張珍珍，李 倩，董 榮，喬 丹，閆 雪，張 軻

（新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與藥學(xué)學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830052）

花色苷類是葡萄與葡萄酒中一類重要的酚類化合物，它是賦予葡萄與葡萄酒顏色的主要物質(zhì)[1]?；ㄉ帐且环N存在于所有植物中的水溶性色素，單體花色苷極不穩(wěn)定，很容易被外界環(huán)境影響而分解，且花色苷的組成及含量會受到環(huán)境的影響，比如光照、溫度以及水分等[2]?；ㄉ刈鳛樘擒张浠蛞阴；奶擒张浠c糖相結(jié)合生成花色苷，主要有甲基化、?；约疤腔龋@些修飾組分對花色苷的穩(wěn)定性有極為重要的影響[3-4]。經(jīng)過?；揎椀幕ㄉ詹粌H可以促進花色苷顏色的穩(wěn)定，還可加深葡萄酒的顏色[5-6]。紅色釀酒葡萄果實中主要有五大類花色苷，分別為花青素、花翠素、甲基花青素、甲基花翠素以及二甲花翠素[7]。

新疆葡萄酒存在的普遍問題是顏色不穩(wěn)定，而花色苷是葡萄酒及果實的主要呈色物質(zhì)。漿果的花色苷不僅受到其基因型的影響，光照、氣候、栽培條件也是主要因素[8-11]。研究發(fā)現(xiàn)，光照條件會直接影響花色苷的合成，并且光照強度是影響葡萄果實著色的重要原因之一[12-13]。目前主要通過遮光盒、摘葉、鋪反光膜等措施研究顏色的變化[14-15]。有研究表明，遮陽網(wǎng)應(yīng)用于鮮食葡萄栽培中可調(diào)節(jié)葡萄成熟期，而且影響果實大小、糖酸等[16-17]。其中遮光處理對葡萄果實中的單寧影響最大，其次為總花色苷；也有通過遮光網(wǎng)對葡萄果實進行處理，得出此類處理方法可以有效延長采收期，并且提高總酚、總單寧含量；同時遮光會影響果實成熟期的光合作用，進而影響果實糖類代謝中相關(guān)酶基因的表達[18-20]。新疆晝夜溫差大，光照時間長且光照強，光照會影響果實中花色苷的合成，目前探究‘赤霞珠’果實中花色苷在累積過程中不同生長時期以及不同遮光率的遮光對其花色苷含量的累積以及組分構(gòu)成改變的研究較少。因此本實驗探究不同光照強度及不同生長時期遮光對葡萄果實花色苷生成及積累的影響，以期為有效提高果皮中穩(wěn)定的花色苷含量及穩(wěn)定的修飾組分并改善西部產(chǎn)區(qū)葡萄酒色澤穩(wěn)定性提供理論依據(jù)。本研究以‘赤霞珠’為試材，分別選取漿果達到開始轉(zhuǎn)色-完全成熟以及100%轉(zhuǎn)色-完全成熟階段，采取不同遮光率的遮陽網(wǎng)對樹體頂端進行遮光處理。利用高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用方法檢測4 個不同遮光處理后對成熟‘赤霞珠’的花色苷組分及含量的影響，通過偏最小二乘-判別分析（partial least squares-discriminant analysis，PLS-DA）法對4 種處理后成熟的葡萄果實中花色苷含量進行差異分析。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

供試葡萄果實采于2017年瑪納斯縣中信國安葡萄酒業(yè)有限公司葡萄種植基地種植的釀酒葡萄‘赤霞珠’。

黑色單層遮陽網(wǎng)，網(wǎng)1：三針加密型；網(wǎng)2：兩針普通型。遮陽網(wǎng)的規(guī)格為1.5 mh45 m。設(shè)置5 種處理：CK為正常生長，不遮光；Q1為開始轉(zhuǎn)色-完全成熟期間采用網(wǎng)1對樹體頂端進行遮光（7月27日—9月16日）；Q2為開始轉(zhuǎn)色-完全成熟期間采用網(wǎng)2對樹體頂端進行遮光（7月27日—9月16日）；H1為100%轉(zhuǎn)色-完全成熟期間采用網(wǎng)1對樹體頂端進行遮光（8月7日—9月12日）；H2為100%轉(zhuǎn)色-完全成熟期間采用網(wǎng)2對樹體頂端進行遮光（8月7日—9月12日）；4 種處理均為單一實驗。每個處理均有3 個生物學(xué)平行。

甲醇、乙腈、甲酸和乙酸（均為色譜純） 美國Fisher公司；乙酸乙酯（分析純） 北京化學(xué)試劑公司；純凈水 杭州娃哈哈公司；二甲花翠素-3-O-葡萄糖苷標準品 法國Extrasynthese公司；去離子水由Milli-Q（Molopore, Bedford, MA）系統(tǒng)制備。

1.2 儀器與設(shè)備

HZS-H型水浴振蕩器 武漢愛斯佩科學(xué)儀器有限公司；RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 上海亞榮生化儀器廠；FD-1D-50冷凍干燥機 北京四環(huán)科學(xué)儀器廠；LC/MSD離子阱液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀 美國Agilent公司；HOBO H21-002小型氣象站（探頭為S-LIA-M003和S-THB-M002） 美國Onset Corporation公司；PAL-2手持式糖度計 日本ATAGO公司；便攜式pH計 瑞士Metler Toledo公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品采集

本實驗檢測的樣品為所有葡萄果實糖度達到26.00 °Brix左右，所摘果實均果粒飽滿，大小均勻，采摘時兼顧陰面與陽面，每穗果實的頂、中、尾部均兼顧。隨機選擇果實300 顆，采回實驗室用液氮迅速冷凍，將樣品置于-80 ℃保存，用于其他檢測。空白對照的樣品采摘于9月12日；開始轉(zhuǎn)色-完全成熟的遮光處理中，樣品采摘日期為9月16日；100%轉(zhuǎn)色-完全成熟的處理中，所摘樣品日期為9月12日。由此可看出，在開始轉(zhuǎn)色-完全成熟期間進行遮光處理，在生長時期上明顯延緩了果實成熟4～5 d。

1.3.2 氣象數(shù)據(jù)收集

監(jiān)測網(wǎng)1、網(wǎng)2的遮光處理與對照之間的果際微氣候差異。收集數(shù)據(jù)包括大氣溫度、相對濕度、太陽總輻射和光合有效輻射，每5 min進行一次數(shù)據(jù)采集。

1.3.3 理化指標檢測

可溶性固形物、可滴定酸含量以及pH值在運回實驗室后立即測定。從每組新鮮果實樣品中隨機取出50 粒，采用組織搗碎機勻漿，采取手持式糖度計測定可溶性固形物定，可滴定酸含量以酸堿滴定法（以酒石酸計）測量，每個樣品做2 組技術(shù)平行。采用便攜式pH計檢測果實中的pH值。

1.3.4 葡萄皮花色苷定性定量分析檢測

花色苷的提?。簠⒖紡堈湔涞萚21]的方法。

花色苷的定量與定性：建立5～500 mg/L之間、9 個水平、3 個重復(fù)的二甲花翠素-3-O-葡萄糖苷標準曲線，相關(guān)系數(shù)應(yīng)在0.999以上，作二甲花翠素-3-O-葡萄糖苷的外標定量，其他花色苷以相當(dāng)于二甲花翠素-3-葡萄糖苷含量計。

花色苷定性工作基于中國農(nóng)業(yè)大學(xué)葡萄酒研究中心建立的“葡萄與葡萄酒花色苷HPLC-UV-MS/MS指紋譜庫”的基礎(chǔ)上，結(jié)合文獻報道，通過對樣品圖譜中質(zhì)譜信息、光譜信息和保留時間與譜庫及文獻報道比對分析從而確定各樣品中各花色苷的種類與結(jié)構(gòu)[22]。

花色苷通過標準曲線計算后，再轉(zhuǎn)化單位為mg/g。

參考楊曉慧等[23]的方法，采用高效液相色譜-質(zhì)譜檢測酚類物質(zhì)。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Microsoft Excel 2003軟件進行數(shù)據(jù)計算。利用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行顯著性差異分析，通過Origin Pro 8.5進行繪圖。PLS-DA通過代謝組學(xué)數(shù)據(jù)分析網(wǎng)站http://www.metaboanalyst.ca/完成。

2 結(jié)果與分析

2.1 遮光處理對果際微氣候的影響

圖1 樹體遮光對果際微氣候的影響Fig. 1 Effects of shading treatment on inter-regional microclimate

如圖1所示，葡萄果穗周邊光合有效輻射和太陽總輻射與CK相比明顯降低，網(wǎng)1使果穗附近接受光合有效輻射的量降低了50%左右，網(wǎng)2使果穗附近接受光合有效輻射的量降低了20%左右。遮光處理在有效減弱光照的同時并沒有明顯改變果際周圍的溫度和相對濕度。由此說明，本實驗中的遮光處理主要減弱了果際的光照條件，且其他生理環(huán)境狀態(tài)對果實無影響。

2.2 遮光處理對成熟時‘赤霞珠’果實中可滴定酸含量、pH值的影響

表1 遮光處理對果實中可滴定酸、pH值的影響Table 1 Effect of different shading treatments on titratable acid and pH in grapes

由表1可看出，采用不同時期、不同遮光率的遮陽網(wǎng)對樹體遮光，當(dāng)果實均達到同一糖度時，可滴定酸含量與對照無明顯差異，而不同遮光強度、不同時期遮光對果實中的pH值均無明顯影響。

2.3 遮光處理對成熟時‘赤霞珠’果實中花色苷含量的影響

圖2 正常生長果皮色譜鑒定Fig. 2 Chromatographic identification of anthocyanins in grape peels under normal growth conditions

圖3 遮光處理后葡萄果皮中花色苷總量Fig. 3 Total amounts of anthocyanins in grape skins with different shading treatments

如圖2所示，開始轉(zhuǎn)色-完全成熟采用20%遮光（Q2）的遮陽網(wǎng)處理的樣品中檢測到15 種花色苷，而其余4 種處理檢測到14 種花色苷，未檢測到3’-甲基花青素香豆?；咸烟擒眨樖?反式）。由圖3可知，CK果實中其果皮花色苷含量為12.544 mg/g。而經(jīng)過遮光處理后，果皮中的花色苷含量均高于CK，開始轉(zhuǎn)色-完全成熟時期以及100%轉(zhuǎn)色-完全成熟時期采用網(wǎng)2遮光使果皮中花色苷含量呈顯著增加（P＜0.05），而100%轉(zhuǎn)色-完全成熟期間采用網(wǎng)1遮光后，其花色苷總量為15.858 mg/g，高于CK26.43%，呈極顯著增加（P＜0.01）。說明適當(dāng)?shù)恼诠饩梢蕴岣呋ㄉ蘸?，?00%轉(zhuǎn)色-完全成熟期間采用50%遮光的遮陽網(wǎng)進行樹體遮光對果皮中花色苷的累積有更為顯著的效果。

2.4 遮光處理對成熟時‘赤霞珠’果實中甲基化和未甲基化花色苷的比較

圖4 遮光處理后對葡萄果皮中甲基化、未甲基化花色苷含量的影響Fig. 4 Effect of different shading treatments on methylation and unmethylated anthocyanin contents in grape skins

如圖4所示，甲基化花色苷仍為主要花色苷。遮光處理后果皮中甲基化花色苷含量均高于CK。未經(jīng)光處理的樣品中，其甲基化花色苷含量為11.640 mg/g。Q2、H2處理后，檢測到果皮中甲基化花色苷含量分別為12.590 mg/g和12.536 mg/g，均呈顯著性增加（P＜0.05）。H1處理后檢測到采收期時果實的甲基化花色苷含量為13.850 mg/g，相比CK增加了25.29%，呈極顯著差異（P＜0.01）。綜上所述，適當(dāng)?shù)恼诠饩鶗黾庸ぶ屑谆ㄉ蘸浚_始轉(zhuǎn)色-完全成熟、100%轉(zhuǎn)色-完全成熟期間采用20%遮光的遮陽網(wǎng)以及100%轉(zhuǎn)色-完全成熟期間采用50%遮光的遮陽網(wǎng)均能使果皮中積累更多的甲基化花色苷。

2.5 遮光處理對‘赤霞珠’果實中不同修飾組分的影響

圖5 遮光處理對不同結(jié)構(gòu)修飾組分的影響Fig. 5 Effect of different shading treatments on the content of anthocyanins with different structural modifiers

采取不同遮光處理對不同修飾組分花色苷的累積的影響均有明顯效果。如圖5所示，這3 種修飾方式的花色苷含量大小為未酰化修飾花色苷＞乙?；揎椈ㄉ眨鞠愣辊；揎椈ㄉ?。

乙?；揎椈ㄉ蘸恳惨蛘陉柧W(wǎng)的遮光率及遮光時間的不同而有差異性。CK樣品中乙酰化修飾花色苷含量為4.378 mg/g，遮光處理后樣品中乙酰化修飾花色苷含量均高于CK。Q2處理后其乙?；ㄉ蘸繛?.971 mg/g，呈顯著性增加（P＜0.05）。而H1、H2處理后其乙?；揎椈ㄉ蘸糠謩e為5.768 mg/g和5.235 mg/g，相比CK分別增加了31.74%、19.57%，均呈極顯著差異（P＜0.01）。說明本實驗中100%轉(zhuǎn)色-完全成熟期間的遮光處理能使果實中積累更多的乙?；揎椈ㄉ?。CK中的香豆?；揎椈ㄉ蘸繛?.883 mg/g，遮光樣品中其香豆?；揎椈ㄉ蘸扛哂贑K，Q2與CK相比該修飾組分增加了33.64%，呈顯著增加（P＜0.05）。這也說明開始轉(zhuǎn)色-完全成熟期間的遮光使香豆?；揎椈ㄉ绽鄯e更明顯，綜合來看，在開始轉(zhuǎn)色-完全成熟期間采用20%遮光的遮陽網(wǎng)以及100%轉(zhuǎn)色-完全成熟期間遮光能使果實中積累更多的?；揎椀幕ㄉ?，這對提高光照時間長、氣候炎熱地區(qū)的葡萄酒顏色的穩(wěn)定性具有重要意義。

2.6 遮光處理對成熟時果實中花色苷組分構(gòu)成的影響

圖6 PLS-DA不同遮光處理對花色苷組分的影響Fig. 6 PLS-DA analysis of the effect of different shading treatments on anthocyanin components

為更直觀表明不同遮光處理對果實到達成熟時之間花色苷含量及組分之間的差異，進行PLS-DA。由圖6A可知，CK處理與其他遮光處理明顯分開，說明遮光方式以及遮光時間的不同對各類花色苷的含量和組分構(gòu)成均有影響。且100%轉(zhuǎn)色后-完全成熟對果實進行遮光處理均在X軸負半軸，開始轉(zhuǎn)色時對果實進行遮光處理均分布在X軸正半軸。說明不同時期的遮光處理有效改變了花色苷的組成成分。圖6B表明，經(jīng)過不同遮光處理后，以下7 種物質(zhì)對改變花色苷組分的貢獻率較大（貢獻值＞1）。分別為3’-甲基花青素乙?；咸烟擒?、花青素香豆?；咸烟擒眨樖?反式）、二甲花翠素香豆?；咸烟擒眨樖?反式）、花青素葡萄糖苷、花翠素香豆?；咸烟擒眨樖?反式）、3’-甲基花青素葡萄糖苷、花青素乙酰化葡萄糖苷。

表2 遮光處理后有較大貢獻率物質(zhì)占花色苷比例Table 2 Proportions of anthocyanins with higher contribution rate in grape skins with different shading treatments%

由表2可知，開始轉(zhuǎn)色-完全成熟期間進行遮光處理（Q1、Q2），均增加了花青素乙酰化葡萄糖苷、花青素葡萄糖苷、花青素香豆?；咸烟擒眨樖?反式）、二甲花翠素香豆?；咸烟擒眨樖?反式）、3’-甲基花青素乙酰化葡萄糖苷、3’-甲基花青素葡萄糖苷含量，且在此期間，采用50%遮光的遮陽網(wǎng)為實驗材料，使樣品中的花青素乙酰化葡萄糖苷、花青素葡萄糖苷、3’-甲基花青素乙?；咸烟擒彰黠@增加；采用20%遮光的遮陽網(wǎng)進行遮光，使花青素香豆?；咸烟擒眨樖?反式）、3’-甲基花青素乙?；咸烟擒账伎偦ㄉ盏谋壤cCK相比呈極顯著增加（P＜0.01）。當(dāng)果實處于100%轉(zhuǎn)色-完全成熟期間，均降低了花青素葡萄糖苷、花翠素香豆酰化葡萄糖苷（順式+反式）、3’-甲基花青素葡萄糖苷所占總花色苷的比例?？偟膩碚f，本實驗中4 種遮光處理均使花翠素香豆?；咸烟擒眨樖?反式）含量顯著降低。開始轉(zhuǎn)色-完全成熟期間主要增加了3’-甲基花青素乙?；咸烟擒账伎偦ㄉ盏谋壤?，100%轉(zhuǎn)色-完全成熟期間花青素葡萄糖苷、3’-甲基花青素葡萄糖苷所占總花色苷的比例顯著低于CK。

3 討論與結(jié)論

采用黑色遮陽網(wǎng)能有效改善田間氣候，降低光照強度[24]。由本實驗微氣候數(shù)據(jù)可以得出，遮光主要改變果際光照強度，而對果際周圍溫度和濕度幾乎無影響，原因是在實驗中采用單層黑色遮陽網(wǎng)，能有效減少正午時刻的光照直射。本實驗中，通過不同時期遮光、不同遮光率的遮陽網(wǎng)對果實的pH值、總酸無明顯影響，通過對實驗樣品進行理化數(shù)據(jù)檢測，可以看出在開始轉(zhuǎn)色-完全成熟期間的遮光處理明顯延緩了‘赤霞珠’果實的生長期4～5 d。

研究發(fā)現(xiàn)遮光處理對花色苷的累積并無明顯影響，而另有研究報道高強度的光照導(dǎo)致花色苷含量降低[25-26]。有研究表明，花色苷濃度會隨光照的增加而增加[27-28]，本實驗中，開始轉(zhuǎn)色-完全成熟期間采用遮光率為50%的遮陽網(wǎng)處理后使樣品中的花色苷含量低于遮光率為20%遮陽網(wǎng)處理的樣品，這與黃敬寒等[28]的研究結(jié)果相同。但光照對于花色苷的影響并不相同，100%轉(zhuǎn)色-完全成熟期間的遮光中，遮光程度越強，花色苷的累積量越高，這是由于遮光時期也是影響花色苷累積的影響因素之一[8]。

有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過遮光處理后，果皮中的花色苷含量并無明顯變化但果實中花色苷組分卻會發(fā)生改變，其中花翠素、甲基花翠素和二甲花翠素衍生物的比例會下降，而花青素和甲基花青素衍生物的比例會增加[29-32]，由于實驗品種、地點甚至采樣方式的不同，都會導(dǎo)致這些現(xiàn)象出現(xiàn)[33]。

本實驗中，遮光處理顯著提高了果皮中花色苷的總量，均顯著高于對照，開始轉(zhuǎn)色-完全成熟期間的遮光網(wǎng)1有效增加了花青素葡萄糖苷及花青素乙酰化葡萄糖苷含量，但是100%轉(zhuǎn)色-完全成熟期間的遮光則顯著減少了這2 種單體花色苷含量。成熟期遮光可促進果皮中花色苷的甲基化和?；揎椀睦鄯e，且不同時期的遮光對花色苷的累積及構(gòu)成組分的影響有不同效果[15]。遮光均促進了甲基化花色苷及酰化修飾花色苷的累積，但是遮光率的不同也會導(dǎo)致花色苷的累積效果也不一致[18]。

本實驗中，在不同時期采用2 種遮光率的遮陽網(wǎng)進行樹體頂端遮光，在開始轉(zhuǎn)色-完全成熟期間，樣品中的花青素以及花青素衍生物的比例增加，但是在100%轉(zhuǎn)色-完全成熟期間遮光，樣品中花青素以及花青素衍生物的比例均低于CK，且50%遮光的遮陽網(wǎng)處理后其花青素以及花青素衍生物均受到明顯抑制。4 種遮光處理均使花翠素香豆?；咸烟擒眨樖?反式）占總花色苷的比例顯著降低。開始轉(zhuǎn)色-完全成熟期間主要增加了3’-甲基花青素乙?；咸烟擒账伎偦ㄉ盏谋壤?，100%轉(zhuǎn)色-完全成熟期間花青素葡萄糖苷、3’-甲基花青素葡萄糖苷所占總花色苷的比例顯著低于CK。

綜上所述，在恰當(dāng)?shù)纳L時期選取合適的遮光方式使葡萄果皮積累更多的花色苷，改變花色苷中修飾組分的比例并有效提高果皮中穩(wěn)定花色苷含量，提高葡萄酒的色澤穩(wěn)定性，進而為提高西部產(chǎn)區(qū)葡萄酒的色澤品質(zhì)提供理論依據(jù)。