聶雪梅，王 菡，許秀麗，張 峰,*，陳 達(dá)

（1.天津大學(xué)精密儀器與光電子工程學(xué)院，天津 300072；2.中國檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院食品安全研究所，北京 100176；3.陜西科技大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，陜西 西安 710021）

牛奶富含蛋白質(zhì)，在高溫加熱時(shí)發(fā)生美拉德反應(yīng)易產(chǎn)生一種副產(chǎn)物氨基酸——賴丙氨酸[1]。賴丙氨酸的產(chǎn)生不僅使牛奶的營養(yǎng)價(jià)值降低[2]，在毒理實(shí)驗(yàn)中還發(fā)現(xiàn)其能螯合金屬酶，特異地引發(fā)小鼠腎鈣質(zhì)沉著、腎細(xì)胞巨大及腎小管細(xì)胞壞死[3]，尤其對常飲用牛奶的嬰幼兒的健康有重要影響[4-5]。隨著研究深入，發(fā)現(xiàn)賴丙氨酸的形成有很多因素，包括食品組分、食品加工方式、食品儲存條件[6-8]等，而其中熱加工方式是對賴丙氨酸含量影響最大的因素[9]，賴丙氨酸也在很多熱加工食品中被測出[10-12]，尤其在很多嬰兒配方食品中，賴丙氨酸已經(jīng)開始作為一個(gè)質(zhì)量指標(biāo)，用以衡量其對嬰兒是否造成傷害[13]。Faist等[14]研究顯示賴丙氨酸能夠評估奶制品熱處理程度的靈敏的指示劑。Calabrese等[15]在酪蛋白鈣和奶粉中檢測到高含量的賴丙氨酸，也證明賴丙氨酸可作為牛奶加工工藝評定的重要指示物之一[16]。因此開展牛奶中賴丙氨酸分析方法研究，并研究其在熱加工溫度下的含量變化規(guī)律，對于準(zhǔn)確了解市場上牛奶中賴丙氨酸的含量水平，科學(xué)制定牛奶中賴丙氨酸的限量水平，都具有重要意義。

對于賴丙氨酸的檢測方法主要包括氨基酸分析儀法[17]、氣相色譜（gas chromatography，GC）法[18]、液相色譜（liquid chromatography，LC）法[19]以及液相色譜-質(zhì)譜（liquid chromatography-mass spectrometry，LC-MS）聯(lián)用法[20]、脈沖-傅里葉變換核磁共振譜儀法[21]等。目前并未檢索到高分辨質(zhì)譜檢測方法，其中脈沖-傅里葉變換核磁共振譜儀分析過程不需要衍生，處理簡單，但其只適于合成的賴丙氨酸及其標(biāo)準(zhǔn)品的檢測，并不適合成分復(fù)雜的食品中賴丙氨酸的分析。而GC、LC和LC-MS均需要衍生，其中GC衍生理由為賴丙氨酸作為一種交聯(lián)氨基酸[21]，不能直接用GC進(jìn)行檢測，必須經(jīng)過衍生得到弱極性、低揮發(fā)性和良好熱穩(wěn)定性的衍生物才能進(jìn)行GC分離測定。LC衍生理由為由于賴丙氨酸在紫外-熒光檢測器響應(yīng)值較低，因此需引入衍生試劑提高其響應(yīng)值。LC-MS衍生理由為由于引入衍生試劑后更易離子化，可提高質(zhì)譜響應(yīng)。且目前測定乳制品中賴丙氨酸的方法大多需要衍生，樣品基質(zhì)復(fù)雜且干擾物質(zhì)多[22-24]，定性準(zhǔn)確度差[25-27]。例如Lourdes等[28]用6 mol/L鹽酸溶液110 ℃水解24 h，用硅烷化試劑N-(特丁基二甲基硅烷基)-N-甲基三氟乙酰胺與賴丙氨酸進(jìn)行衍生，形成N-tert-butyldimethylsilyl衍生化合物，之后采用GC-氫火焰離子檢測器進(jìn)行定量，定性又需氣相色譜-質(zhì)譜儀器，前處理復(fù)雜。

本研究經(jīng)過鹽酸水解后直接定量，同時(shí)采用的高分辨質(zhì)譜具有高分辨能力和高靈敏度，能夠準(zhǔn)確定性定量等優(yōu)勢，無需衍生也能準(zhǔn)確測定賴丙氨酸，且測定時(shí)間短，對于提高行業(yè)檢測水平和科學(xué)制定牛奶中賴丙氨酸的限量有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮牧場牛奶來自牧場當(dāng)天牛奶采集樣本，其他牛奶樣品均為市購。牛奶中主要營養(yǎng)成分分別為脂肪3.5%、蛋白質(zhì)3.3%、碳水化合物4.8%、鈉50 mg/100 g。

賴丙氨酸標(biāo)準(zhǔn)品（純度＞95%） 加拿大多倫多研究化學(xué)品公司；甲酸（質(zhì)譜級） J&K科學(xué)有限公司；鹽酸（分析純） 安徽八一化工股份有限公司；硼酸（分析純） 富凱化工責(zé)任有限公司；硼氫化鈉（HPLC級） 百靈威科技有限公司；氫氧化鈉（分析純） 天津科密歐化學(xué)試劑有限公司；乙腈、甲醇（色譜純） 美國Thermo Fisher Scientific公司；實(shí)驗(yàn)室超純水由Millipore 純水儀制備。

1.2 儀器與設(shè)備

Q-Exactive超高效液相色譜-四極桿/靜電場軌道阱高分辨率質(zhì)譜儀 美國Thermo Fisher Scientific公司；Milli-R04純水儀 德國Millipore公司；XP105DR分析天平 梅特勒-托利多上海有限公司；HSC-12B針式氮吹儀天津恒奧科技有限公司；VM-6渦旋振蕩器 北京五洲東方科技發(fā)展有限公司；一次性注射器（2 mL）及濾膜美國Welch公司。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

準(zhǔn)確稱取賴丙氨酸標(biāo)準(zhǔn)品10 mg（精確至0.1 mg），用水定容至10 mL，配制成1 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲備液，置于-20 ℃貯存，再用水稀釋成質(zhì)量濃度為1.00 μg/mL標(biāo)準(zhǔn)溶液。測定前用水稀釋成1.00、2.00、5.00、10.00、20.00、50.00、100.00 ng/mL和200.00 ng/mL系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.3.2 超高效液相色譜條件

色譜柱為Ascentis-C8（100 mmh4.6 mm，3 μm）；流動相A為水相，含0.1%（V/V）甲酸，流動相B為乙腈；流速0.4 mL/min；進(jìn)樣體積5 μL，柱溫40 ℃；梯度洗脫程序：0 min，95% A；8 min，60% A；10～13 min，0% A；13.1～15 min，95% A。

1.3.3 質(zhì)譜條件

離子源：加熱電噴霧離子源；離子源參數(shù)：離子傳輸管溫度350 ℃；鞘氣壓力206.85 kPa；輔助氣壓力1 000 kPa；噴霧電壓3.5 kV；監(jiān)測模式：正離子監(jiān)測模式；全掃描-數(shù)據(jù)依賴二級掃描模式；實(shí)驗(yàn)中所用的氣體均為高純氮?dú)?，質(zhì)量掃描范圍m/z100～500，待測化合物信息如表1所示。

表1 監(jiān)測化合物質(zhì)譜信息Table 1 Mass spectrometric parameters of lysinoalanine

1.3.4 樣品前處理

首先準(zhǔn)確稱取空白鮮奶樣品1 g（精確至0.001 g）于酸解管中，加入1.33 mL硼酸緩沖液（0.5 mol/L，pH 9.5）和173 μL硼氫化鈉（NaBH4，1 mol/L在0.2 mol/L NaOH中）混合。在室溫下孵育6 h后，加入4 mL鹽酸（6 mol/L），在110 ℃氮?dú)庵兴?4 h，加水至10 mL，用0.45 μm濾膜過濾，取200 μL濾液至氮吹管中，吹干后用500 μL純水復(fù)溶，過0.22 μm濾膜，上機(jī)待測。

1.4 數(shù)據(jù)處理

超高效液相色譜-四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜原始數(shù)據(jù)利用Thermo Scientific Xcaliber軟件采集及定性定量處理。表格制作利用Microsoft Office 2007軟件，繪制圖形利用Origin Pro軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 測定條件的優(yōu)化

2.1.1 色譜柱的優(yōu)化

如圖1所示，采用C18柱有拖尾現(xiàn)象且無保留，這可能是由于柱長較短，未洗脫干凈；使用HILIC及aQ色譜柱分離目標(biāo)物時(shí)，色譜峰響應(yīng)比Ascentis-C8柱低，影響定量的準(zhǔn)確性。Ascentis-C8為中等極性分析柱，Ascentis-C8分析柱可以對較弱極性化合物有較好的保留。根據(jù)色譜峰響應(yīng)、峰性和保留時(shí)間，本方法采用Ascentis-C8色譜柱對目標(biāo)物進(jìn)行分離。

圖1 4 種色譜柱效果對比圖Fig. 1 Comparison of separation efficiencies with four columns

2.1.2 流動相的優(yōu)化

考察甲醇和乙腈2 種有機(jī)相對色譜峰形的影響，如圖2所示。乙腈作為流動相時(shí)目標(biāo)化合物響應(yīng)更高。乙腈作為有機(jī)相對分析物產(chǎn)生更高的響應(yīng)，這可能是由于乙腈表面張力小，可以更好地溶液去溶劑化，離子化效率更高。選擇水相時(shí)對比加不同體積分?jǐn)?shù)的甲酸（0%、0.05%、0.1%、0.2%）對色譜峰形的影響。如圖3所示，在使用0.1%甲酸溶液作為流動相時(shí)對賴丙氨酸有良好的色譜分離效果，可兼顧質(zhì)譜響應(yīng)，色譜峰峰形較優(yōu)，流動相中甲酸含量會影響賴丙氨酸的離子化效果，甲酸含量過高會引起競爭性的電離抑制，使得賴丙氨酸在質(zhì)譜中的響應(yīng)降低，含量過低會導(dǎo)致離子化效果較差，因此選擇0.1%甲酸溶液作為流動相。

圖2 2 種有機(jī)相效果對比圖Fig. 2 Comparison of separation efficiencies with two organic phases

圖3 4 種不同比例甲酸效果對比圖Fig. 3 Comparison of separation efficiencies with different concentrations of formic acid

2.1.3 質(zhì)譜參數(shù)的優(yōu)化

對比全掃描、全掃描-數(shù)據(jù)依賴二級掃描2 種掃描模式。全掃描模式下雖然可以達(dá)到對目標(biāo)物的定量檢測，但其僅以母離子精確質(zhì)量數(shù)和保留時(shí)間對目標(biāo)物進(jìn)行定性，易造成假陽性檢測結(jié)果。因此選擇全掃描-數(shù)據(jù)依賴二級掃描模式進(jìn)行目標(biāo)物的篩查監(jiān)測，以母離子和碎片離子精確質(zhì)量數(shù)定性，精確母離子定量，可達(dá)到對目標(biāo)物的篩查及定量目的。在全掃描-數(shù)據(jù)依賴二級掃描模式下，質(zhì)譜方法設(shè)置一級分辨率70 000，二級分辨率35 000，歸一化碰撞能量在25%可得到最佳監(jiān)測結(jié)果，質(zhì)荷比偏差均小于1.0h10-6。

2.1.4 優(yōu)化后的賴丙氨酸色譜峰

圖4 賴丙氨酸標(biāo)準(zhǔn)色譜圖Fig. 4 Chromatogram of lysinoalanine standard

如圖4所示，經(jīng)過色譜和質(zhì)譜條件的優(yōu)化，選用Ascentis-C8色譜柱（100 mmh4.6 mm，3 μm）對待測物進(jìn)行分離，以0.1%甲酸溶液和乙腈作為流動相進(jìn)行梯度洗脫，在全掃描-數(shù)據(jù)依賴二級掃描模式下進(jìn)行檢測，色譜峰峰形較好。

2.2 前處理?xiàng)l件的優(yōu)化

由于牛奶中的賴丙氨酸多與蛋白質(zhì)結(jié)合，所以分析牛奶中的賴丙氨酸時(shí)都要先經(jīng)過水解，使賴丙氨酸得到釋放[29-30]。本實(shí)驗(yàn)測定2 種QuECHERS方法乙酸鋅凈化除脂、乙酸鋅+亞鐵氰化鉀凈化除脂和鹽酸水解3 種提取方式下賴丙氨酸的含量，發(fā)現(xiàn)未經(jīng)鹽酸水解的2 種方法均未檢出賴丙氨酸，所以本實(shí)驗(yàn)采用鹽酸水解的方法。鹽酸水解后，凈化方式對比了PSA和C18單獨(dú)凈化、兩者結(jié)合凈化以及直接氮吹復(fù)溶，發(fā)現(xiàn)響應(yīng)值并無較大區(qū)別，因此為節(jié)省前處理步驟采用直接氮吹復(fù)溶。

2.3 方法驗(yàn)證

2.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線、檢出限和定量限結(jié)果

配制賴丙氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液（1～200 μg/L），以峰面積（Y）為縱坐標(biāo)，質(zhì)量濃度（X，μg/L）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，在1～200 μg/L質(zhì)量濃度范圍內(nèi)賴丙氨酸色譜峰面積與質(zhì)量濃度呈良好線性相關(guān)，回歸方程為y＝111 362x+17 995.4；相關(guān)系數(shù)R2為0.999 0。同時(shí)樣品中賴丙氨酸的檢出限和定量限分別為0.01 mg/kg和0.025 mg/kg，表明該方法具有較好的靈敏度，可以對含量較低的分析物進(jìn)行定量。

2.3.2 回收率測定結(jié)果

選取鮮奶進(jìn)行回收率實(shí)驗(yàn)，在處理樣品前加入不同含量標(biāo)準(zhǔn)品，按照前處理方法分別進(jìn)行樣品處理后，在相同條件下進(jìn)行分析，分2 批次共測定6 次，結(jié)果見表2，回收率在78.7%～117.1%范圍內(nèi)。

表2 回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 2 Recoveries of lysinoalanine from spiked samples

2.3.3 精密度測定結(jié)果

表3 精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 3 Precision of the method

選取某滅菌乳進(jìn)行重復(fù)性實(shí)驗(yàn)，按照前處理方法分別進(jìn)行前處理后，在相同條件下進(jìn)行分析，分3 批次共測定6 次，結(jié)果見表3。相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.64%，此方法的精密度良好。

2.4 樣品分析及評價(jià)

2.4.1 樣本中賴丙氨酸定性分析

運(yùn)用全掃描-數(shù)據(jù)依賴二級掃描模式收集化合物信息，選取2 個(gè)響應(yīng)值高且有特征性的碎裂片段C5H10N+（m/z84.081 5）與C6H12NO2+（m/z130.086 3）以及豐度比進(jìn)行定性。由圖5可得，二級碎片質(zhì)荷比、分子離子質(zhì)荷比、母離子的保留時(shí)間基本可對復(fù)雜牛奶樣本中的賴丙氨酸準(zhǔn)確定性。

圖5 賴丙氨酸標(biāo)準(zhǔn)品和樣品中賴丙氨酸色譜圖和子離子質(zhì)譜圖Fig. 5 Chromatograms and daughter ion mass spectra of 50 μg/L lysinoalanine standard and sample

2.4.2 溫度樣品含量變化規(guī)律的影響

從牧場采集的新鮮牛奶，在6 h內(nèi)混勻并置于小型模擬牛奶加工設(shè)備上，分別加熱至50～150 ℃（每隔10 ℃測定1 個(gè)樣品），加熱時(shí)間5～10 s，加熱處理后置于50 mL樣品管中（每個(gè)溫度點(diǎn)取2 個(gè)樣），按照賴丙氨酸前處理方式鹽酸酸解處理并上機(jī)。如圖6所示，當(dāng)加熱溫度升高時(shí)，賴丙氨酸含量會隨著溫度不斷變化，從50～110 ℃賴丙氨酸含量隨著溫度的升高而增加，當(dāng)加熱到120 ℃時(shí)含量下降，從120～140 ℃含量波動較小。

圖6 賴丙氨酸含量隨溫度變化圖Fig. 6 Variation in lysinoalanine content of fresh milk with heating temperature

2.4.3 市場樣品檢測結(jié)果

表4 市售乳制品中的賴丙氨酸含量Table 4 Lysinoalanine contents in commercial liquid milk products

對來自市場不同品牌的12 種液態(tài)乳進(jìn)行測定，根據(jù)賴丙氨酸的保留時(shí)間及選擇的兩對子離子峰高的比值進(jìn)行定性分析，結(jié)果如表4所示。超高溫瞬時(shí)滅菌牛奶的8 個(gè)樣品的平均含量為5.554 mg/kg，巴氏殺菌牛奶的4 個(gè)樣品的平均含量為3.745 mg/kg，其含量值在上述賴丙氨酸的變化規(guī)律范圍內(nèi)。目前，對于賴丙氨酸在乳制品中的限量，各國均無限量標(biāo)準(zhǔn)。因此，本方法的建立，對于準(zhǔn)確獲取市場上牛奶中賴丙氨酸的含量情況，制定出符合我國國情的限量標(biāo)準(zhǔn)具有重要參考意義。

3 結(jié) 論

本研究采用高分辨質(zhì)譜對液態(tài)奶中賴丙氨酸進(jìn)行分析，并進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證。由于高分辨質(zhì)譜具有高分辨能力、準(zhǔn)確定性、超高靈敏度等優(yōu)勢，又采用了簡化前處理的方法，處理時(shí)間短，不需要衍生，相對于其他文獻(xiàn)中賴丙氨酸的測定方法，具有明顯的優(yōu)勢。同時(shí)采用小型模擬加工設(shè)備對牧場采集的新鮮液態(tài)奶進(jìn)行不同加工條件的處理，并研究賴丙氨酸含量隨加熱溫度的變化規(guī)律，在50～110 ℃賴丙氨酸含量隨著溫度的升高增加，當(dāng)加熱到120 ℃時(shí)含量下降，從120～140 ℃含量波動不大。其后對來自市場不同品牌的12 種液態(tài)奶進(jìn)行測定，其含量符合賴丙氨酸的變化規(guī)律范圍。通過采用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜可對乳品中的賴丙氨酸實(shí)現(xiàn)快速、準(zhǔn)確、靈敏檢測，對于準(zhǔn)確獲取市場上乳制品中賴丙氨酸含量情況，制定出符合我國國情的限量標(biāo)準(zhǔn)具有重要參考意義，本方法將在保障乳制品安全中發(fā)揮積極作用。