李森，尹靜，林碧蓉，謝明忠，李茜，古欽文，戚力升，彭道琥，朱凱

1 西南醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院，四川瀘州 646699；2重慶市北碚區(qū)中醫(yī)院

骨肉瘤是最常見的原發(fā)性骨惡性腫瘤，主要發(fā)生在兒童和青少年中[1]，是由產(chǎn)生未成熟骨或類骨質(zhì)組織的惡性成骨細(xì)胞組成[2]。目前新輔助化療(化療3～4次后再手術(shù)切除)加化療的方案治愈了約70%的患者，但高級別的變異性骨肉瘤及繼發(fā)性骨肉瘤對于化療并不敏感，總體預(yù)后較差，總體5年生存率僅約為20%[3]。近年來，隨著對機(jī)體免疫系統(tǒng)探究的逐漸深入，免疫療法非常有希望成為繼手術(shù)、化療之后能夠有效治療惡性骨肉瘤的綜合治療手段之一[4]。2013年《科學(xué)》雜志將腫瘤免疫療法列為年度十大科學(xué)突破之首，腫瘤免疫療法成為全球研發(fā)的熱點。免疫系統(tǒng)主要包括固有免疫系統(tǒng)和適應(yīng)性免疫系統(tǒng)，固有免疫細(xì)胞中的巨噬細(xì)胞和肥大細(xì)胞通過釋放細(xì)胞因子與其他免疫細(xì)胞相互作用來啟動炎癥反應(yīng)，樹突狀細(xì)胞(DCs)通過結(jié)合外來抗原并呈遞給適應(yīng)性免疫細(xì)胞來進(jìn)行識別。適應(yīng)性免疫細(xì)胞由B淋巴細(xì)胞、CD4+T輔助淋巴細(xì)胞(CD4+Th)和CD8+細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CD8+T)組成[5]。在腫瘤微環(huán)境(TME)中，具有溶骨潛能的骨肉瘤細(xì)胞[6]產(chǎn)生的PTHrP、TGF-β、IL-6和IL11等因子，刺激破骨細(xì)胞的過度活化，促進(jìn)了骨基質(zhì)中的生長因子分泌，其它免疫細(xì)胞通過細(xì)胞因子和激酶介導(dǎo)的信號通路促進(jìn)骨肉瘤的增殖和轉(zhuǎn)移，在有利于血管生成、干性和轉(zhuǎn)移的環(huán)境下，骨肉瘤細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子又進(jìn)一步促進(jìn)骨襯細(xì)胞的激活，最終形成了TME中包含骨肉瘤細(xì)胞在內(nèi)的多種類型細(xì)胞共同參與的“惡性循環(huán)”[7]。腫瘤細(xì)胞、免疫細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞之間的相互作用使TME產(chǎn)生了不同的功能分區(qū)，即含有以CD4+Th和CD8+T為主的腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞(TILs)的免疫浸潤區(qū)、完全沒有TIL的免疫缺失區(qū)和處于中間狀態(tài)的免疫排斥區(qū)[8]。有效的癌癥免疫療法需要TME中TILs的大量激活以及腫瘤相關(guān)抗原的免疫識別和有效的細(xì)胞毒性功能。因此，研究者針對不同的免疫缺失的原因采用了不同的免疫療法策略，包括細(xì)胞因子、腫瘤疫苗(或多肽疫苗)、免疫細(xì)胞和免疫檢查點抑制劑等方法?，F(xiàn)就免疫療法在骨肉瘤治療中的應(yīng)用研究進(jìn)展情況作一綜述。

1 細(xì)胞因子的應(yīng)用

細(xì)胞因子是由免疫細(xì)胞和非免疫細(xì)胞合成、分泌的小分子多肽物質(zhì)，包括白細(xì)胞介素(IL)、干擾素(IFNs)、集落刺激因子(CSF)、腫瘤壞死因子(TNF)和趨化因子家族等。目前，多種細(xì)胞因子已被用于惡性腫瘤患者的免疫療法，通過促進(jìn)免疫細(xì)胞的增殖和分化，增強(qiáng)抗感染和殺腫瘤細(xì)胞效應(yīng)，發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用。IFN-α具有誘導(dǎo)分化、凋亡、抑制增殖和血管生成的作用，在骨肉瘤等多種惡性腫瘤中有臨床療效[9]。在一項用化療藥物(阿霉素、順鉑和甲氨蝶呤，MAP)聯(lián)合或不聯(lián)合IFN-α治療骨肉瘤的臨床試驗中，雖然短時間內(nèi)觀察到IFN-α-2b僅起到較小的輔助性作用，但隨訪仍然繼續(xù)以確定長期生存率[10]。IL-2誘導(dǎo)淋巴因子激活的殺傷細(xì)胞(LAK)活化，識別和清除多種腫瘤細(xì)胞[11]，現(xiàn)在僅在腎細(xì)胞癌和黑色素瘤的臨床試驗觀察到IL-2的療效[12]。關(guān)于IL-2治療骨肉瘤的臨床試驗報道較少，一項小規(guī)模人群試驗發(fā)現(xiàn)高劑量的IL-2可以誘導(dǎo)部分轉(zhuǎn)移性骨肉瘤患者的完全反應(yīng)，但也出現(xiàn)了嚴(yán)重的毒性反應(yīng)[13]，這也是系統(tǒng)使用強(qiáng)效細(xì)胞因子的普遍問題，目前研究尚未觀察到IFN-α和IL-2的直接活化顯著改善骨肉瘤預(yù)后的現(xiàn)象。粒細(xì)胞—巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)雖然能夠誘導(dǎo)人骨肉瘤細(xì)胞在體外分化和凋亡，臨床試驗顯示這些因子與骨肉瘤的預(yù)后改善或免疫調(diào)節(jié)作用無關(guān)[14]。

2 腫瘤疫苗(或多肽疫苗)的應(yīng)用

腫瘤疫苗屬于特異性免疫療法，主要包括滅活的自體腫瘤細(xì)胞、提取的腫瘤抗原、人工合成的腫瘤抗原肽、病毒抗原、DNA疫苗或抗原呈遞細(xì)胞(APC)疫苗等，通過激發(fā)機(jī)體的抗腫瘤免疫反應(yīng)進(jìn)行作用，如靶向腫瘤裂解物、蛋白和多肽的疫苗等[15]。實際上，在骨肉瘤中利用細(xì)菌感染或接種疫苗刺激抗腫瘤免疫反應(yīng)的研究已有100多年的歷史，1891年外科醫(yī)生威廉·科利使用了高溫滅活的化膿性鏈球菌和馬耳森沙雷菌的混合物(科利毒素)誘發(fā)丹毒，刺激免疫反應(yīng)，使大約10%的骨組織和軟組織肉瘤患者中達(dá)到完全緩解[16]。有研究[17]顯示，發(fā)生術(shù)后感染的骨肉瘤患者的生存率明顯高于未發(fā)生感染的患者，表明細(xì)菌具有激活抗腫瘤免疫反應(yīng)的能力。最近，一項研究顯示接受卡介苗(BCG)和腫瘤疫苗治療的17例患者中，有3例(18%)無病生存，而12例未經(jīng)治療的患者中則為0例[18]?？评舅睾虰CG誘發(fā)系統(tǒng)性的多種促炎細(xì)胞因子IL-6、TNF-α和IFN-γ等的表達(dá)，引起急性細(xì)胞毒性免疫細(xì)胞活化和腫瘤消退[19]。通常用于治療骨肉瘤的化療藥物MAP也是通過殺死Treg和MDSCs并激活免疫效應(yīng)細(xì)胞誘發(fā)了免疫抗腫瘤活性，免疫佐劑胞壁酰二肽(米法莫肽)是細(xì)菌細(xì)胞壁成分細(xì)菌肽聚糖的合成類似物，是非特異性免疫調(diào)節(jié)劑，通過激活固有免疫系統(tǒng)，提高血清中TNF-α和IL-6的水平，從而殺死腫瘤[20]。在轉(zhuǎn)移性骨肉瘤患者中，在化療中添加米法莫肽也趨向于改善無事件性和總體生存率，但無統(tǒng)計學(xué)意義[21]。這些結(jié)果表明，細(xì)菌組分在骨肉瘤患者治療和復(fù)發(fā)的風(fēng)險降低，可以考慮用細(xì)菌疫苗和滅活的腫瘤細(xì)胞誘導(dǎo)抗腫瘤免疫反應(yīng)。

腫瘤疫苗應(yīng)用于骨肉瘤治療的主要障礙是其特異性抗原一直難以識別，多數(shù)在骨肉瘤上表達(dá)的抗原，在正常組織中也表達(dá)[22]。近年來，通過抗原呈遞細(xì)胞如DC增強(qiáng)晚期肉瘤特異性免疫反應(yīng)得到了發(fā)展[23]，DC經(jīng)腫瘤裂解物致敏后可以顯著增加CTLs活性，誘導(dǎo)血清IFN-γ水平的升高、肺轉(zhuǎn)移減少及轉(zhuǎn)移區(qū)域CD8+T淋巴細(xì)胞增多[24]。另外，通過聯(lián)合抗細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞抗原-4(CTLA-4)抗體和抗糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)的腫瘤壞死因子受體(GITR)的抗體增強(qiáng)了全身免疫反應(yīng)[25]。在多數(shù)基于DC的免疫療法的臨床研究中，未見嚴(yán)重不良反應(yīng)的報道，但也顯示只有少量患者的臨床結(jié)果有所改善[26]。迄今為止，使用自體DC或骨肉瘤特異性抗原的疫苗接種策略仍局限于臨床前或早期臨床研究，因此需要進(jìn)一步研究明確骨肉瘤相關(guān)特異抗原及其適應(yīng)證，改善骨肉瘤的細(xì)胞免疫療法。

3 免疫細(xì)胞的應(yīng)用

免疫細(xì)胞治療是通過將自體或異體免疫細(xì)胞在體外給予不同細(xì)胞因子的刺激進(jìn)行擴(kuò)增，而后回輸入患者體內(nèi)，發(fā)揮調(diào)動機(jī)體免疫功能、發(fā)揮殺滅腫瘤的作用。分為兩類，第一類為非特異性免疫細(xì)胞，包括LAK、細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞(CIK)及NK細(xì)胞等；另一類為特異性免疫細(xì)胞，包括TILs、細(xì)胞毒性T細(xì)胞(CTL)以及經(jīng)基因修飾改造的T細(xì)胞。基因修飾技術(shù)的發(fā)展使T細(xì)胞受體(TCR)或嵌合抗原受體(CAR)基因轉(zhuǎn)導(dǎo)進(jìn)入傳統(tǒng)的T細(xì)胞成為可能。將TCR的α和β鏈的編碼基因?qū)隩細(xì)胞產(chǎn)生腫瘤相關(guān)抗原(TAA)的特異TCR-T細(xì)胞[27]，可識別多種抗原，如MAGE-A3和NY-ESO-1在黑色素瘤和滑膜肉瘤患者中顯示出良好的效果[28]。CAR由細(xì)胞外抗原識別域(單鏈可變片段)和細(xì)胞內(nèi)信號域組成，CAR-T治療是利用CAR改造的T淋巴細(xì)胞進(jìn)行適應(yīng)性免疫療法，CAR-T細(xì)胞可以以不依賴MHC的方式識別腫瘤抗原。CAR-T細(xì)胞療法在肉瘤治療中具有廣闊的前景，如在復(fù)發(fā)/難治性肉瘤患者中使用HER2特異性CAR-T細(xì)胞進(jìn)行的1/2期臨床研究表明，17例患者中有4例的病情穩(wěn)定12周～14個月，無嚴(yán)重毒性[29]。另一方面，CAR-T細(xì)胞治療也會產(chǎn)生多種不良反應(yīng)有關(guān)，包括細(xì)胞因子釋放綜合征和“腫瘤外”毒性，其中一些不良反應(yīng)是致命的。細(xì)胞因子釋放綜合征是由活化淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞清除反應(yīng)引發(fā)低血壓、發(fā)燒和神經(jīng)系統(tǒng)的變化等臨床反應(yīng)[30]?！澳[瘤外”毒性是由于識別正常細(xì)胞表面的腫瘤相關(guān)抗原被錯誤識別，隨后引起淋巴細(xì)胞攻擊，對正常組織造成損害。CAR-T細(xì)胞即使在靶抗原表達(dá)水平較低的情況下，也可通過靶抗原殺死正常細(xì)胞，因此CAR-T細(xì)胞療法應(yīng)用于癌癥需要相關(guān)抗原的特異表達(dá)，還需要對腫瘤高特異性TAAs進(jìn)一步研究，但采用TCR或CAR靶向TAAs的過繼細(xì)胞治療為肉瘤患者提供了一種新的治療方法，需要進(jìn)行隨機(jī)臨床試驗來評估其有效性和安全性。

4 免疫檢查點抑制劑的應(yīng)用

使患者免疫功能正?；鳛橐环N治療概念在多種腫瘤中的作用得到證實，免疫正?；赐ㄟ^糾正TME中的免疫缺陷恢復(fù)體內(nèi)正常的抗腫瘤免疫能力是腫瘤免疫療法的主要策略[31]。CTLA-4和程序性死亡受體-1(PD-1)是表達(dá)于T細(xì)胞上的主要抑制受體，被認(rèn)為是腫瘤細(xì)胞免疫抑制的重要組成部分，也是各種類型晚期惡性腫瘤新的治療靶點[32]。例如在TME中，TILs分泌的IFN-γ誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞中PD1配體1(PD-L1)表達(dá)，進(jìn)而引發(fā)PD-1在T細(xì)胞上的聚集、細(xì)胞凋亡和衰竭信號的傳遞，最終導(dǎo)致T細(xì)胞功能障礙，腫瘤通過逃避免疫監(jiān)視發(fā)生免疫逃逸現(xiàn)象[33]。阻斷PD-L1/PD-1通路可阻止T細(xì)胞功能障礙，恢復(fù)TME中的免疫反應(yīng)，并逐漸探索應(yīng)用于骨肉瘤的治療[34]。有報道稱，PD-L1等檢查點分子在骨肉瘤細(xì)胞上的表達(dá)與骨肉瘤的轉(zhuǎn)移和總生存率有關(guān)，抗PD-1單克隆抗體在少部分骨肉瘤患者(5%)中產(chǎn)生客觀反應(yīng)，但也有11%的患者發(fā)生與治療相關(guān)的嚴(yán)重不良事件[35]。由于TME相關(guān)的免疫逃逸機(jī)制是高度異質(zhì)性的，PD-1/PD-L1抗體只對少于40%的實體瘤有作用[36]，長時間持續(xù)性的抗PD-1或抗PD-L1治療對腫瘤治療并不能達(dá)到期望的生存率[37]。此外，聯(lián)合使用抗CTLA-4和抗PD-L1抗體的免疫療法提高了骨肉瘤小鼠模型的整體存活率，而單獨使用抗CTLA-4抗體治療沒有發(fā)現(xiàn)任何好轉(zhuǎn)，接受CTLA-4和PD1/PDL1的聯(lián)合免疫療法的腫瘤患者的反應(yīng)率有所提高，但同時也增加了免疫相關(guān)的不良反應(yīng)及治療成本，長期隨訪發(fā)現(xiàn)，這些患者在5年的總體生存率上差異很小[38]。進(jìn)一步的基礎(chǔ)和臨床研究將決定免疫檢查點抑制劑的療效。另外，高水平基因組不穩(wěn)定性的存在可能會增強(qiáng)針對免疫檢查點通路的作用，如在多種腫瘤類型中，高突變負(fù)荷和對靶向PD1和PDL1的藥物的總體反應(yīng)率之間存在顯著的相關(guān)性[34]，在骨肉瘤中也觀察到了基因組不穩(wěn)定。到目前為止，CTLA4、PD1以及PDL1的阻斷劑尚未用于骨肉瘤患者。因此，可以考慮將具有非重疊毒性特征的治療方案進(jìn)行組合，如免疫檢查點阻斷劑和溶瘤病毒的聯(lián)合應(yīng)用來提升免疫療法效果[39]。

綜上所述，盡管化療的使用顯著改善了骨肉瘤的治療效果，但在過去的三十年里，骨肉瘤的治療并未有顯著的改善，主要原因是骨肉瘤的罕見性、異質(zhì)性以及尚未發(fā)現(xiàn)腫瘤特異性抗原。隨著近年來對腫瘤微環(huán)境、腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移機(jī)制、抗腫瘤免疫系統(tǒng)和腫瘤免疫檢查點等方面的研究的逐漸深入，部分惡性腫瘤的預(yù)后明顯改善，因此免疫療法對于骨肉瘤患者來說是極富吸引力的治療選擇。細(xì)胞因子、腫瘤疫苗(或多肽疫苗)、免疫細(xì)胞和免疫檢查點抑制劑等方法雖然在一定程度上改善了部分骨肉瘤患者的預(yù)后，但還需要更多的研究來降低細(xì)胞因子治療中的毒性反應(yīng)、明確骨肉瘤相關(guān)特異抗原及其適應(yīng)證、提高免疫細(xì)胞治療的有效性和安全性及設(shè)計新的免疫檢查點抑制劑與其他療法的聯(lián)合應(yīng)用方案，因此闡明免疫監(jiān)測的狀態(tài)，發(fā)現(xiàn)骨肉瘤腫瘤特異性抗原[40]，以及協(xié)同多中心研究1對于骨肉瘤免疫療法的成功是必不可少的。