李 鑫, 勇 強

(南京林業(yè)大學 化學工程學院，江蘇 南京 210037)

木質纖維素是地球上最豐富的可再生生物質資源，具有量大、價廉、環(huán)境友好等特點，是潛在規(guī)?；餆捴频脑稀Ｎ覈悄举|纖維素資源高產國，農作物秸稈年產大約7億～8億噸，林業(yè)采伐及加工剩余物等廢棄木質纖維素原料每年也有1億～2億噸左右[1]。如能實現(xiàn)木質纖維素高效資源化利用，不僅解決農林廢棄物資源浪費問題，更可變廢為寶，減少環(huán)境污染，具有重要的社會效益和環(huán)境效益，以及較高的經濟效益。米根霉(Rhizopusoryzae)作為根霉屬絲狀真菌的一種，是美國食品藥品監(jiān)督管理局(FDA)認證的安全菌株，具備多種生物基平臺化學品的生物制造能力，如富馬酸、乳酸、乙醇等[2-3]。米根霉是公認的最佳富馬酸生產菌之一[4]。富馬酸，又名反丁烯二酸、延胡索酸、紫堇酸或地衣酸，是最簡單的不飽和二元羧酸。最早從延胡索植物(Fumariaofficinalis)中發(fā)現(xiàn)提取得到[5]。因富馬酸分子中含有一個不飽和的雙鍵，是一種重要的有機化工原料和精細化學品，廣泛應用于材料、食品、醫(yī)藥、化工等領域。目前全世界富馬酸的產量達到每年9萬噸以上，主要采用化學法生產富馬酸，以苯為原料，通過順酐異構化生產富馬酸[5]。正是由于富馬酸的廣泛應用，美國能源部把富馬酸列為12種優(yōu)先發(fā)展的平臺化合物之一[4]。當前食品級富馬酸的售價已經超過10 000元/噸，以廉價、易得、非糧食基的木質纖維素資源為原料，利用米根霉發(fā)酵法生產富馬酸，一舉多得，有利支撐富馬酸產業(yè)的發(fā)展與技術升級。筆者針對米根霉利用木質纖維素原料生產富馬酸的技術現(xiàn)狀進行綜述，從米根霉積累富馬酸的代謝途徑、木質纖維素原料利用、發(fā)酵生產方式以及多聯(lián)產技術等角度，闡述近年來的研究進展。

1 木質纖維素生物煉制技術路線

木質纖維素資源豐富且廉價，但因結構的復雜性和抗降解性，必須經過預處理，才能破壞其復雜而緊密的結構[6]。木質纖維素經預處理和纖維素酶水解后，降解成可發(fā)酵碳源，繼而生物轉化為生物能源、生物基化學品，同時酶水解產生的木質素固體渣進一步被高值化利用，轉化為高附加值產品。這一技術路線被公認為最具應用前景的木質纖維素生物煉制途徑[7-9]，如下圖所示：

2 米根霉菌積累富馬酸的代謝機制

2.1 米根霉可利用的碳源及其產物

米根霉可以代謝多種碳源，底物選擇性寬泛，米根霉可利用的碳源包括：葡萄糖、木糖、甘露糖、半乳糖、甘露醇、果糖、蔗糖、木聚糖、果膠、單寧酸、菊粉等[3]。特別需要指出的是米根霉對利用木質纖維原料有其先天優(yōu)勢，可以利用六碳糖(葡萄糖)和五碳糖(木糖)[10]。米根霉的主要代謝產物是富馬酸、乳酸、蘋果酸、乙醇等。此外，米根霉可產多種生物催化劑，如纖維素酶、木聚糖酶、淀粉酶、果膠酶、脂肪酶等；同時，米根霉菌體生物質即可作飼料，又可提取細胞壁中的幾丁質/殼聚糖和制備葡萄糖胺[11-12]，如圖1所示。

圖1 米根霉利用多種不同碳源生產不同產物

2.2 米根霉利用葡萄糖積累富馬酸的代謝途徑

富馬酸作為一種重要的代謝中間產物，其在微生物體內積累的機制一直備受關注。富馬酸胞內積累機制主要包括乙醛酸支路途徑學說和胞液途徑學說。乙醛酸支路途徑學說，又稱“C2+C2”學說，由Foster等于1949年提出，認為富馬酸是由兩個二碳化合物在根霉菌胞內合成而來[13]；胞液途徑學說，又稱“C3+C1”學說，Romano等[14]于1967年研究發(fā)現(xiàn)根霉菌通過固定CO2來合成富馬酸，進而Osmani等[15]在前人的基礎上，總結出根霉菌的胞液中存在一條三羧酸循環(huán)(TCA)還原途徑合成富馬酸，提出了胞液途徑學說。丙酮酸羧化酶是該途徑的關鍵酶之一，它起著固定CO2的作用，催化CO2與丙酮酸反應生成草酰乙酸，通過蘋果酸脫氫酶轉化生成蘋果酸，最后經過富馬酸酶生成富馬酸。Kenealy和Wright等的研究結果證實了TCA 還原途徑是米根霉內積累富馬酸的主要途徑[16-17]。因此，在根霉菌中，通過胞液途徑合成富馬酸成為公認的主流富馬酸積累途徑(圖2)。

圖2 米根霉利用葡萄糖和木糖積累富馬酸的代謝途徑

2.3 米根霉利用木糖積累富馬酸的代謝途徑

米根霉除了可以利用葡萄糖外，還可以利用木糖發(fā)酵產富馬酸，特別適合于利用木質纖維基混合碳源(含有葡萄糖和木糖)生產富馬酸。有別于葡萄糖，米根霉菌利用木糖的過程中，木糖經木糖還原酶作用轉化為木糖醇，此反應需要消耗還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)；而后由依賴煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)的木糖脫氫酶作用，將木糖醇轉化為木酮糖，同時生成還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)；木酮糖由木酮糖激酶磷酸化為木酮糖-5-磷酸，木酮糖-5-磷酸進入磷酸戊糖代謝途徑生成果糖- 6-磷酸和3-磷酸甘油醛，再經糖酵解代謝途徑生成丙酮酸(圖2所示)。由于木糖利用過程需要NADPH，部分的葡萄糖- 6-磷酸須進入磷酸戊糖代謝途徑再生NADPH，分散了碳流分布，使流向生成丙酮酸方向的碳流減少，降低了木糖轉化為產物的代謝流和轉化率。此外，生成的NADH參與菌體的氧化磷酸化過程，為菌體提供較多的能量，導致菌體生物量的增加[18]。正是由于二氧化碳的分流作用，與米根霉利用葡萄糖產酸對比，米根霉利用木糖的轉化率顯著低于利用葡萄糖的轉化率[19]。竇暢等[10]研究結果表明以木糖為碳源，米根霉的生物量積累較多，對木糖轉化率超過37%。另外，Xu等[20]研究表明米根霉為了應對木糖發(fā)酵所帶來的氧化壓力和生存的需要，消耗較多的碳源，減少了富馬酸的生產。

3 米根霉產富馬酸的木質纖維原料

木質纖維素是植物的細胞壁的主要成分，其中包含纖維素、半纖維素和木質素等。木質纖維素和蛋白質緊密結合或化學鍵連接，形成復雜的化學結構，具有顯著的抗降解能力[21]，可保護植物細胞。木質纖維素資源包括農業(yè)廢棄物、造紙工業(yè)廢棄物、林業(yè)加工廢棄物等，我國擁有豐富的可再生木質纖維素資源。由于木質纖維素的復雜結構和抗降解性，木質纖維素資源必須經過處理后，轉化為可發(fā)酵的糖源，可被米根霉生物轉化為富馬酸。近10年來，國內外米根霉利用木質纖維素資源生產富馬酸的研究，如表1所示。目前文獻報道用于米根霉發(fā)酵產富馬酸的木質纖維素資源主要有玉米芯、玉米秸稈、造紙廢棄物、牛糞、甘蔗渣、板栗栗苞、麥麩等。 Xu等[22]以酸預處理玉米秸稈為原料，利用米根霉ME-F12發(fā)酵產富馬酸，產量達到27.79 g/L。筆者課題組以堿預處理玉米芯為原料，利用米根霉CICC40351發(fā)酵產富馬酸，采用組合發(fā)酵方式生產富馬酸，富馬酸產量最大達到41.32 g/L[23]。Wu等[24]以酸預處理玉米芯為原料，利用能夠耐受糠醛的米根霉WHT5生產富馬酸，富馬酸質量濃度可達49.05 g/L。Deng等[25]以氨預處理甘蔗渣為原料，利用米根霉ATCC20344發(fā)酵富馬酸，產量達到34.20 g/L。

表1 近10年來米根霉利用木質纖維素資源生產富馬酸的研究

4 米根霉產富馬酸的發(fā)酵方式及聯(lián)產技術

4.1 分步水解與發(fā)酵法

米根霉利用木質纖維素發(fā)酵產富馬酸，根據(jù)木質纖維素糖化和發(fā)酵工藝的差異，其發(fā)酵方式分為分步水解與發(fā)酵法(SHF)、同步糖化發(fā)酵法(SSF)以及組合發(fā)酵法。分步水解與發(fā)酵法(SHF)是指經預處理的木質纖維素原料，首先使其水解(化學法或酶法)成可發(fā)酵碳源，然后由微生物再進行發(fā)酵。該方法的優(yōu)點是水解和發(fā)酵各自在其最佳的條件下進行，水解得率和產量較高；其缺點是木質纖維素的水解與發(fā)酵分步進行，易受到水解產物抑制或發(fā)酵底物濃度過高產生的限制作用[18]。近年來，較多研究中應用SHF技術于米根霉發(fā)酵產富馬酸。Xu等[22]采用酶水解方式水解酸預處理的玉米秸稈，纖維素酶用量為60 FPIU/g葡聚糖水解72 h，葡萄糖和木糖質量濃度分別為31.2和1.8 g/L，水解液經濃縮后，用于米根霉發(fā)酵，富馬酸的產量和產率分別為27.79 g/L和0.33 g/(L·h)。本課題組以自水解預處理的板栗栗苞為原料，采用酶水解，纖維素酶用量為50 FPIU/g，酶解得率超過95%，米根霉發(fā)酵96 h后，富馬酸質量濃度達到15.78 g/L，糖酸轉化率為0.34 g/g[29]。

4.2 同步糖化發(fā)酵法及組合發(fā)酵法

同步糖化發(fā)酵法(SSF)是指酶水解糖化與發(fā)酵在同一反應器中同步進行，具有發(fā)酵周期短、成本低、避免底物抑制等優(yōu)點[31]。Li等[27]以生產低聚木糖的玉米芯廢渣為原料，進行米根霉SSF產富馬酸，質量濃度達到12.54 g/L，富馬酸產量較之SHF過程高1.8倍，顯示了利用木質纖維原料SSF產富馬酸的優(yōu)勢。SSF過程也存在著一定的局限性，酶水解條件和發(fā)酵條件難于統(tǒng)一，不能在各自的最佳條件下進行，使酶水解和發(fā)酵均受到一定程度的限制，特別是溫度，纖維素酶水解溫度一般在45～50 ℃，而米根霉發(fā)酵溫度一般在28～35 ℃，水解與發(fā)酵的溫度難于協(xié)調一致。有研究從影響SSF的主要因素入手，優(yōu)化溫度和發(fā)酵培養(yǎng)條件，實現(xiàn)在38 ℃的較高溫度下SSF產富馬酸，獲得了較高的富馬酸產量，說明米根霉能夠耐受較高的發(fā)酵溫度，也避免纖維素酶水解性能的大幅度下降[31]。

現(xiàn)有的米根霉SSF產富馬酸的研究中，底物質量分數(shù)主要在5%～10%(以絕干固形物計)之間，特別是利用木質纖維原料的SSF，富馬酸的產量顯著低于淀粉基原料。Deng等[32]報道以玉米淀粉為原料，米根霉DG-3進行SSF產富馬酸，玉米淀粉為10%時，富馬酸質量濃度達到44.10 g/L。這說明現(xiàn)階段米根霉SSF研究屬于液態(tài)浸沒式發(fā)酵，體系中90%為游離水，是在液態(tài)狀態(tài)下完成糖化與發(fā)酵過程。但對于利用木質纖維原料來說，原料的高濃度對于過程經濟性和技術要求至關重要，增加底物濃度，可增加產物濃度，有利于降低設備尺寸和能耗，減輕下游分離純化負擔。理想的木質纖維原料起始質量分數(shù)的臨界值為15%～20% (以絕干固形物計)。高木質纖維原料起始濃度意味著體系內黏度增加，游離水有限，使傳質受限，直接影響纖維素酶的水解行為和SSF過程[33]。因此，提高木質纖維原料的底物濃度，對米根霉利用木質纖維素資源產富馬酸非常重要。筆者所在課題組開展了高底物濃度的米根霉SSF產富馬酸，但研究結果表明一味增加木質纖維原料的底物濃度，富馬酸的產量不僅降低，且伴隨著副產物乙醇濃度的增加，以及葡萄糖利用率和底物轉化率的下降[23]。

米根霉高木質纖維原料濃度SSF過程，不同于無游離水的固態(tài)發(fā)酵過程，又不同于低底物濃度的液態(tài)浸沒式發(fā)酵過程，是介于兩者之間的臨界狀態(tài)。針對高底物濃度SSF過程存在的問題，筆者課題組開展了組合發(fā)酵法利用木質纖維原料產富馬酸的研究。以堿預處理玉米芯為原料，將SHF和分批補料式SSF有機結合起來，建立了高底物濃度發(fā)酵產富馬酸工藝技術，底物濃度達到20%，富馬酸質量濃度達到41.32 g/L[23]。該組合發(fā)酵法，與SHF和SSF發(fā)酵法對比，有效克服了SHF和SSF發(fā)酵方式存在的問題，顯著提高了底物濃度，促進了米根霉利用木質纖維素產富馬酸。

4.3 基于發(fā)酵法產富馬酸的多聯(lián)產技術

木質纖維原料水解后，水解液中主要單糖組分為葡萄糖和木糖。雖然米根霉兼具利用葡萄糖和木糖的能力，但從利用葡萄糖和木糖產富馬酸的效率來看，顯然葡萄糖好于木糖[10]。為了克服米根霉利用木質纖維素產富馬酸過程中木糖利用率低的問題，Xu等[22]以含木糖的水解液增殖米根霉，提高菌體生物量；再由增殖的米根霉將富含葡萄糖的水解液轉化為富馬酸。這一研究雖然實現(xiàn)木質纖維素中碳源組分的全利用，但并沒有把半纖維素組分轉化為有價值產品。既然米根霉發(fā)酵過程中產生較多的菌體生物量，學者將實現(xiàn)菌體資源的再利用作為新的研究方向。米根霉菌體中富含殼聚糖，占菌體干質量的13%以上，是較為理想的生物材料[34]。Liao等[26]以牛糞為原料，以米根霉ATCC20344為菌種，聯(lián)產富馬酸和幾丁質，富馬酸質量濃度為31 g/L，菌體生物量為11.5 g/L，每克菌體含0.21 g幾丁質。筆者課題組也開展了聯(lián)產富馬酸和殼聚糖的研究，以10%玉米芯渣為原料，SSF產富馬酸，富馬酸質量濃度為28.65 g/L；SSF后，采用堿法從米根霉廢棄菌體中提取殼聚糖，米根霉殼聚糖的脫乙酰度為90%[35]。與此同時，筆者課題組另辟蹊徑，提出了一種新的解決木糖利用率低的思路，即將木質纖維素中的半纖維素組分轉化為低聚木糖，而將纖維素組分轉化為富馬酸。采用堿法預處理玉米芯，分別得到富含半纖維素和纖維素的組分；由米根霉將富含纖維素組分轉化為富馬酸，富馬酸質量濃度達到35.22 g/L；再由內切木聚糖酶將富含半纖維素組分水解制備低聚木糖，低聚木糖得率達到62.35%[36]。低聚木糖與富馬酸的聯(lián)產，實現(xiàn)了木質纖維素碳源組分的高效利用，增加了產品的附加值，有效降低了富馬酸生產成本，為木質纖維素生物轉化富馬酸提供了一種新的途徑。

5 展 望

隨著市場對富馬酸的需求量增加，以及石化資源面臨的資源受限和生態(tài)環(huán)保問題，發(fā)酵法生產富馬酸前景廣闊。木質纖維素是自然界中最為豐富的可再生生物質資源，米根霉利用木質纖維素生產富馬酸是富馬酸生產的未來發(fā)展方向之一，將有助于降低富馬酸生產成本，提高木質纖維素的利用價值。因此，基于木質纖維素的發(fā)酵法生產富馬酸的工程技術研究與開發(fā)，包括米根霉發(fā)酵性能的提高、木質纖維素的綜合利用、發(fā)酵方式的改進與提高、多聯(lián)產技術的應用等，將顯著降低發(fā)酵法生產富馬酸的成本?？萍妓降牟粩噙M步，必然推動發(fā)酵法生產富馬酸技術的發(fā)展，未來基于木質纖維素的米根霉生產富馬酸技術一定可以與基于石化資源的富馬酸生產技術相競爭。