馮雪貞，肖轉(zhuǎn)泉，陳尚钘，范國(guó)榮，廖圣良，王宗德*

(1.江西農(nóng)業(yè)大學(xué) 林學(xué)院，國(guó)家林業(yè)和草原局木本香料(華東)工程技術(shù)研究中心，江西 南昌 330045； 2.江西師范大學(xué) 化學(xué)化工學(xué)院，江西 南昌 330027)

植物病原真菌不僅危害農(nóng)作物正常生長(zhǎng)，給農(nóng)林牧生產(chǎn)造成重大損失，而且會(huì)引發(fā)一系列食源性疾病，嚴(yán)重威脅人和動(dòng)物的生命健康。多年以來(lái)，人們一直使用的傳統(tǒng)化學(xué)抗菌劑在保護(hù)人類(lèi)健康、農(nóng)作物增產(chǎn)及食品保鮮等方面起到了巨大的作用，但長(zhǎng)期使用或使用不當(dāng)，很容易導(dǎo)致抗藥性和生態(tài)污染等問(wèn)題，并且有些抑菌劑存在難以降解、毒副作用大等缺點(diǎn)[1-3]。因此，開(kāi)發(fā)綠色高效的新型植物源抑菌劑極其重要。以天然產(chǎn)物為先導(dǎo)物，通過(guò)分子修飾、改性可以合成出具有活性的酯類(lèi)、醚類(lèi)、萜類(lèi)、酰胺類(lèi)和季銨鹽類(lèi)等衍生物，其在抗菌、除草方面具有較好的生物活性[4-6]。研究發(fā)現(xiàn)，肟類(lèi)化合物及其烴基醚衍生物具有良好的抑菌、殺蟲(chóng)、除草和抗病毒[7-9]等生物活性，由于具有低毒、低殘留等優(yōu)點(diǎn)，近年來(lái)逐漸受到研究者們的關(guān)注。植物源肟類(lèi)化合物及其烴基醚衍生物對(duì)植物病原真菌同樣具有較好的抑制作用，黃晶等[10]研究了檸檬醛肟、香茅醛肟及其烴基醚類(lèi)衍生物對(duì)油茶炭疽病菌等真菌的抑制作用，研究表明香茅醛肟對(duì)所試植物病原真菌的抑制活性優(yōu)良。但迄今為止，相關(guān)報(bào)道還比較少，開(kāi)發(fā)新型植物源肟類(lèi)化合物及其烴基醚衍生物，對(duì)于新型綠色高效植物源抑菌劑的開(kāi)發(fā)和應(yīng)用都具有十分重要的意義。本研究選擇價(jià)格低廉、綠色可再生的松節(jié)油為初始原料,將松節(jié)油在合成樟腦過(guò)程中的主要中間產(chǎn)物莰烯[11]與氧氯化磷和N,N-二甲基甲酰胺進(jìn)行Vilsmeier-Haack甲?；磻?yīng)，制得莰烯醛(ω-甲?；ㄏ?[12-13]，然后經(jīng)過(guò)肟化反應(yīng)合成得到莰烯醛肟并進(jìn)行相轉(zhuǎn)移催化醚化反應(yīng)合成莰烯醛肟烴基醚，測(cè)試目標(biāo)產(chǎn)物對(duì)植物病原真菌的抑菌活性，以期所合成的莰烯衍生物用作新農(nóng)藥開(kāi)發(fā)的前體分子。

1 實(shí) 驗(yàn)

1.1 試劑、儀器及菌種

莰烯醛(純度98%)，自制。羥胺鹽酸鹽、溴乙烷、溴代正丙烷、溴代正丁烷、溴代正戊烷、溴化芐等試劑均為市售化學(xué)純。

LDZX-50 KBS立式壓力蒸汽滅菌鍋；SW-CJ-ID型無(wú)菌超凈工作臺(tái)；GHP-250型智能培養(yǎng)箱；Agilent 5977 A型質(zhì)譜儀、Agilent 7980 B型氣相色譜儀(EI源，70 eV)；Nicolet IR 6700紅外光譜儀(KBr壓片法)；Bruker AVANCE 400型核磁共振儀(TMS為內(nèi)標(biāo)，CDCl3為溶劑)。

植物病原真菌：水稻紋枯病菌(Thanatephoruscucumeris)，辣椒疫霉病菌(Phytophthoracapsici)，辣椒菌核病菌(Sclerotiniasclerotiorum)，獼猴桃果實(shí)擬莖點(diǎn)霉(Phomopsissp.)，玉米赤霉病菌(Fusariumavenaceum)，梨鏈格孢菌(Alternariakikuchiana)，油茶炭疽病菌(Colletotrichumgloeosporioides)，葡萄炭疽病菌(Glomerellacingulata)，毛竹枯梢病菌(Ceratosphaeriaphyllostachydissp.nov.)，松枯梢病病原菌(Sphaeropsissapinea)，七葉樹(shù)殼孢菌(Fusicoccumaesuli)，枇杷炭疽病菌(Colletotrichumacutatum)。菌種均由江西農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)院森林保護(hù)教研室提供。

1.2 莰烯醛肟及其烴基醚的合成

1.2.1合成路線 莰烯醛肟及其烴基醚衍生物的合成路線見(jiàn)圖1。

1.2.2莰烯醛肟(2)的合成 參照文獻(xiàn)[14]，在250 mL磨口錐形瓶中，加入6.4 g碳酸鈉，30 mL水，0.1 mol莰烯醛，攪拌，溶解；8.34 g (0.12 mol)羥胺鹽酸鹽溶于20 mL水中，所成溶液在90 min內(nèi)緩慢滴加至錐形瓶中，加熱升溫至不超過(guò)65 ℃。4 h后取樣約1 mL，加入石油醚2～3 mL，振搖，分層后取上層經(jīng)干燥后進(jìn)行氣相色譜分析，以跟蹤反應(yīng)完成情況。若分析表明反應(yīng)液樣品中莰烯醛含量很少則反應(yīng)完成，冷卻后分出油層，水層用石油醚萃取2次，每次30 mL。萃取液與油層合并，用飽和食鹽水洗去堿性，無(wú)水硫酸鈉干燥后，蒸餾回收溶劑，真空蒸餾蒸出產(chǎn)品。

1.2.3莰烯醛肟烴基醚(3a～3e)的合成 參照文獻(xiàn)[15]，將0.02 mol莰烯醛肟(2)、0.05 mol鹵代烴、25 g甲苯加入至150 mL磨口錐形瓶?jī)?nèi)，再加入0.2 g溴化四丁基銨和3 g 40%氫氧化鈉水溶液，攪拌并加熱回流。反應(yīng)24 h后取上層反應(yīng)液少許進(jìn)行氣相色譜分析，若反應(yīng)液樣品中莰烯醛肟含量很少則反應(yīng)完成。反應(yīng)完成后，冷卻，加20 mL水，分出下層，上層用飽和食鹽水洗滌，干燥后回收甲苯，真空蒸餾得目標(biāo)化合物3a～3e。

圖1 莰烯醛肟及其烴基醚的合成路線

1.3 抑菌活性測(cè)試

采用菌絲生長(zhǎng)速率法[16]測(cè)定莰烯醛肟及其烴基醚對(duì)12種植物病原真菌的抑制作用。以無(wú)任何化合物的馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)培養(yǎng)基平板作為空白對(duì)照組，百菌清為陽(yáng)性對(duì)照。將莰烯醛肟及其用無(wú)菌水配制成質(zhì)量濃度為5 g/L 的溶液，在無(wú)菌條件下進(jìn)行二倍稀釋法得到5個(gè)濃度梯度的溶液，分別按一定的比例加入到經(jīng)滅菌處理的馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基中，配制最終質(zhì)量濃度為500、250、125、62.5和31.25 mg/L的含藥培養(yǎng)基平板，每種處理重復(fù)3次。接菌后置于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)數(shù)天[17-18]，當(dāng)對(duì)照組的培養(yǎng)基中的菌落直徑長(zhǎng)到6.0 cm左右(培養(yǎng)皿直徑為9 cm)，用十字交叉法測(cè)量其直徑，取平均值并計(jì)算抑制率。公式如下[19]：

菌落直徑=菌落實(shí)際生長(zhǎng)直徑-菌餅直徑

1.4 毒力回歸方程

莰烯醛肟對(duì)12種植物病原真菌進(jìn)行濃度梯度抑菌試驗(yàn)，利用DPS 7.0建立毒力回歸方程，以化合物濃度的對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo)(x)，抑制率轉(zhuǎn)換的機(jī)率值為縱坐標(biāo)(y)，毒力回歸方程為：y=a+bx，當(dāng)y=50%時(shí)，求出其EC50。

2 結(jié)果與討論

2.1 莰烯醛肟及其烴基醚的結(jié)構(gòu)分析

2.2 莰烯醛肟及其烴基醚的抑菌活性

2.2.1抑制率 莰烯醛肟及其烴基醚對(duì)植物病原真菌的抑制率數(shù)據(jù)可見(jiàn)表1。從表中數(shù)據(jù)可以看出，莰烯醛肟在藥液質(zhì)量濃度為500 mg/L時(shí)，對(duì)9種植物病原真菌的抑制率高達(dá)100%，對(duì)2種菌抑制率達(dá)到97%以上，遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)百菌清；在質(zhì)量濃度250 mg/L下，對(duì)7種菌抑制率達(dá)到95%以上；在125 mg/L時(shí)，對(duì)玉米赤霉病菌的抑制率為96.4%，對(duì)油茶炭疽病菌的抑制率為94.3%，對(duì)毛竹枯梢病菌的抑制率為97.7%。

表1 莰烯醛肟及其烴基醚的抑菌活性1)

1) A. 水稻紋枯病菌Thanatephoruscucumeris; B. 辣椒疫霉病菌Phytophthoracapsici; C. 辣椒菌核病菌Sclerotiniasclerotiorum; D. 獼猴桃果實(shí)擬莖點(diǎn)霉Phomopsis; E. 玉米赤霉病菌Fusariumavenaceum; F. 梨鏈格孢菌Alternariakikuchiana; G. 油茶炭疽病菌Colletotrichumgloeosporioides; H. 葡萄炭疽病菌Glomerellacingulata; J. 毛竹枯梢病菌Ceratosphaeriaphyllostachydis; K. 松枯梢病病原菌Sphaeropsissapinea; L. 七葉樹(shù)殼孢菌Fusicoccumaesuli; M. 枇杷炭疽病菌Colletotrichumacutatum;下表同same as in following table

在藥液質(zhì)量濃度為500 mg/L時(shí)，莰烯醛肟的烴基醚對(duì)12種植物病原真菌的抑制活性低于莰烯醛肟，但對(duì)毛竹枯梢病菌、梨鏈格孢菌和玉米赤霉病菌的抑制率均高于(或等于)百菌清。

2.2.2毒力回歸方程及EC50莰烯醛肟對(duì)12種植物病原真菌的毒力回歸方程及EC50可見(jiàn)表2。從表2可以看出，莰烯醛肟對(duì)油茶炭疽病的抑制效果最好，EC50為39.25 mg/L。莰烯醛肟對(duì)水稻紋枯病菌、獼猴桃果實(shí)擬莖點(diǎn)霉、玉米赤霉病菌、毛竹枯梢病病原菌的抑制效果也較好，EC50分別為49.21、40.59、45.10和44.99 mg/L。

表2 莰烯醛肟對(duì)12種植物病原真菌的毒力回歸方程及EC50

3 結(jié) 論

3.1由莰烯醛與羥胺鹽酸鹽反應(yīng)制得莰烯醛肟，并分別與5種鹵代烴反應(yīng)制得了莰烯醛肟乙基醚(3a)、莰烯醛肟正丙基醚(3b)、莰烯醛肟正丁基醚(3c)、莰烯醛肟正戊基醚(3d)、莰烯醛肟芐基醚(3e)。通過(guò)FT-IR、MS和NMR對(duì)產(chǎn)物結(jié)構(gòu)進(jìn)行了確認(rèn)和表征。

3.2莰烯醛肟及其烴基醚衍生物對(duì)上述植物病原真菌皆有一定的抑制作用。莰烯醛肟在藥液質(zhì)量濃度為500 mg/L時(shí)，對(duì)水稻紋枯病菌等9種植物病原真菌完全抑制；建立的毒力回歸方程相關(guān)系數(shù)基本達(dá)0.9，相關(guān)性較好，并且對(duì)油茶炭疽病的抑制效果最好，EC50為39.25 mg/L。5種烴基醚在藥液濃度為500 mg/L時(shí)，對(duì)毛竹枯梢病菌、梨鏈格孢菌和玉米赤霉病菌的抑制率均高于(或等于)百菌清。