泳，電泳結(jié)束后，使用轉(zhuǎn)移電泳裝置，將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上；室溫封閉1 h，孵育一抗GAPDH(1∶4 000)、ERK1(1∶1 000)、p-ERK1(1∶1 000)、DNMT1(1∶500)，4 ℃過夜，TBST洗膜4次，8 min/次；二抗室溫下孵育PVDF膜1.5 h，洗膜4次，8 min/次；ECL法結(jié)合X光片顯影。Image-J軟件對蛋白條帶進(jìn)行灰度值分析，目的蛋白與內(nèi)參GAPDH條帶灰度值比較計算ERK1、p-ERK1、DNMT1的相對表達(dá)量，實(shí)驗(yàn)重復(fù)6次，取平均值。

2 結(jié)果

2.1 各組細(xì)胞ERK1/2、DNMT1 mRNA相對表達(dá)量比較 細(xì)胞ERK1/2、DNMT1 mRNA相對表達(dá)量比較見表1。

表1 各組細(xì)胞ERK1/2、DNMT1 mRNA相對表達(dá)量比較

注：與其余兩組比較，*P<0.05。

2.2 各組細(xì)胞ERK1、P-ERK1、DNMT1蛋白相對表達(dá)量比較 細(xì)胞ERK1、P-ERK1、DNMT1蛋白相對表達(dá)量比較見表2。

表2 各組細(xì)胞ERK1、P-ERK1、DNMT1蛋白相對表達(dá)量比較

注：與其余兩組比較，*P<0.05。

3 討論

肺癌是目前腫瘤相關(guān)死亡的首要原因，其中NSCLC占全部肺癌的85%左右，是常見的病理學(xué)類型。盡管以手術(shù)切除結(jié)合生物靶向、放化療的綜合治療使早期肺癌(Ⅰ期)的5年生存率達(dá)80%，然而有效的早期診斷手段缺乏使大多數(shù)患者在就診時已屬晚期(Ⅲb期和Ⅳ期)，5年生存率不足10%[4]。原癌基因低甲基化會引起癌基因激活，促進(jìn)腫瘤生長及轉(zhuǎn)移，抑癌基因高甲基化可導(dǎo)致抑癌基因正常轉(zhuǎn)錄、翻譯及表達(dá)受阻，不能發(fā)揮正常的抑瘤作用，最終細(xì)胞出現(xiàn)異常增殖，直至腫瘤發(fā)生。DNMTs催化完成癌細(xì)胞相關(guān)基因異常甲基化，是調(diào)控表觀遺傳學(xué)DNA甲基化的重要分子，DNMT1包含具有調(diào)節(jié)功能的較大N-末端結(jié)構(gòu)域和催化功能的較小C-末端結(jié)構(gòu)域[8]，主要起維持甲基化酶作用，對抑制人癌細(xì)胞中抑癌基因的活性有重要作用，其表達(dá)升高被發(fā)現(xiàn)是腫瘤細(xì)胞早期分子改變的一個特征[9,10]

RNAi可特異性降解細(xì)胞內(nèi)同源序列的mRNA，阻斷特定基因表達(dá)，被認(rèn)為是一種雙鏈RNA誘發(fā)的基因沉默現(xiàn)象[11,12]。慢病毒介導(dǎo)的RNAi能夠在哺乳動物的細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定表達(dá)siRNA，且具有長期抑制基因表達(dá)，不易引起宿主免疫反應(yīng)等特性[13]。因此，慢病毒介導(dǎo)RNAi已成為當(dāng)前基因治療載體研究的熱點(diǎn)[14]。本研究通過利用慢病毒載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞，我們獲得了穩(wěn)定表達(dá)LV-ERK1-RNAi和陰性病毒細(xì)胞；成功構(gòu)建了人NSCLCNCI-H1299細(xì)胞的ERK1基因沉默細(xì)胞。經(jīng)由RT-PCR檢測證明該ERK1 RNAi慢病毒載體在NCI-H1299細(xì)胞中具有顯著的ERK1基因沉默效率。

作為MAPK信號通路的主要成員，ERK在肺癌組織中高水平表達(dá)[15]。一旦在細(xì)胞質(zhì)中被激活，ERK1/2易位到細(xì)胞核中并與核底物相互作用以誘導(dǎo)特定的基因表達(dá)程序。近來研究顯示，該途徑的失調(diào)與腫瘤表觀遺傳的許多方面有關(guān)[16]?；钚訣RK磷酸化許多細(xì)胞質(zhì)和核靶標(biāo)，包括激酶、磷酸酶、轉(zhuǎn)錄因子和細(xì)胞骨架蛋白。持續(xù)的ERK信號傳導(dǎo)不僅促進(jìn)這些基因的磷酸化和穩(wěn)定化，并可以抑制抑制增殖的基因表達(dá)[17]。通常認(rèn)為ERK1和ERK2基于它們的高序列同源性(85%)發(fā)揮相同的作用[18]。然而，有報道確定ERK1與ERK2具有同種型特異性功能，導(dǎo)致其信號傳導(dǎo)存在差異性，ERK2而非ERK1是細(xì)胞死亡的原因[18,19]。Fremin等[20]發(fā)現(xiàn)，在NIH-3T3細(xì)胞中，幾乎完全去除ERK1不影響細(xì)胞增殖，而同樣手段減少ERK2水平則顯著降低細(xì)胞增殖。在增殖的肝細(xì)胞中，僅去除ERK2減緩細(xì)胞增殖，然而在HeLa細(xì)胞[21]和卵巢癌細(xì)胞中[22]，去除ERK1或ERK2減緩了細(xì)胞增殖。實(shí)驗(yàn)中我們用干擾RNA單一沉默ERK1，經(jīng)由RT-PCR檢測ERK2 mRNA水平，與對照NC組比較，KD組表達(dá)輕度升高，無統(tǒng)計學(xué)意義，不排除由于ERK1的敲低導(dǎo)致剩余ERK2的過度激活[23]。

總之，LV-ERK1-RNAi轉(zhuǎn)染后NCI-H1299細(xì)胞 ERK1、DNMT1 mRNA及ERK1、p-ERK1、DNMT1蛋白表達(dá)降低，ERK2表達(dá)正常，表明LV-ERK1-RNAi特異敲低ERK1而調(diào)控DNMT1的表達(dá)。