于立剛, 陳素琴, 毛國良

背景

結(jié)直腸癌(colorectal carcinoma, CRC)是臨床上常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤. 但其確切發(fā)病機制和預后獨立因素仍未闡明. 本研究通過生物信息學方法分析了zeste基因增強子同源物2(enhancer of zeste homolog 2, EZH2)和血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)基因在CRC中的表達情況及其和患者預后的感謝. 并采用免疫組化檢測了EZHE2和VEGF蛋白的表達情況及其與患者臨床特征的關系.

目的

探討EZH2和VEGF在CRC中的表達、突變情況及其與患者臨床病理特征和預后的關系.

方法

首先在TCGA數(shù)據(jù)庫中比較EZH2 和VEGF 基因mRNA在腸癌患者癌和癌旁組織中的表達, 同時分析EZH2和VEGF基因的突變情況; 采用STRING數(shù)據(jù)庫建立EZH2和VEGF基因表達網(wǎng)絡并篩選網(wǎng)絡中的關鍵基因. 根據(jù)EZH2和VEGF在腫瘤組織中的表達分為高低表達組, Cox回歸模型Log-rank檢驗比較高低表達組患者總生存和無疾病進展生存是否存在差異. 同時選取80例腸癌手術(shù)患者, 留取患者癌組織和癌旁組織, 采用免疫組織化學法檢測上述組織中EZH2和VEGF蛋白表達水平.

結(jié)果

TCGA數(shù)據(jù)庫顯示EZH2 和VEGF 基因在CRC組織中的表達水平顯著高于對應的正常腸上皮組織(P＜0.05), 而與腸癌患者的臨床分期并無明顯相關性(P＞0.05); EZH2和VEGF基因在人腸癌中的突變率分別為1.5%和1.9%, 且EZH2和VEGF不同突變組織中mRNA表達水平存在明顯差異. 網(wǎng)絡中共有22個蛋白, 各蛋白平均相互作用指數(shù)為10.5, 區(qū)域聚集指數(shù)為0.8, 各蛋白富集明顯(P＜0.01). Cytohubb軟件篩選出EZH2, DNMT1, HDAC2, YY1和SUZ12為網(wǎng)絡中的關鍵基因; EZH2和VEGF高低表達與患者總生存期均無相關性(P＞0.05), 而VEGF高表達組患者無疾病進展生存期顯著低于低表達組(HR = 1.8, P＜0.05). 免疫組化顯示, EZH2和VEGF在腸癌組織中的陽性表達率均顯著高于癌旁組織 (P＜0.01). EZH2陽性表達與腸癌腫瘤直徑、分化程度和Duke分期有關(P＜0.05). 而VEGF陽性表達與腸癌患者分化程度和Duke分期存在相關性(P＜0.05).

結(jié)論

EZH2和VEGF在腸癌組織中呈現(xiàn)明顯上調(diào)表達和突變, 其高表達與腫瘤大小、分會程度和Duke分期有關, 并可作為腸癌預后的潛在分子標志物.

? The Author(s) 2020. Published by Baishideng Publishing Group Inc. All rights reserved.

0 引言

腫瘤流行病學數(shù)據(jù)顯示, 美國每年結(jié)直腸癌(colorectal carcinoma, CRC)發(fā)病人數(shù)為15萬例左右, 死亡人數(shù)約為5萬[1]. 我國尚無結(jié)直腸腫瘤確切的流行病學數(shù)據(jù), 但各個地方的結(jié)直腸流行病學研究提示近年來其發(fā)病率呈現(xiàn)出上升趨勢[2]. 早期行CRC根治術(shù)的患者預后較好, 而晚期患者預后較差[3,4]. 目前, 關于CRC預后的相關因素研究認為, 患者TNM分期是預后的獨立因素. 同時, 近年來隨著分子生物學技術(shù)的不斷進步, 結(jié)直腸的惡性生物學行為調(diào)控機制逐漸明晰, 它是一個涉及多基因多步驟的分子生物調(diào)控過程[5], 在此過程中, 多種蛋白因子參與其中包括zeste基因增強子同源物2(enhancer of zeste homolog 2,EZH2)和血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)等[6].EZH2基因是果蠅zeste基因增強子的人類同源物, 是PcG(Polycomb Group)基因家族的重要成員之一. EZH2能夠促進細胞增殖、腫瘤細胞擴散, 在多種腫瘤組織中高表達, 與腫瘤惡性程度和患者預后密切相關. 而腫瘤的浸潤和轉(zhuǎn)移與血管生成密切相關. VEGF是腫瘤血管生成的重要因子, 其表達水平與腫瘤微血管生成有關. 在本研究中, 我們首先采用生物信息學方法, 分析EZH2和VEGF基因在腸癌中的表達和突變情況及其與患者預后的關系, 并采用免疫組化對上述生物信息結(jié)果進行驗證.

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 EZH2 和VEGF 基因生物信息學分析：首先在TCGA數(shù)據(jù)庫中比較EZH2和VEGF基因mRNA在腸癌患者癌組和癌旁組織中的表達, 同時分析EZH2和VEGF基因的突變情況. STRING數(shù)據(jù)庫(http：//string-db.org/cgi/input.pl)[7]對EZH2和VEGF及相互作用基因進行網(wǎng)絡分析, 物種選擇人, 作用蛋白不少于20個, 相互作用關系置信度大于0.7. 根據(jù)EZH2和VEGF基因mRNA表達中位數(shù)將腸癌分為高低表達組, Cox回歸模型Log-rank檢驗比較高低表達組腸癌患者總生存和無疾病進展生存是否存在差異, 并計算風險比(hazard ratio, HR).

1.1.2 EZH2和VEGF功能富集和蛋白-蛋白相互作用網(wǎng)絡構(gòu)建：采用基因本體論(gene ontology, GO)對VEGF和EZH2基因和相關蛋白進行功能富集, 包括細胞組分, 分子功能和生物學過程3個層面[8]. 同時利用STRING數(shù)據(jù)庫構(gòu)建相互作用蛋白網(wǎng)絡構(gòu)建條件為置信度大于0.5[9].

1.1.3 EZH2和VEGF共表達分析：在TCGA數(shù)據(jù)庫中, 依據(jù)與EZH2和VEGF基因共表達關系, 對與EZH2和VEGF基因存在相關性的基因進行聚類. 同時選取正相關和負相關表達最為明顯的2個基因進行分析, 計算spearman相關系數(shù).

1.1.4 組織標本留取及儀器試劑：回顧性研究我院2015-01/2019-06收治的80例CRC患者的蠟塊癌和癌旁組織標本. 患者納入標準： 患者病理明確診斷為CRC; 術(shù)前未接受新輔助治療; 無合并其他系統(tǒng)惡性腫瘤; 患者組織標本獲取經(jīng)患者或家屬同意并簽訂知情同意書. 排除標準： 患者CRC診斷不明確; 術(shù)前接受新輔助化療或生物治療; 合并其他系統(tǒng)惡性腫瘤; 臨床病理自理不完整者. 本項目研究經(jīng)天津市武清區(qū)人民醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會批準. 采用免疫組織化學SP法檢測EZH2和VEGF在癌組和癌旁組織中的表達水平及其與患者臨床病理特征的關系. EZH2和VEGF單克隆抗體(鼠抗人, 一抗), 擬購自美國cell signaling公司; 鼠抗兔HRP(二抗)抗體, 購自美國sigma公司; PBS緩沖液, 購自武漢博士德生物工程有限公司.

1.2 方法EZH2和VEGF免疫組化檢測： 組織標本處理及免疫組化操作： (1)脫蠟水化, 將組織切片置于二甲苯中浸泡10 min, 無水乙醇浸泡5 min, 95%, 80%和79%乙醇各浸泡5 min; (2)抗原修復, 水浴鍋加入0.01 mol/L枸櫞酸鈉至95 ℃, 放入切片15 min; (3)免疫組織化學染色, 按操作指南逐步脫蠟水化、抗原修復、滴加一抗和二抗, 然后顯色, 最終封片鏡檢.

統(tǒng)計學處理采用SPSS 19.0軟件進行統(tǒng)計學處理, 計數(shù)資料采用率表示, 組間比較采用χ2檢驗; 生存分析采用風險比例模型Log-rank檢驗, 多因素生存分析采用Cox回歸模型,P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義.

2 結(jié)果

2.1 EZH2和VEGF在CRC中的表達TCGA數(shù)據(jù)庫顯示,EZH2和VEGF基因在CRC組織中的表達水平顯著高于對應的正常腸上皮組織(P＜0.05), 而EZH2和VEGF基因表達水平與腸癌患者的臨床分期并無明顯相關性(P＞0.05)(圖1).

圖 1 EZH2和VEGF在結(jié)直腸癌中的表達及其與患者臨床分期的關系. A： EZH2基因mRNA在腸癌患者癌和癌旁組織中的比較; B： EZH2基因mRNA在不同臨床分期腸癌患者中的比較; C： VEGF基因mRNA在腸癌患者癌組織和癌旁組織中的比較; D： VEGF基因mRNA在不同臨床分期腸癌患者中的比較. EZH2： zeste基因增強子同源物2; VEGF： 血管內(nèi)皮生長因子.

2.2 EZH2和VEGF功能富集EZH2和VEGF基因生物學過程、細胞成分和分子功能主要分別富集于細胞增殖調(diào)控、ESC/E(Z)復合體和血管內(nèi)皮生長因子激活受體活性(表1).

2.3 EZH2和VEGF基因突變分析EZH2和VEGF基因在人腸癌中的突變率分別為1.5%和1.9%, 且EZH2和VEGF不同突變組織中期mRNA表達水平存在明顯差異(圖2).

2.4 EZH2和VEGF相互作用網(wǎng)絡分析EZH2和VEGF構(gòu)建相互作用蛋白網(wǎng)絡, 網(wǎng)絡中共有22個蛋白, 各蛋白平均相互作用指數(shù)為10.5, 區(qū)域聚集指數(shù)為0.8, 各蛋白富集明顯(P＜0.01). Cytohubb軟件篩選出EZH2,DNMT1,HDAC2,YY1和SUZ12為網(wǎng)絡中的關鍵基因(圖3).

2.5 EZH2和VEGF共表達分析EZH2和VEGF基因正負相關表達的基因進行了聚類分析(圖4), NCAPG2(r= 0.69,P＜0.05)和PBXIP1基因(r= -0.22,P＜0.05)分別于EZH2基因正負相關表達(圖5A、B). 而GTPBP2(r= 0.598,P＜0.05和PECH與VEGF(r= -0.38,P＜0.05)分別于VEGF基因正負相關表達(圖5C、D).

2.6 EZH2和VEGF表達與患者預后根據(jù)基因在腸癌組織中的表達水平分為高低表達組, 采用Cox回歸模型繪制生存曲線, Log-rank檢驗顯示EZH2和VEGF高低表達組與患者總生存期均無相關性(P＞0.05), 而VEGF高表達組患者無疾病進展生存期顯著低于低表達組(HR = 1.8,P＜0.05)(圖6).

2.7 EZH2和VEGF表達與臨床病理特征關系EZH2主要表達于腸癌細胞的細胞核, 呈現(xiàn)棕黃色顆粒狀(圖7). EZH2在腸癌組織中的陽性表達率為63.8%(51/80), 在癌旁組織中的陽性表達率為6.3%(5/80), 癌組織中EZH2陽性表達率顯著高于正常腸組織(χ2= 58.13,P＜0.01). VEGF表達于細胞質(zhì)表達, VEGF在腸癌患者腫瘤組織中的陽性表達率為60.0%(48/80), 高于癌旁組織26.5%(21/80), 差異有統(tǒng)計學意義(χ2= 18.58,P＜0.01). EZH2陽性表達與患者性別、年齡、腫瘤發(fā)生部和腫瘤直徑無明顯相關性(P＞0.05), 而EZH2陽性表達與腫瘤分化程度和Duke分期有關(P＜0.05). VEGF陽性表達與腸癌患者分化程度和Duke分期存在相關性(P＜0.05), 而與其他病理特征無關(表2).

表 1 EZH2和VEGF基因相關生物學功能富集

3 討論

EZH2為果蠅zeste基因增強子同源物2, 在多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起到重要作用. 該基因的異常表達可能與多種實體腫瘤的惡性表型有關[8]. EZH2是1996年初Hobert等采用酵母雙雜交系統(tǒng)方法發(fā)現(xiàn)的一個新基因, 當時命名為ENX-1. 它在體內(nèi)和體外都能和Vav相互作用, 是果蠅zeste基因增強子[E(z)]的人類同源物. 在人類EZH2基因定位于人7染色體3帶5區(qū), 為多梳蛋白復合體PcG(Polycomb group)家族重要成員之一. 既往研究發(fā)現(xiàn), EzH2表達產(chǎn)物可以促進腫瘤細胞增殖及擴散, 在多種惡性腫瘤如前列腺癌、膀胱癌、乳腺癌、肝癌、胃癌等腫瘤中呈現(xiàn)異常表達[9-12]. 但關于EZH2與結(jié)腸癌的關系研究較少, 其與結(jié)腸癌發(fā)生、發(fā)展、侵襲轉(zhuǎn)移等生物學行為之間的關系并不是十分清楚.

VEGF是1989年Ferrarra首先發(fā)現(xiàn)并報道的, VEGF分子量在34-45 KD之間, 研究顯示它屬于血小板衍生生長因子家族的一員,在人體和動物體內(nèi)的各種組織均有廣泛的分布, 不僅是生理組織, 在腫瘤等病理組織中, 也有大量的血管內(nèi)皮生長因子分布[13,14]. VEGF是一種能產(chǎn)生多種生物學效應、功能強大的細胞因子, 對腫瘤發(fā)生發(fā)展影響最大的功能就是促進血管內(nèi)皮細胞有絲分裂, 故將其命名成血管內(nèi)皮細胞生長因子[15,16]. 目前發(fā)現(xiàn)的VEGF亞型有VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D、VEGF-E、胎盤生長因子(placenta growth factor, PIGF). VEGF家族中, VEGF-A 是主要的血管生長因子, 對于血管內(nèi)皮的生長起著主要作用, 所以對它的研究也最為成熟, 雖然如此, 對于VEGF-A的作用原理當前仍未研究透徹, 如今, 血管內(nèi)皮生長因子已經(jīng)成為研究腫瘤的重要分支, 關于VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D、VEGF-E等因子的作用原理也成為當下研究的熱點. 腫瘤新生血管的生長并不僅受VEGF的影響, 除此之外, 還有腫瘤轉(zhuǎn)化因子、壞死因子等因素參與其中, 這些因子通過什么原理對腫瘤組織產(chǎn)生影響, 以及他們之間有沒有聯(lián)系, 這些都是醫(yī)學界尚未解決和清楚的問題, 未來一段時間內(nèi), 影響腫瘤組織的細胞因子, 尤其是血管內(nèi)皮細胞生長因子將會是研究的重點和熱點問題[17,18]. VEGF蛋白表達與CRC患者的關系研究報道較少.

表 2 EZH2和VEGF蛋白表達與腸癌臨床病理特征之間的相關性

圖 2 EZH2和VEGF基因突變分析. A： EZH2基因在腸癌中的突變情況; B： VEGF基因在腸癌中的突變情況; C： EZH2基因不同突變組織中表達水平比較; D： VEGF基因不同突變組織中表達水平比較. a突變明顯; EZH2： zeste基因增強子同源物2; VEGF： 血管內(nèi)皮生長因子; VEGFA： 血管內(nèi)皮生長因子A.

圖 3 EZH2和VEGF相互作用網(wǎng)絡. A： STRING數(shù)據(jù)庫中EZH2和VEGF相互作用網(wǎng)絡; B： 網(wǎng)絡中的關鍵基因篩選. EZH2： zeste基因增強子同源物2; VEGF： 血管內(nèi)皮生長因子; YY1： 陰陽因子1; DNMT1： DNA甲基轉(zhuǎn)移酶1; HDAC2： 組蛋白去乙?；?; SUZ12： 多數(shù)蛋白復合體12; IGF1： 胰島素生長因子1; EGF： 表皮生長因子; HIF1A： 缺氧誘導因子1A; RBBP4： 視網(wǎng)膜母細胞瘤結(jié)合蛋白4; HDAC1： 組蛋白去乙酰化酶1; EED： 胚胎外胚層發(fā)育基因; RBBP7： 視網(wǎng)膜母細胞瘤結(jié)合蛋白7.

圖 4 EZH2和VEGF及其相關基因共表達分析. A： EZH2正相關表達基因; B： EZH2負相關表達基因; C： VEGF正相關表達基因; D： VEGF負相關表達基因. EZH2： zeste基因增強子同源物2; VEGF： 血管內(nèi)皮生長因子.

在本研究中, 我們首先采用生物信息學方法, 分析EZH2和VEGF基因在腸癌中的表達和突變情況及其與患者預后的關系. 并采用免疫組對上述生物信息結(jié)果進行驗證. 生物信息分析結(jié)果顯示, 腸癌組織中EZH2和VEGF表達水平均高于對應的正常腸黏膜上皮, 提示EZH2和VEGF基因在腸癌的發(fā)生發(fā)展中可能發(fā)揮了重要作用. 同時, 我們?nèi)虢M的80例腸癌患者免疫組化也顯示腸癌組織中EZH2和VEGF蛋白陽性表達率顯著高于正常腸黏膜, 與生物信息分析結(jié)果一致. TCGA數(shù)據(jù)庫中,EZH2和VEGF基因均存在明顯的突變, 且不同突變組中基因拷貝數(shù)存在差異, 說明EZH2和VEGF表達水平可能與突變類型存在一定的關聯(lián).

根據(jù)基因在腸癌組織中的表達水平分為高低表達組, 采用Cox回歸模型繪制生存曲線, Log-rank檢驗顯示EZH2和VEGF高低表達組與患者總生存期均無相關性(P＞0.05), 而VEGF高表達組患者無疾病進展生存期顯著低于低表達組(HR = 1.8,P＜0.05). 說明VEGF高表達患者預后不良, 分析原因可能與VEGF高表達患者腫瘤微血管密度增高, 遠處轉(zhuǎn)移風險增加有關. 但其確切分子機制有待進一步評價.

圖 5 EZH2和VEGF正負相關表達基因. A： EZH2正相關表達基因; B： EZH2負相關表達基因; C： VEGF正相關表達基因; D： VEGF負相關表達基因. EZH2： zeste基因增強子同源物2; VEGF： 血管內(nèi)皮生長因子; NCAPG2： 非染色體結(jié)構(gòu)維護凝縮蛋白I復合體G亞基2; GTPBP2： GTD連接蛋白2.

E Z H2和V E G F相互作用蛋白網(wǎng)絡中,E Z H2,DNMT1,HDAC2,YY1和SUZ12基因為關鍵基因, 上述基因大多參與腫瘤的分裂增殖和侵襲轉(zhuǎn)移生物學過程. 進一步的生存分析認為,VEGF基因高表達患者無疾病進展生存期較短, 其高表達是腸癌患者預后不良的危險因素, 并有望成為腸癌預后的分子標志物.

文章亮點

實驗背景

文獻報道EZH2和VEGF在多種實體腫瘤中高表達并與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及惡性生物學行為有關. EZH2和VEGF在結(jié)直腸癌(colorectal carcinoma, CRC)中的表達及其與患者臨床病理特征及預后關系不明.

實驗動機

本研究通過生物信息學方法探討EZH2和VEGF在CRC中低表達、相關信號通路及與患者預后的關系. 同時采用免疫組織化學法驗證EZH2和VEGF蛋白表達水平與CRC患者臨床病理特征的關系, 佐證生物信息分析結(jié)果.

圖 6 EZH2和VEGF表達與患者預后關系生存曲線. A： EZH2表達與腸癌患者總生存關系; B： EZH2表達與腸癌患者無疾病進展生存關系; C： VEGF表達與腸癌患者總生存關系; D： VEGF表達與腸癌患者無疾病進展生存關系. EZH2： zeste基因增強子同源物2; VEGF： 血管內(nèi)皮生長因子; HR： 風險比.

實驗目標

探討EZH2和VEGF在CRC中表達及與患者臨床病理和預后的關系, 判斷其作為CRC預后分子標志物的可行性.

實驗方法

在TCGA數(shù)據(jù)庫中比較EZH2和VEGF基因mRNA在腸癌患者癌和癌旁組織中的表達.構(gòu)建EZH2和VEGF基因表達網(wǎng)絡并篩選網(wǎng)絡中的關鍵基因.比較EZH2和VEGF高低表達組患者總生存和無疾病進展生存是否存在差異.采用免疫組織化學法檢測上述組織中EZH2和VEGF蛋白表達水平及其與患者臨床病理特征的關系.

實驗結(jié)果

EZH2和VEGF在CRC組織中的表達水平上調(diào)(P＜0.05). VEGF高表達組患者無疾病進展生存期顯著低于低表達組(HR = 1.8,P＜0.05). EZH2和VEGF蛋白在腸癌組織中的陽性表達率均顯著高于癌旁組織(P＜0.01). EZH2陽性表達與腸癌腫瘤直徑、分化程度和Duke分期有關(P＜0.05). 而VEGF陽性表達與腸癌患者分化程度和Duke分期存在相關性(P＜0.05).

實驗結(jié)論

EZH2和VEGF基因mRNA在腸癌組織中的表達水平明顯高于癌旁正常組織, 且上述基因編碼蛋白表達水平與患者的腫瘤直徑、分化程度和Duke分期有關.

展望前景

EZH2和VEGF有望成為腸癌預后的潛在分子標志物.