劉子毅，顧豐穎，王博倫，張 帆，劉 昊，王 鋒*

（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，農(nóng)業(yè)部農(nóng)產(chǎn)品加工綜合性重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100193）

高血壓是危害人類健康的主要疾病之一，血管緊張素轉(zhuǎn)換酶（angiotensin converting enzyme，ACE）是影響人體血壓平衡的重要因素[1]。ACE是一種含鋅二肽羧肽酶，通過腎素-血管緊張素系統(tǒng)（renin-angiotensin system，RAS）和激肽釋放酶-激肽系統(tǒng)（kallikrein-kinin system，KKS）發(fā)揮作用導(dǎo)致血壓升高。在RAS系統(tǒng)中，它作用于血管緊張素I使其轉(zhuǎn)化為有升壓活性的血管緊張素II，致血壓升高；在KKS系統(tǒng)中，ACE能夠使舒緩激肽失活，從而引起血壓的升高[2]。目前，治療高血壓的藥物多為化學(xué)合成的ACE抑制劑，長期服用可能會(huì)對(duì)人體造成不良影響，而天然來源的動(dòng)植物蛋白水解制備的ACE抑制劑，不僅具有良好的降血壓效果，而且不會(huì)造成毒副作用，備受關(guān)注[3-6]。玉米黃粉是玉米淀粉濕法加工后的主要副產(chǎn)物，含有大約60%的蛋白質(zhì)[7]，其中玉米醇溶蛋白占68%左右，醇溶蛋白含有高比例的脯氨酸（9.0%～10.5%）、丙氨酸（8.3%～10.5%）、亮氨酸（19.3%～21.1%）等疏水性氨基酸[8]，通過酶解作用可以制備出具有降血壓等[9-10]多種活性的肽類。而且，當(dāng)末端氨基酸為疏水氨基酸時(shí)，ACE抑制肽的抑制活性較高[11-12]。由于玉米黃粉中存在高含量的醇溶蛋白，導(dǎo)致原料的水溶性差，在水溶液環(huán)境下玉米黃粉的酶解效率極低[13-14]。王曉杰等[15]研究表明，采用Flavourzyme和Protamex雙酶分步水解玉米黃粉，ACE抑制率可達(dá)（99.35f3.55）%，但酶解時(shí)間長達(dá)5 h；毛舒云[16]、王凱[17]等研究表明，掃頻超聲處理玉米醇溶蛋白能夠提高酶解效率，提高ACE抑制率，在最佳條件下ACE抑制率可達(dá)48.48%。因此，提高水介質(zhì)下玉米黃粉的酶解效率，建立綠色高效的ACE抑制肽制備方法，有利于提高玉米黃粉附加值，促進(jìn)副產(chǎn)物的綜合利用，避免了資源浪費(fèi)。

Zhang Yuhao等[18]研究表明，經(jīng)超高壓處理后的膠原蛋白再進(jìn)行堿性蛋白酶酶解，酶解產(chǎn)物的ACE抑制率有所提高；Garcia-Mora等[19]研究表明，Savinase和Corolase7086酶解產(chǎn)物的ACE抑制活性隨著壓力的增加而增大，在300 MPa下Savinase酶解扁豆蛋白得到的ACE抑制活性最高為69.5%和70.8%。根據(jù)團(tuán)隊(duì)前期蛋白酶的選擇實(shí)驗(yàn)得出堿性蛋白酶進(jìn)行酶解不僅效果好，而且成本低，故本研究擬借助超高壓協(xié)同堿性蛋白酶酶解玉米黃粉制備ACE抑制肽，提高ACE抑制率，縮短制備時(shí)間。實(shí)驗(yàn)通過比較分析超高壓協(xié)同酶解、超高壓預(yù)處理后酶解、常壓酶解等酶解方式對(duì)產(chǎn)物ACE抑制率的影響，得到最佳酶解方式；采用響應(yīng)面分析法優(yōu)化制備條件，以期獲得高活性的ACE抑制肽，同時(shí)提高酶解效率。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

玉米黃粉2017年6月由山東壽光巨能金玉米開發(fā)有限公司提供，抽真空保存。

堿性蛋白酶（≥20h104U/g）、堿性蛋白酶活性檢測試劑盒 北京索萊寶科技有限公司；ACE、N-[3-(2-呋喃基)丙烯酰]-L-苯丙氨酰-甘氨酰-甘氨酸（N-[3-(2-furylacryloyl)]-L-phenyalanyl-glycyl-glycine，F(xiàn)APGG）、4-羥乙基哌嗪乙黃酸（N-(2-hydroxyethyl)-N-(3-sulfopropyl)-piperazine，HEPES） 西格瑪奧德里奇（上海）貿(mào)易有限公司；氫氧化鈉 北京化工廠。

1.2 儀器與設(shè)備

RHP-100高速多功能粉碎機(jī) 浙江榮浩工貿(mào)有限公司；DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器 鄭州科創(chuàng)儀器有限公司；ME104E/02電子天平、Five Easy PlusTMFE28 pH計(jì)梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；HPP.L2-600/2超高壓設(shè)備 天津市華泰森淼生物工程技術(shù)有限公司；真空封口機(jī) 愛博士有限公司；數(shù)顯恒溫水浴鍋常州普天儀器制造有限公司；H/T 16MM臺(tái)式高速常溫離心機(jī) 湖南赫西儀器裝備有限公司；DHG-9203A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；Spectra Max 190酶標(biāo)儀 美國Molecular Devices公司。

1.3 方法

1.3.1 超高壓前后堿性蛋白酶活性的檢測

采用堿性蛋白酶活性檢測試劑盒進(jìn)行測定。

1.3.2 玉米黃粉酶解產(chǎn)物的制備

將玉米黃粉粉碎，過100 目篩，配制玉米黃粉混合液，在35 ℃進(jìn)行堿性蛋白酶酶解，水解反應(yīng)結(jié)束后，95 ℃滅酶15 min，6 732hg離心分離15 min，取上清液，4 ℃保存?zhèn)溆谩８鲗?shí)驗(yàn)組處理?xiàng)l件如表1所示。

表1 各實(shí)驗(yàn)組處理?xiàng)l件Table 1 Treatment conditions for each experimental group

1.3.3 ACE抑制率的測定

參照丁青芝[20]的方法略有修改。稱取HEPES 1.910 g，NaCl 1.755 g，加適量的蒸餾水溶解，調(diào)pH值至8.3，加水定容至100 mL，4 ℃保存。稱取FAPGG 19.97 mg，加HEPES緩沖溶液溶解并定容至50 mL，4 ℃避光保存。ACE配制為0.1 U/mL，各加樣量見表2。

表2 加樣量Table 2 Sample loadings

在340 nm波長處，分別測定對(duì)照孔和樣品孔的初始吸光度，37 ℃保溫30 min后再測定其吸光度。ACE抑制率按下式計(jì)算：

式中：A為對(duì)照孔的吸光度減少值；B為樣品孔的吸光度減少值。

1.3.4 單因素試驗(yàn)

配制5.00%的玉米黃粉混合液，用1 mol/L的NaOH溶液調(diào)體系pH 8.0，在攪拌狀態(tài)下加入1.05h104U/g（以底物質(zhì)量計(jì)）的堿性蛋白酶，并將其密封在聚氯乙烯袋中，充分混勻后迅速置于超高壓容器中，在400 MPa，35 ℃的條件下水解15 min。水解反應(yīng)結(jié)束后，95 ℃滅酶15 min，6 732hg離心分離15 min，取上清液，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

固定基本水解條件不變，分別改變超高壓酶解過程中底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)、時(shí)間、壓力、pH值和溫度參數(shù)，各因素梯度水平如表3所示，研究其對(duì)酶解產(chǎn)物ACE抑制率的影響。

表3 單因素試驗(yàn)因素與水平Table 3 Level and code of factors used for one-factor-at-a-time design

1.3.5 響應(yīng)面分析

在單因素試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，運(yùn)用Design-Expert軟件，根據(jù)Box-Behnken設(shè)計(jì)原理，選擇底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)（A）、時(shí)間（B）、壓力（C）、pH值（D）對(duì)ACE抑制率影響顯著的因素作為響應(yīng)因素，以ACE抑制率為響應(yīng)值，設(shè)計(jì)4因素3水平的響應(yīng)面試驗(yàn)，設(shè)計(jì)如表4所示。

表4 Box-Behnken響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素與水平Table 4 Level and code of factors used for Box-Behnken design

1.4 數(shù)據(jù)分析

所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3 次，數(shù)據(jù)采用fs；采用SPSS 24及Design-Expert 8.0.6軟件處理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 超高壓對(duì)堿性蛋白酶活性的影響

實(shí)驗(yàn)中所用堿性蛋白酶的活性為（21.03f0.07）×104U/g，經(jīng)超高壓處理后，蛋白酶活性為（24.19f0.05）×104U/g。經(jīng)400 MPa處理此堿性蛋白酶活性增加。吳溪[21]研究發(fā)現(xiàn)木瓜蛋白酶分別經(jīng)過100、200、300 MPa處理后活性由常壓下的（1.94f0.08）×104U/g分別提高到（2.15f0.13）×104、（2.43f0.18）×104、（2.09f0.13）×104U/g；陶敏等[22]也發(fā)現(xiàn)菠蘿汁中的菠蘿蛋白酶活性經(jīng)過300 MPa處理后酶活性提高，達(dá)到最大為120%；楊新穎[35]在研究高壓對(duì)脂肪酶的影響時(shí)發(fā)現(xiàn)當(dāng)壓力為450 MPa時(shí)酶活性達(dá)到最大，當(dāng)壓力大于450 MPa時(shí)酶活性又開始下降。研究認(rèn)為壓力能夠影響酶的三級(jí)結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致酶三級(jí)結(jié)構(gòu)的重構(gòu)或崩潰，使酶的活性中心物質(zhì)發(fā)生凝聚或破壞，而影響催化活性。因此，推測本實(shí)驗(yàn)中酶活性升高可能是因?yàn)?00 MPa下堿性蛋白酶的活性中心物質(zhì)發(fā)生凝聚，進(jìn)而提高了酶的活性[23-24]。

2.2 超高壓對(duì)玉米黃粉酶解產(chǎn)物ACE抑制率的影響

超高壓協(xié)同堿性蛋白酶酶解玉米黃粉，得到產(chǎn)物的ACE抑制率可達(dá)72.03%，均高于常壓酶解以及超高壓預(yù)處理后再酶解。由圖1可知，在相同的酶解時(shí)間下（15 min），超高壓酶解產(chǎn)物ACE抑制率（A、B組）比常壓酶解（C組）提高了22%～55%。這與Garcia-Mora等[25]采用超高壓協(xié)同酶解制備得到的產(chǎn)物ACE抑制率要比常壓下酶解產(chǎn)物高28%～50%的結(jié)果相似。同時(shí)，本團(tuán)隊(duì)前期實(shí)驗(yàn)研究表明，在常壓下，其酶解產(chǎn)物的ACE抑制率達(dá)到最高（D組：62.37%）時(shí)，也遠(yuǎn)低于超高壓協(xié)同酶解組的ACE抑制率，而且酶解時(shí)間長達(dá)1 h。因?yàn)閴毫Φ拇嬖谀軌虼龠M(jìn)蛋白與酶的結(jié)合，同時(shí)促進(jìn)了酶與產(chǎn)物復(fù)合物的分離[26]。

圖1 不同處理對(duì)ACE抑制率的影響Fig. 1 Effects of different treatments on ACE inhibition rate

與超高壓預(yù)處理后再酶解（B組）相比，超高壓協(xié)同酶解（A組）ACE抑制率高30%以上。超高壓預(yù)處理后再酶解ACE抑制活性較低，可能是玉米黃粉高含量的疏水基團(tuán)在釋壓后重新進(jìn)行了組合。Yin Shouwei等[27]對(duì)蕓豆進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過高壓處理后的蕓豆蛋白分離物，疏水基團(tuán)和SH基團(tuán)暴露出來，在壓力釋放后，它們又參與新的疏水作用形成新的二硫鍵，使蛋白重新發(fā)生聚合。因此，選擇超高壓協(xié)同酶解制備玉米黃粉ACE抑制肽。

2.3 超高壓協(xié)同酶解單因素試驗(yàn)結(jié)果

圖2 超高壓協(xié)同酶解各因素不同水平對(duì)ACE抑制率的影響Fig. 2 Effects of various factors of UHP-assisted enzymatic hydrolysis on ACE inhibition rate

2.3.1 底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)酶解產(chǎn)物ACE抑制率的影響

底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%時(shí)抑制率達(dá)到最大，為72.81%。由圖2A可知，隨著玉米黃粉底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增大，ACE抑制率呈現(xiàn)出先增大后降低的趨勢。因?yàn)檫m當(dāng)?shù)脑黾拥孜镔|(zhì)量分?jǐn)?shù)，可以增加酶與底物的結(jié)合位點(diǎn)，當(dāng)?shù)孜镔|(zhì)量分?jǐn)?shù)過大時(shí)，酶解反應(yīng)變?nèi)?，ACE抑制率開始下降，朱振寶等[28]在采用酶解法制備核桃ACE抑制肽時(shí)，也發(fā)現(xiàn)了類似的變化趨勢。靳冬武等[29]研究超高壓酶解酪蛋白時(shí)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)?shù)孜镔|(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到一定比例再繼續(xù)增大，會(huì)降低酶在溶液中的溶解度，使二者之間的接觸機(jī)會(huì)減少，從而降低反應(yīng)速率。推測認(rèn)為，本實(shí)驗(yàn)中底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到5%后繼續(xù)增大，會(huì)減少堿性蛋白酶與玉米黃粉的接觸機(jī)會(huì)，降低反應(yīng)速率，產(chǎn)物的ACE抑制率開始下降。因此，在底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%時(shí)抑制率最大。

2.3.2 超高壓時(shí)間對(duì)酶解產(chǎn)物ACE抑制率的影響

當(dāng)超高壓處理時(shí)間為15 min時(shí)，ACE抑制率達(dá)到最大72.35%。繼續(xù)延長超高壓時(shí)間，ACE抑制率開始下降，因?yàn)殡S著時(shí)間的不斷延長，蛋白過度水解，酶活也會(huì)隨著時(shí)間的延長受到影響[30]。Perreault等[31]研究了不同高壓時(shí)間對(duì)亞麻籽蛋白結(jié)構(gòu)、水解反應(yīng)等的影響，發(fā)現(xiàn)高壓能誘導(dǎo)蛋白的分離，但隨著時(shí)間的延長又會(huì)形成大分子的聚合物，進(jìn)而影響酶解反應(yīng)。因此，本實(shí)驗(yàn)中ACE抑制率會(huì)隨著時(shí)間的延長先增大后減小，在超高壓處理15 min為最適處理時(shí)間。

2.3.3 壓力對(duì)酶解產(chǎn)物ACE抑制率的影響

在超高壓協(xié)同酶解過程中，壓力也是主要影響因素。由圖2C可知，隨著壓力的增大，ACE抑制率呈現(xiàn)出先增大后降低的趨勢，在壓力為400 MPa時(shí)ACE抑制率達(dá)到最大，為71.05%。因?yàn)殡S著壓力的增大蛋白變的越來越松散，繼續(xù)增大壓力，蛋白之間又會(huì)重新發(fā)生聚集[25]。Angioloni等[32]研究了壓力對(duì)青豌豆酶解的影響，發(fā)現(xiàn)隨著壓力的增大，蛋白的溶解度先增大后減小。推測認(rèn)為，ACE抑制率隨壓力變化，主要是由于超高壓狀態(tài)下玉米黃粉的分散體系的性狀及性質(zhì)的改變引起的，在400 MPa時(shí)玉米黃粉最分散，因此，在400 MPa時(shí)ACE抑制率最大。

2.3.4 pH值對(duì)酶解產(chǎn)物ACE抑制率的影響

在本實(shí)驗(yàn)中，pH值為8.0時(shí)ACE抑制率達(dá)到最大，為71.98%（圖2D）。張淼[33]、鄭明洋[34]等認(rèn)為玉米黃粉中主要為疏水性的醇溶蛋白，在堿性條件下溶解度會(huì)增加。因此，堿性條件下可以提高底物的溶解度，提高酶與底物接觸面積，提高產(chǎn)物制備效率。楊新穎[35]的研究表明，高壓會(huì)改變酶的最適pH值，使脂肪酶的最適pH值較常壓條件下向堿性偏移了0.5。前期在常壓條件下的預(yù)試驗(yàn)中，酶解產(chǎn)物ACE抑制率隨著pH的增大先增大后減小，在pH 9.0時(shí)達(dá)到最大，超高壓協(xié)同處理中顯示出堿性蛋白酶的最適pH值的變化，由常壓的9.0下降至8.0，分析認(rèn)為超高壓條件可能改變了酶蛋白的結(jié)構(gòu)，從而影響其最適pH值。因此，pH值為8.0是超高壓協(xié)同酶解實(shí)驗(yàn)的最適pH值。

2.3.5 溫度對(duì)酶解產(chǎn)物ACE抑制率的影響

在本實(shí)驗(yàn)中，35 ℃為超高壓協(xié)同酶解的最適溫度（圖2E）。由圖2E可知，隨著溫度的增大，ACE抑制率呈現(xiàn)出先增大后降低的趨勢，但變化幅度較小。施瑛等[36]研究認(rèn)為在一定的溫度范圍內(nèi)隨著溫度的升高，使蛋白底物與酶分子間相互碰撞的機(jī)會(huì)增大，提高了酶的催化效率。前期在常壓條件下的預(yù)實(shí)驗(yàn)中，酶解產(chǎn)物ACE抑制率45 ℃時(shí)，達(dá)到最大，在本研究中，堿性蛋白酶由常壓下最適溫度45 ℃下降至35 ℃，這與田美玲[37]的研究結(jié)果相似，高壓可以改變酶的最適溫度。因此，在超高壓協(xié)同酶解實(shí)驗(yàn)中確定溫度為35 ℃。

2.4 超高壓協(xié)同酶解工藝條件的優(yōu)化

2.4.1 Box-Behnken設(shè)計(jì)結(jié)果與分析

通過探討底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)、時(shí)間、壓力、pH值、溫度對(duì)ACE抑制率的影響可知，溫度對(duì)ACE抑制率的影響不明顯，故在35 ℃時(shí)選擇其他4 個(gè)因素設(shè)計(jì)響應(yīng)面試驗(yàn)（表5）。應(yīng)用Design-Expert軟件對(duì)表5所得的試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析，得到的二次多元回歸模型如下：Y=72.03-5.29A-0.87B-7.21C+11.65D+3.43AB+5.81AC-0.32AD-0.33BC-2.43BD-8.11CD-16.86A2-10.63B2-21.64C2-16.70D2（Y為ACE抑制率的預(yù)測值）。由表6可知，回歸模型極顯著（P＜0.000 1），R2和R2Adj分別為0.997 1和0.994 2，說明模型對(duì)試驗(yàn)擬合良好，失擬項(xiàng)不顯著，表明該模型能夠較好地反映實(shí)際情況；CV值越低，說明模型的置信度越高[38]。本實(shí)驗(yàn)的CV值只有2.88%，表明置信度較高，模擬方程能夠較好的反應(yīng)真實(shí)實(shí)驗(yàn)值，可以用該模型來分析響應(yīng)面的變化[39]?；貧w方程各項(xiàng)方差分析表明，A、B、C、D、AB、AC、BD、CD、A2、B2、C2、D2對(duì)ACE抑制率有顯著的影響（P＜0.05），各因素對(duì)ACE抑制率的影響依次是pH值、壓力、底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)和時(shí)間。

表5 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 5 Experimental design and results for response surface analysis

表6 回歸方程系數(shù)顯著性分析Table 6 Analysis of variance of quadratic polynomial regression equation and significance test

2.4.2 雙因素交互作用分析

圖3 各試驗(yàn)因素對(duì)ACE抑制率的交互影響Fig. 3 Response surface plots showing the interactive effects of various factors on ACE inhibition rate

圖3 為底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)、時(shí)間、壓力、pH值任意2 個(gè)因素取零水平時(shí)，其余2 個(gè)因素對(duì)ACE抑制率的影響，2 個(gè)因素的交互作用可由響應(yīng)面三維立體圖直觀反映出來，圖形越陡峭，說明對(duì)ACE抑制率的影響越顯著，即為主要影響因素[40-41]。

由圖3A可知，當(dāng)?shù)孜镔|(zhì)量分?jǐn)?shù)不變，隨著高壓時(shí)間的延長，ACE抑制率表現(xiàn)出先升高后下降的趨勢，趨勢不太明顯；當(dāng)高壓時(shí)間不變，隨著底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增大，ACE抑制率表現(xiàn)出先升高后下降的趨勢，趨勢較明顯。由此可知，與時(shí)間相比，底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)為主要影響因素。由圖3B可知，當(dāng)?shù)孜镔|(zhì)量分?jǐn)?shù)不變，隨著壓力的增加，ACE抑制率表現(xiàn)出先升高后下降的趨勢，趨勢較陡；當(dāng)壓力不變，隨著底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增大，ACE抑制率表現(xiàn)出先升高后下降的趨勢，趨勢較明顯。由此可知，與底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)相比，壓力為主要影響因素。同理，從圖3C～F可以看出，pH值對(duì)ACE抑制率的影響最大，其次是壓力、底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)和時(shí)間。

2.4.3 超高壓協(xié)同堿性蛋白酶制備玉米黃粉ACE抑制肽條件確定和驗(yàn)證

根據(jù)Box-Behnken試驗(yàn)得到結(jié)果和回歸方程，預(yù)測試驗(yàn)范圍內(nèi)的最佳工藝條件為底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)4.78%、高壓時(shí)間14.38 min、壓力372.49 MPa、pH 8.43，預(yù)測模型的ACE抑制率為76.15%。

為驗(yàn)證回歸方程模型，考慮到實(shí)際情況，將模型預(yù)測出的最佳工藝條件進(jìn)行修正，修正后的條件為底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)4.78%、高壓時(shí)間14 min、壓力372 MPa、pH 8.4、溫度35 ℃，在此條件下進(jìn)行3 次實(shí)驗(yàn)，計(jì)算得到ACE抑制率的平均值為（74.30f0.45）%，與預(yù)測值76.15%相符，表明該模型能夠較好的預(yù)測出實(shí)際的ACE抑制率。

3 結(jié) 論

超高壓協(xié)同堿性蛋白酶酶解不僅可以提高酶解產(chǎn)物的ACE抑制率，而且可以縮短酶解時(shí)間至15 min以內(nèi)。通過探討底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)、超高壓時(shí)間、壓力、pH值、溫度對(duì)ACE抑制率的影響，采用響應(yīng)面設(shè)計(jì)，優(yōu)化制備條件，得到水解物的ACE抑制率在底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4.78%、高壓時(shí)間14 min、壓力372 MPa、pH 8.4，溫度35 ℃的條件下，可達(dá)到最大值為74.30%。其中，pH值是主要影響因素，其次是壓力、底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)和時(shí)間。