馬俊美，孫 磊，曹梅榮，劉 茁，李 強(qiáng),*，范素芳,*

（1.河北省食品檢驗(yàn)研究院，河北 石家莊 050000；2.河北科技大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，河北 石家莊 050018）

大環(huán)內(nèi)酯類抗生素（macrolides antibiotics，MALs）是以大環(huán)內(nèi)酯為母核，與分子糖通過糖苷鍵連接的一類抗生素[1]，一般具有12～16 個(gè)碳內(nèi)酯環(huán)。MALs易溶于極性有機(jī)溶劑，微溶于弱極性溶劑[2-4]，對革蘭氏陽性菌及支原體有較強(qiáng)的抗菌活性，同時(shí)對部分革蘭氏陰性菌、螺旋體和立克次氏體等也有一定的抗菌活性[5-6]，比氨基苷類、多肽類和四環(huán)素類等抗生素的毒副作用低，因此被廣泛應(yīng)用于畜禽疾病的治療[7]。濫用或者使用不當(dāng)，會(huì)導(dǎo)致動(dòng)物源性食物中MALs的殘留，通過食物鏈進(jìn)入人體，在體內(nèi)富集到一定濃度時(shí)，會(huì)使人眩暈、聽力減退、肝腎受損甚至導(dǎo)致慢性中毒[8-10]。為保障食品安全，日本、美國、歐盟等均制定了動(dòng)物源性食品中MALs的最高殘留限量，我國農(nóng)業(yè)部也對此做出了規(guī)定[11]。為滿足監(jiān)管的要求，建立一種快速篩查MALs殘留的分析方法是非常必要的。

目前，MALs的檢測方法主要有：微生物法[12]、毛細(xì)管電泳-電化學(xué)檢測法[13-16]、液相色譜法[17-19]和液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[20-28]等，其中，微生物法特異性差、檢出限高，難以準(zhǔn)確定性定量[29]；液相色譜法是檢測MALs的常用方法，但具有局限性，只能選擇性地檢測某幾種MALs，如紅霉素缺乏特征紫外吸收，較難進(jìn)行分析；超高效液相色譜-四極桿/靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜（ultrahigh performance liquid chromatography-quadrupole/orbitrap high resolution mass spectrometry，UPLC-Q-Orbitrap HRMS）將具有高選擇性的四極桿與高分辨率、高靈敏度的軌道阱有機(jī)結(jié)合，能進(jìn)行目標(biāo)物與非目標(biāo)物的快速篩查與結(jié)果確證[30]，不同于三重四極桿低分辨質(zhì)譜使用多反應(yīng)監(jiān)測模式進(jìn)行定量分析，無需對目標(biāo)物逐個(gè)優(yōu)化子離子及相關(guān)參數(shù)，彌補(bǔ)傳統(tǒng)三重四極桿質(zhì)譜檢測化合物數(shù)量有限、假陽性誤判的不足，在食品檢測行業(yè)中已得到廣泛應(yīng)用。已有研究報(bào)道了UPLC-Q-Orbitrap HRMS應(yīng)用于動(dòng)物源性食品中多肽類[31]、磺胺類、喹諾酮類[32]、青霉素類[33]抗生素的測定，本實(shí)驗(yàn)將該技術(shù)用于豬肉中MALs篩查、鑒定與定量研究。通過一級(jí)全掃描模式獲得目標(biāo)化合物的精確質(zhì)量數(shù)，進(jìn)行定性與定量，通過二級(jí)全掃描模式獲得目標(biāo)化合物的二級(jí)特征圖譜，進(jìn)一步提高定性的準(zhǔn)確性。本研究能夠準(zhǔn)確、高效、快速、高通量地同時(shí)檢測多種MALs物質(zhì)，對保障我國食品安全和提高行業(yè)檢測水平具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

甲醇、乙腈（均為色譜純） 德國Merck公司；甲酸（色譜純） 美國Sigma公司；超純水（電阻率18.2 MΩ·cm，25 ℃） 美國Millipore公司；9 種MALs標(biāo)準(zhǔn)品克拉霉素、麥迪霉素、交沙霉素、紅霉素、阿奇霉素、泰樂霉素、羅紅霉素、替米考星、克林霉素（純度≥95%） 中國食品藥品檢定研究院。

1.2 儀器與設(shè)備

Ultimate 3000UPLC-Q-Orbitrap HRMS儀美國Thermo Fisher公司；氮吹儀 美國Organomation Associates Jnc公司；3K15高速冷凍離心機(jī) 美國Sigma公司；P300H超聲波清洗儀 德國Elma公司；Vortex Genius 3旋渦振蕩器 德國IKA公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品前處理

將豬肉樣品充分絞碎混勻后，裝入潔凈的容器內(nèi)，作為試樣。準(zhǔn)確稱取試樣5.00 g，置于50 mL聚丙烯離心管中，加入乙腈20 mL，超聲提取10 min，渦旋5 min充分混勻，8 000hg離心3 min，將上清液轉(zhuǎn)移至另一離心管中，向殘?jiān)屑尤?0 mL乙腈重復(fù)提取一次。合并上清液，加入氯化鈉2 g和正己烷20 mL，渦旋混勻2 min，8 000hg離心3 min，取乙腈層溶液，于40 ℃氮?dú)獯蹈?，? mL 0.1%甲酸溶液-甲醇（1:1，V/V）溶解殘?jiān)?，過0.22 μm濾膜后，準(zhǔn)備上機(jī)測定。

1.3.2 色譜條件

色譜柱：Waters AcquityB E H C18柱（2.1 mmh100 mm，1.7 μm）。流動(dòng)相A為0.1%甲酸溶液，B為甲醇。梯度洗脫程序：0～1.5 min，10% B；2～9 min，10%～80% B；9～12 min，80% B；12～13 min，80%～10% B；13～15 min，B相保持10%。

1.3.3 質(zhì)譜條件

質(zhì)量分析器：四極桿-靜電場軌道阱；電噴霧離子源（正離子）；掃描模式：全掃描/數(shù)據(jù)依賴二級(jí)掃描；鞘氣流量35 arb；輔助氣流量10 arb；噴霧電壓3.8 kV；離子源溫度350 ℃；毛細(xì)管溫度320 ℃。一級(jí)掃描范圍m/z 100～1 500，一級(jí)掃描分辨率70 000，自動(dòng)增益控制做全掃描S進(jìn)入C形阱中的目標(biāo)離子數(shù)目3h106。二級(jí)掃描分辨率17 500，自動(dòng)增益控制做MS2進(jìn)入C形阱中的目標(biāo)離子數(shù)目1h105，隔離窗口為m/z4.0，碰撞能量30 eV。9 種MALs質(zhì)譜信息見表1。

表1 9 種MALs的質(zhì)譜信息Table 1 Mass spectral parameters for the 9 macrolide antibiotics

2 結(jié)果與分析

2.1 提取溶劑的選擇

本實(shí)驗(yàn)選擇6 種不同的溶劑（甲醇、乙腈、0.1%甲酸-乙腈、0.2%甲酸-乙腈、0.1%甲酸-甲醇、0.2%甲酸-甲醇），以9 種MALs的平均回收率（加標(biāo)量10 μg/kg）考察不同溶劑的提取效果。實(shí)驗(yàn)表明，采用乙腈作為提取溶劑時(shí)，9 種MALs的回收率最高。這是因?yàn)镸ALs一般為弱堿性化合物，易溶于有機(jī)溶劑，可與酸形成鹽，因此采用中性乙腈提取回收率最高。乙腈提取后，加入正己烷能去除脂肪等雜質(zhì)，提高回收率，可省去凈化步驟，降低實(shí)驗(yàn)成本。

2.2 色譜-質(zhì)譜條件的優(yōu)化

2.2.1 色譜柱的選擇

為得到較好的峰形和分離效果，選擇質(zhì)量濃度為10 ng/mL的9 種MALs標(biāo)準(zhǔn)品溶液，在相同的流動(dòng)相和洗脫程序下，分別采用Waters Acquity-BEH C18色譜柱（2.1 mmh100 mm，1.7 μm）、XBridge BEH Shield RP18色譜柱（2.1 mmh100 mm，2.5 μm）、Thermo Accucorea Q C18色譜柱（2.1 mmh100 mm，2.6 μm）、Hypersil Gold C18色譜柱（2.1 mmh100 mm，1.9 μm）進(jìn)行分離實(shí)驗(yàn)。MALs為堿性化合物，Waters Acquity BEH C18色譜柱采用亞乙基橋雜化顆粒、三鍵鍵合和端基封尾技術(shù)，保證了堿性化合物的峰形，相較于其他色譜柱，采用Waters Acquity BEH C18色譜柱可有效分離9 種MALs，且峰形較好。故本實(shí)驗(yàn)選擇Waters Acquity BEH C18（2.1 mmh100 mm，1.7 μm）作為色譜柱。

2.2.2 流動(dòng)相的選擇

本實(shí)驗(yàn)考察3 種不同的流動(dòng)相體系（水-甲醇、水-乙腈、0.1%甲酸-甲醇）對色譜峰形和信號(hào)響應(yīng)的影響。實(shí)驗(yàn)表明，使用水-甲醇流動(dòng)相體系得到的色譜峰形優(yōu)于水-乙腈體系；使用0.1%甲酸-甲醇作流動(dòng)相相對于使用水-甲醇體系峰面積變大，穩(wěn)定性也有所提高。在電噴霧正電離條件下，甲酸的加入有助于目標(biāo)物離子化，從而提高分離效率和信號(hào)的強(qiáng)度。后續(xù)實(shí)驗(yàn)選用0.1%甲酸溶液-甲醇體系作為流動(dòng)相。

2.2.3 質(zhì)譜條件優(yōu)化

利用UPLC-Q-Orbitrap HRMS對9 種MALs混合標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行正離子掃描，得到一級(jí)全掃描質(zhì)譜圖，以各化合物的分子離子峰[M+H]+理論精確質(zhì)量數(shù)提取色譜圖，圖1為9 種MALs的提取離子流色譜圖（50 ng/mL）。9 種MALs的精確質(zhì)量相對偏差小于1.0h10-6（表1），符合高分辨質(zhì)譜檢測的要求[34]。二級(jí)質(zhì)譜掃描基于數(shù)據(jù)依賴的碰撞解離模式運(yùn)行，采集目標(biāo)物的二級(jí)質(zhì)譜圖進(jìn)行定性（圖2）。

圖1 9 種MALs的提取離子流色譜圖Fig. 1 Extracted ion chromatograms of the 9 macrolide antibiotics

圖2 9 種MALs的二級(jí)質(zhì)譜圖Fig. 2 MS2 spectra of the 9 macrolide antibiotics

2.3 基質(zhì)效應(yīng)評(píng)價(jià)結(jié)果

基質(zhì)是指樣品中目標(biāo)物以外的組分，與目標(biāo)物共洗脫出的樣品基質(zhì)對目標(biāo)物的離子化過程產(chǎn)生影響，造成離子化抑制或增強(qiáng)，這就是基質(zhì)效應(yīng)[35]。與三重四極桿質(zhì)譜相比，UPLC-Q-Orbitrap HRMS具有更強(qiáng)的抗干擾能力，但基質(zhì)效應(yīng)仍然存在，且豬肉樣品基質(zhì)較為復(fù)雜，因此，需要對基質(zhì)效應(yīng)進(jìn)行評(píng)價(jià)，本實(shí)驗(yàn)將9 種MALs標(biāo)準(zhǔn)品分別用乙腈和豬肉空白基質(zhì)提取液配制標(biāo)準(zhǔn)溶液（0.5～100 ng/mL），以相同物質(zhì)在基質(zhì)溶液中標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率與純?nèi)軇┲袠?biāo)準(zhǔn)曲線斜率比值評(píng)價(jià)基質(zhì)效應(yīng)情況?；|(zhì)效應(yīng)大于100%時(shí)，表明基質(zhì)對目標(biāo)物離子化有增益作用；基質(zhì)效應(yīng)小于100%時(shí)，表明基質(zhì)對目標(biāo)物離子化有抑制作用。結(jié)果表明，9 種MALs在豬肉基質(zhì)中均存在明顯的離子抑制現(xiàn)象：克拉霉素（69.5%）、麥迪霉素（72.9%）、交沙霉素（69.8%）、紅霉素（79.1%）、阿奇霉素（69.4%）、泰樂菌素（71.8%）、羅紅霉素（59.4%）、替米考星（51.9%）、克林霉素（49.2%）。由于基質(zhì)效應(yīng)的存在，本方法在定量時(shí)采用基質(zhì)配標(biāo)，降低基質(zhì)效應(yīng)的影響。

2.4 方法的線性范圍、檢出限和定量限結(jié)果

在豬肉空白提取液中添加標(biāo)準(zhǔn)溶液配制一系列的標(biāo)準(zhǔn)工作液，以9 種MALs的一級(jí)質(zhì)量數(shù)提取離子峰面積為縱坐標(biāo)（Y），各組分的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X）作線性回歸方程，以3 倍和10 倍信噪比對應(yīng)的空白豬肉樣品添加質(zhì)量濃度作為檢出限和定量限。9 種MALs的線性方程、檢出限、定量限見表2。結(jié)果表明，9 種MALs在0.5～100 μg/L質(zhì)量濃度范圍內(nèi)相關(guān)系數(shù)（r2）大于0.998，線性關(guān)系良好。檢出限為0.05～0.2 μg/kg，定量限為0.1～0.4 μg/kg，低于GB/T 20762ü2006《禽畜肉中林可霉素、竹桃霉素、紅霉素、替米考星、泰樂菌素、克林霉素、螺旋霉素、吉他霉素、交沙霉素殘留量的測定液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法》[36]（檢出限為1.0 μg/kg）和SN/T 1777.2ü2007《動(dòng)物源性食品中大環(huán)內(nèi)酯類抗生素殘留測定方法》[37]（測定低限為20 μg/kg）。

表2 9 種MALs的線性關(guān)系、檢出限、定量限Table 2 Linear equations, limits of detection and limits ofquantification of the 9 macrolide antibiotics

2.5 回收率和精密度結(jié)果

表3 9 種MALs的回收率和精確度Table 3 Spiked RSDs of the 9 macrolide antibiotics

在空白豬肉樣品中添加9 種MALs標(biāo)準(zhǔn)溶液制成陽性樣品，添加水平分別為1、2 倍和10 倍定量限，每個(gè)添加水平進(jìn)行6 次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，計(jì)算回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviations，RSD）。如表3所示，添加量0.1～4.0 μg/kg時(shí)，方法的回收率范圍為69.4%～107.6%，RSD不高于8.3%，符合檢驗(yàn)方法要求。

2.6 實(shí)際樣品檢測結(jié)果

應(yīng)用本研究建立的方法對市場采購的20 批次豬肉樣品進(jìn)行檢測，采用精確質(zhì)量數(shù)和保留時(shí)間對樣品中的MALs定性篩查，并結(jié)合二級(jí)特征碎片離子確證，均未檢出陽性樣品。與標(biāo)準(zhǔn)方法GB/T 20762ü2006[36]和SN/T 1777.2ü2007[37]的測定結(jié)果一致。

3 結(jié) 論

本研究建立了UPLC-Q-Orbitrap HRMS測定豬肉中9 種MALs，并進(jìn)行了方法學(xué)驗(yàn)證。該方法簡單高效、選擇性好、靈敏度高，滿足大量豬肉樣品中MALs快速、準(zhǔn)確定量的需要，可為其他基質(zhì)中其他MALs的快速篩查提供方法參考，也是對現(xiàn)有國家標(biāo)準(zhǔn)檢測動(dòng)物源性食品中MALs的有力補(bǔ)充。