盧艷敏，張靖天，張新波，肖喆，許曉玲，霍守亮

1.天津城建大學環(huán)境與市政工程學院 2.中國環(huán)境科學研究院

磷是水體富營養(yǎng)化的主要控制因子，其來源包含自然徑流、人類活動排放的外源性磷輸入和沉積物中內(nèi)源性磷釋放。在外源性磷輸入得到有效控制的情況下，內(nèi)源性磷釋放是影響磷循環(huán)的重要因素[1-2]。沉積物中有機磷在總磷中的占比可達20%～60%，最高可達80%[3-4]。當活性磷的供給量不能滿足生物進行生命活動的需要時，沉積物中的有機磷可以向無機磷轉(zhuǎn)化，參與磷的地球化學循環(huán)過程[5-6]。有機磷易通過礦化作用或生物途徑(磷酸酶水解、細菌降解等)轉(zhuǎn)化成生物活性磷，進入上覆水體后，再經(jīng)過生物體吸收、代謝重新在水體中形成循環(huán)，有機磷成為生物可利用磷的主要來源[7]。明確沉積物中有機磷的組成和濃度是研究沉積物中有機磷生物可利用性的前提。

酶水解過程是指利用酶催化反應(yīng)使有機磷分子中的P—O—P和C—O—P鍵斷裂并生成無機磷[8]，最終被細菌、藻類等生物所利用。有機磷的酶水解過程具有特異性，磷酸單酯酶能夠水解聚合態(tài)磷和磷酸單酯磷，磷酸二酯酶能夠較好地水解二酯磷，植酸酶則可以水解所有的磷酯鍵[9]。堿性磷酸酶是水體中常見的、研究較為廣泛的專一性磷酸酯水解酶，通常位于細胞的外表面。當水體無機磷濃度不足以維持生物的生長時，浮游生物分泌的堿性磷酸酶可催化有機磷轉(zhuǎn)化為可供生物利用的無機磷[10]。堿性磷酸酶活性能表征環(huán)境營養(yǎng)狀況和生物量大小，且與浮游生物、初級生產(chǎn)力等富營養(yǎng)化指標關(guān)系密切。研究堿性磷酸酶活性可以更好地了解營養(yǎng)鹽的狀態(tài)以及營養(yǎng)鹽對生產(chǎn)力的調(diào)控機制，對揭示營養(yǎng)鹽的內(nèi)循環(huán)機制具有重要意義。Zhu等[11]利用酶水解法分析了滇池表層沉積物有機磷形態(tài)及其生物有效性，發(fā)現(xiàn)滇池沉積物中12.1%～27.2%的有機磷能夠被堿性磷酸酶水解，具有潛在的生物可利用性。

沉積物中有機磷的濃度和組成與流域內(nèi)自然背景和人類活動的影響息息相關(guān)。對富營養(yǎng)化水體來講，人類活動是水體磷濃度主要的影響因素，進而間接地影響沉積物中有機磷的生物可利用性。工業(yè)廢水和生活污水經(jīng)過生物處理后出水中包含很多難降解的有機磷化合物，農(nóng)業(yè)徑流產(chǎn)生的有機磷主要來自土壤中腐殖質(zhì)類含磷化合物，不同來源的有機磷生物可利用性存在較大差異，以富營養(yǎng)化湖泊巢湖為研究對象，通過研究不同區(qū)域沉積物剖面不同形態(tài)有機磷濃度及堿性磷酸酶活性的分布特征，探討有機磷和堿性磷酸酶的空間分布規(guī)律，通過研究堿性磷酸酶對沉積物剖面有機磷的水解效果，明確不同形態(tài)有機磷的生物可利用性，以期為湖泊沉積物磷污染控制提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 研究區(qū)概況

研究區(qū)位于安徽省巢湖，水域面積為560～825 km2，平均水深為2.89 m。受來自合肥市生活污水和工業(yè)廢水排放及流域周圍農(nóng)業(yè)面源排放的影響，巢湖屬典型的富營養(yǎng)化湖泊[12]。自1962年巢湖建閘以來，湖體的流動性變差，大量營養(yǎng)物沉積到湖底，造成沉積物中營養(yǎng)水平逐年升高。巢湖沉積物中TN、TP平均濃度分別為1 794.00和651.00 mg/kg，處于中度-重度污染水平。西半湖區(qū)主要接納來自合肥市的生活污水和工業(yè)廢水，其中氮、磷等污染物的負荷較大，有機磷以難降解的有機磷化合物為主；東半湖區(qū)的污染物主要來源于周邊農(nóng)業(yè)面源的徑流輸入，有機磷主要來自降雨徑流導(dǎo)致土壤中腐殖質(zhì)類含磷有機物的流失，相比于西半湖區(qū)其污染物的輸入負荷較小，沉積物中TN、TP濃度也較低[13]。分別在污染較重的西半湖區(qū)和污染相對較輕的東半湖區(qū)選取C4和C14 2個采樣點(圖1)，研究在污染程度不同的區(qū)域內(nèi)有機磷的剖面分布特征及生物可利用性差異。

圖1 巢湖沉積物采樣點分布Fig.1 Sampling stations in Lake Chaohu sediments

1.2 樣品采集與預(yù)處理

采用手推式柱狀采樣器分別在C4和C14采樣點處采集沉積物柱狀樣品，將采集的樣品用虹吸法吸取上覆水后，利用上頂法在現(xiàn)場按1 cm間隔對樣品進行分層，裝入聚乙烯自封袋中密封，放入保溫箱中迅速帶回實驗室冷凍保存。將凍實的樣品在FD-1A-50型冷凍干燥機中進行冷凍干燥處理。冷凍干燥后的樣品需剔除動植物殘體及石塊，研磨過100目篩，密封后冷藏保存，待分析。

1.3 樣品處理與分析

1.3.1堿性磷酸酶活性的測定

無色底物對硝基苯磷酸二鈉(p-NPP)在堿性環(huán)境下，經(jīng)沉積物中的堿性磷酸酶定量催化水解后，產(chǎn)生穩(wěn)定的黃色末端產(chǎn)物——對硝基苯酚(pNP)，可在波長420 nm下測定其吸光度[14]。

稱取0.5 g沉積物于150 mL錐形瓶中，加入pH為8.4的Tris-HCl緩沖液，混合均勻后，加入3 mL濃度為2 mmol/L的pNP，在37 ℃恒溫條件下振蕩6 h，加入2 mL 3 mol/L的NaOH溶液終止反應(yīng)。在6 000 r/min的轉(zhuǎn)速下離心15 min，取上清液，在420 nm波長下測定其吸光度。堿性磷酸酶活性以每克沉積物生成的pNP的量來表示[15-16]。

1.3.2有機磷的分級提取

沉積物中各形態(tài)有機磷濃度采用Ivanoff連續(xù)提取法[17]測定。提取流程包括：1)稱取0.5 g沉積物，加入25 mL 0.5 mol/L NaHCO3提取16 h后，上清液為NaHCO3提取態(tài)有機磷(NaHCO3-Po)；2)將步驟1)殘渣用去離子水洗凈后，用25 mL 1.0 mol/L HCl提取3 h，上清液為HCl提取態(tài)有機磷(HCl-Po)；3)將步驟2)殘渣用去離子水洗凈后，用25 mL 0.5 mol/L NaOH提取16 h，上清液為NaOH提取態(tài)有機磷(NaOH-Po)，再加入濃HCl至pH為2，沉淀后上清液為富里酸結(jié)合態(tài)有機磷(富里酸-Po)，NaOH-Po與富里酸-Po的差值為胡敏酸結(jié)合態(tài)有機磷(胡敏酸-Po)；4)將步驟3)殘渣用去離子水洗凈、烘干后，550 ℃下灰化1 h，再用25 mL 1.0 mol/L H2SO4振蕩提取24 h，上清液為殘渣態(tài)有機磷(殘渣態(tài)-Po)(圖2)。各形態(tài)有機磷濃度用TP濃度減去無機磷濃度獲得，TP濃度采用過硫酸鉀消解-鉬銻抗分光光度法測定，無機磷濃度采用鉬銻抗分光光度法測定。

圖2 巢湖沉積物中有機磷提取流程Fig.2 Flow chart of organic phosphorus fractionation in Lake Chaohu sediments

1.3.3堿性磷酸酶水解有機磷

堿性磷酸酶(APase，活性為10 U/mg)購于Sigma公司，用pH為9.0的Tris-HCl緩沖溶液配置成活性為1 U/mL的堿性磷酸酶水解酶溶液。取5 mL分級提取有機磷的上清液于離心管中，先加入1 mL Tris-HCl緩沖溶液(緩沖溶液中含有0.002 mol/L的MgCl2用于激活堿性磷酸酶)，調(diào)節(jié)上清液的pH為9.0，再加入0.44 mL堿性磷酸酶水解酶，在37 ℃下恒溫振蕩16 h，冷卻至室溫，采用鉬銻抗分光光度法測定TP、無機磷濃度，計算水解后的有機磷濃度。

2 結(jié)果與討論

2.1 不同形態(tài)有機磷的剖面分布特征

C4采樣點的TP濃度為340.17～743.10 mg/kg，均值為548.09 mg/kg，略高于C14采樣點(328.68～633.80 mg/kg，均值為454.29 mg/kg)，這與昝逢宇等[18]的研究結(jié)果相吻合。根據(jù)2005—2014年巢湖水質(zhì)檢測結(jié)果[19]可知，在監(jiān)測期間西半湖區(qū)水體的TP濃度始終高于東半湖區(qū)；昝逢宇等[18]的研究表明，2000—2006年巢湖西半湖區(qū)水體TP濃度均值高于東半湖區(qū)，并且西半湖區(qū)沉積物中TP濃度也高于東半湖區(qū)，與近年來巢湖水質(zhì)變化趨勢相一致，但是沉積物中有機磷濃度呈現(xiàn)出與TP濃度相反的變化趨勢。C4和C14采樣點沉積物中不同形態(tài)有機磷濃度的剖面分布特征分別如圖3和圖4所示。從圖3(a)和圖4(a)可以看出，C4和C14采樣點總有機磷的濃度分別為40.56～123.10和23.04～277.70 mg/kg，均值分別為87.47和124.45 mg/kg，C4采樣點略低于C14采樣點。李強等[20]對巢湖16個點位表層沉積物中有機磷的空間分布進行了研究，結(jié)果表明巢湖東半湖區(qū)7個點位表層(0～15 cm)沉積物中有機磷濃度整體上高于西半湖區(qū)9個點位，與本研究結(jié)果一致。這是由于東、西半湖區(qū)主要污染物來源不同，位于西半湖區(qū)的C4采樣點污染物主要來源于合肥市的生活污水和工業(yè)廢水，無機磷在沉積物中占比較高，相應(yīng)的有機磷占比較低，而東半湖區(qū)的C14采樣點的污染物來源主要是周邊的農(nóng)業(yè)面源污染。昝逢宇等[18,21]的研究表明，對于富營養(yǎng)化水體，以工業(yè)廢水和生活污水為主要污染源的沉積物中有機磷濃度低于以農(nóng)業(yè)面源污染為主要污染源的沉積物。隨著沉積物深度的增加，有機磷濃度逐漸降低，這與湯寶靖等[22]的研究結(jié)果相一致。

圖3 C4采樣點沉積物各形態(tài)有機磷剖面分布特征Fig.3 Profile characteristics of various forms of organic phosphorus in sediments at C4 station

圖4 C14采樣點沉積物各形態(tài)有機磷剖面分布特征Fig.4 Profile characteristics of various forms of organic phosphorus in sediments at C14 station

由圖3(b)和圖4(b)可見，C4和C14采樣點NaHCO3-Po濃度分別為1.19～17.79和1.67～16.87 mg/kg，均值分別為9.08和7.41 mg/kg，占總有機磷的比例分別為11.05%和6.12%。NaHCO3-Po為活性磷，主要成分包括核酸、磷脂類和磷酸糖類化合物[23-24]，C4采樣點NaHCO3-Po濃度均高于C14采樣點，說明西半湖區(qū)沉積物活性磷的濃度更高。隨著沉積物深度的增加，NaHCO3-Po濃度逐漸下降，最終趨于穩(wěn)定，說明人類活動產(chǎn)生的污染物是沉積物中NaHCO3-Po的主要來源。

由圖3(c)和圖4(c)可見，C4和C14采樣點HCl-Po濃度分別為1.65～23.30和1.38～39.24 mg/kg，均值分別為10.68和14.47 mg/kg，占總有機磷的比例分別為12.82%和19.00%。HCl-Po為中活性磷，主要成分包括磷酸酯、磷脂、核酸、磷蛋白和磷酸糖類[23-24]，屬沉積物早期成巖過程中較穩(wěn)定的磷形態(tài)，很難被分解為無機磷被生物所利用。C14采樣點HCl-Po濃度顯著高于C4采樣點，說明東半湖區(qū)沉積物中活性磷的濃度更高。HCl-Po的剖面變化趨勢與NaHCO3-Po相反，反映了HCl-Po在深層沉積物中的累積。

由圖3(d)和圖4(d)可見，C4和C14采樣點NaOH-Po濃度很高，均值分別為33.91和42.66mg/kg，占總有機磷的比例分別為41.70%和43.75%。2個采樣點NaOH-Po濃度均高于NaHCO3-Po和HCl-Po。NaOH-Po和NaHCO3-Po濃度的剖面變化趨勢相一致，即在0～15 cm處NaOH-Po濃度隨著沉積物深度的增加逐漸下降，在15～30 cm處NaOH-Po濃度保持穩(wěn)定。NaOH-Po主要成分為肌醇五磷酸和肌醇六磷酸[23-24]，包含富里酸-Po和胡敏酸-Po。由圖3(e)和圖4(e)可見，C4和C14采樣點富里酸-Po濃度較高，均值分別為27.71和24.61 mg/kg，占NaOH-Po的比例分別為80.48%和59.58%；而胡敏酸-Po濃度較低，均值分別為6.19和17.02 mg/kg，占NaOH-Po的比例分別為19.52%和40.42%。胡敏酸-Po濃度在沉積物剖面上基本保持不變，而富里酸-Po濃度的沉積物剖面變化趨勢與NaOH-Po相一致。富里酸-Po和HCl-Po同屬于中活性磷，活性僅次于NaHCO3-Po，而胡敏酸-Po的活性較低，屬于非活性磷。殘渣態(tài)-Po也屬于非活性磷的一部分，其主要成分為植酸態(tài)磷[22-23]。由圖3(f)和圖4(f)可見，C4和C14采樣點殘渣態(tài)-Po濃度均值分別為1.75和3.10 mg/kg，占總有機磷的比例最低，分別為2.22%和4.22%。隨著沉積時間的延長，各形態(tài)有機磷之間可以在一定的環(huán)境條件下相互轉(zhuǎn)化[25]，這一過程中厭氧微生物的代謝和酶分解活動發(fā)揮了重要作用。

2.2 堿性磷酸酶活性的剖面分布特征

巢湖沉積物堿性磷酸酶活性的剖面分布特征如圖5所示。從圖5可以看出，C4和C14采樣點表層(0～15 cm)沉積物堿性磷酸酶的活性均高于下層(15～30 cm)沉積物，說明表層豐富的微生物活動和人類活動產(chǎn)生的有機物是表層沉積物堿性磷酸酶活性偏高的主要原因。由于人類活動排放的大量污染物進入湖體并沉積在底泥中，使得表層沉積物的營養(yǎng)物質(zhì)比較豐富，氧氣供給也比下層沉積物充足，形成了有利于微生物生長的環(huán)境，堿性磷酸酶的活性較高；隨著沉積物深度的增加，營養(yǎng)物質(zhì)和溶解氧濃度不斷減少，微生物的生命活動減弱，相應(yīng)地堿性磷酸酶的活性減小[26]。整體上C4采樣點表層沉積物的堿性磷酸酶活性要高于C14采樣點，主要原因是西半湖區(qū)接納了大量來自合肥市的生活污水和工業(yè)廢水，沉積物中微生物的活性較高[19-20]，其分泌的堿性磷酸酶也較多。巢湖沉積物堿性磷酸酶的活性為0.011～0.043 mmol/(h·g)，高于駱馬湖〔0.000 3～0.004 2 mmol/(h·g)〕[27]，低于太湖〔0.06～0.36 mmol/(h·g)〕[26]。

Person指數(shù)相關(guān)性分析表明，C4和C14采樣點沉積物中堿性磷酸酶的活性與沉積物中TP濃度成正比(相關(guān)系數(shù)分別為0.974和0.872)，這與Zhou等[28]的研究結(jié)果相一致。因為堿性磷酸酶是一種誘導(dǎo)酶，當沉積物中無機磷濃度較低，有機磷濃度相對較高時，會激發(fā)堿性磷酸酶活性的增加[26]，導(dǎo)致堿性磷酸酶對有機磷的水解，進而產(chǎn)生大量的無機磷進入水體中，即使在外源磷輸入得到控制的情況下，沉積物中有機磷仍能夠間接地被水體中微生物所利用，從而增加水體的富營養(yǎng)化水平[28]。

2.3 堿性磷酸酶水解不同形態(tài)有機磷剖面分布特征

堿性磷酸酶水解不同形態(tài)有機磷剖面分布特征如圖6所示。從圖6可以看出，C4和C14采樣點的NaHCO3-Po被堿性磷酸酶水解的比例分別為50.23%～97.72%和59.53%～98.10%，平均為65.78%和69.47%；HCl-Po被堿性磷酸酶水解的比例分別為54.70%～99.13%和41.71%～89.67%，平均為70.53%和54.84%；NaOH-Po被堿性磷酸酶水解的比例分別為42.71%～99.30%和43.23%～73.93%，平均為57.87%和53.48%。整體上堿性磷酸酶對NaHCO3-Po的水解程度高于HCl-Po，NaOH-Po被水解的比例最小。因為NaHCO3-Po是活性磷，其在沉積物中的結(jié)構(gòu)較松散且活性較高，因而容易被堿性磷酸酶水解。而HCl-Po屬于中活性磷，主要由易分解的生物大分子組成，在一定條件下也可以被分解，但其活性低于NaHCO3-Po，相應(yīng)的可被堿性磷酸酶水解的程度也比NaHCO3-Po低一些。NaOH-Po包括中活性磷(富里酸-Po)和非活性磷(胡敏酸-Po)，其中非活性磷的穩(wěn)定性較高，不易被堿性磷酸酶水解，因此堿性磷酸酶對NaOH-Po的水解程度相對較低[29]。

圖6 堿性磷酸酶水解不同形態(tài)有機磷剖面分布特征Fig.6 Profile characteristics of different forms of organic phosphorus by APase hydrolysis

總體來說，C4采樣點堿性磷酸酶對NaHCO3-Po、HCl-Po、NaOH-Po的水解比例高于C14采樣點，這可能與C4采樣點堿性磷酸酶的活性高于C14采樣點有關(guān)，而且C4、C14采樣點表層沉積物中各形態(tài)有機磷的水解比例均高于下層沉積物，這與沉積物中堿性磷酸酶活性表層高于下層相對應(yīng)。通常認為，可被堿性磷酸酶水解的有機磷是有活性的，這可能導(dǎo)致不同區(qū)域生物可利用有機磷的累積速率和降解速率存在差異[11]。酶水解作用可以用來估算湖泊沉積物中的生物可利用磷濃度，大部分有機磷在被浮游植物或其他生物體吸收利用之前會被水解成生物可利用磷[30]。因此，NaHCO3-Po、HCl-Po、NaOH-Po中可被堿性磷酸酶水解的部分是水體中生物可利用磷的潛在來源。C4和C14采樣點堿性磷酸酶對NaHCO3-Po的水解比例高于HCl-Po、NaOH-Po，說明沉積物中NaHCO3-Po的生物可利用性較高。與富營養(yǎng)化相關(guān)的藻類等生物的繁殖是驅(qū)動營養(yǎng)物質(zhì)(如磷素)循環(huán)的重要因素[31]，巢湖西半湖區(qū)富營養(yǎng)化程度較高，藻類生物量和葉綠素a濃度均高于東半湖區(qū)，因而C4采樣點NaHCO3-Po的生物可利用性較高。

3 結(jié)論

(1)巢湖西半湖區(qū)沉積物的堿性磷酸酶活性整體上高于東半湖區(qū)，隨著沉積物深度的增加堿性磷酸酶活性逐漸下降，在下層(15～30 cm)沉積物中趨于穩(wěn)定。

(2)巢湖表層(0～15 cm)沉積物中NaHCO3-Po和HCl-Po濃度均高于下層(15～30 cm)沉積物，NaOH-Po濃度的剖面變化呈相反的趨勢，殘渣態(tài)-Po濃度剖面變化相對穩(wěn)定。除NaHCO3-Po外，C14采樣點沉積物的HCl-Po、NaOH-Po、殘渣態(tài)-Po濃度均高于C4采樣點。不同形態(tài)有機磷濃度為NaOH-Po>HCl-Po>NaHCO3-Po>殘渣態(tài)-Po。

(3)西半湖區(qū)沉積物有機磷的生物可利用性較高，堿性磷酸酶對NaHCO3-Po、HCl-Po、NaOH-Po的水解比例整體上高于東半湖區(qū)，堿性磷酸酶對不同形態(tài)有機磷的水解比例基本上呈NaHCO3-Po>HCl-Po>NaOH-Po，NaHCO3-Po的生物可利用性較高。