彭 丹，劉亞麗，李林青，畢艷蘭

（河南工業(yè)大學(xué)糧油食品學(xué)院，河南 鄭州 450001）

蛋白質(zhì)作為生命的物質(zhì)基礎(chǔ)，在生理功能調(diào)節(jié)中起著重要作用。牛乳是提供人體蛋白質(zhì)的重要途徑之一，已成為人們生活中的必需品。國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)中明確規(guī)定了牛乳中蛋白質(zhì)含量的最低要求，如《巴氏殺菌乳》《滅菌乳》中蛋白質(zhì)含量不得低于2.9%。近年來(lái)，有關(guān)乳品中蛋白質(zhì)含量不達(dá)標(biāo)的事件時(shí)有發(fā)生，一些不法商販向乳品中添加高氮物質(zhì)如三聚氰胺等提高蛋白質(zhì)含量牟取利益，嚴(yán)重影響乳品行業(yè)的發(fā)展和消費(fèi)者的身體健康，引起了社會(huì)關(guān)注，也對(duì)質(zhì)監(jiān)部門(mén)和檢驗(yàn)工作者提出了更高的要求，即尋找快速、準(zhǔn)確檢測(cè)乳品中蛋白質(zhì)含量的方法。

目前，常用的蛋白質(zhì)檢測(cè)方法有凱氏定氮法、紫外吸收法[1]、電泳法[2]、低場(chǎng)核磁共振法[3]和近紅外光譜法[4-7]等。凱氏定氮法是通過(guò)測(cè)量總氮量計(jì)算得到蛋白質(zhì)的含量，該方法測(cè)量準(zhǔn)確，但操作復(fù)雜、費(fèi)時(shí)長(zhǎng)；紫外吸收法具有簡(jiǎn)便、靈敏等優(yōu)點(diǎn)，但分析精度不高，干擾物質(zhì)較多；近年來(lái)出現(xiàn)的電泳法、低場(chǎng)核磁共振法等檢測(cè)準(zhǔn)確、快速，然而這些方法還不夠成熟。相比其他方法，近紅外光譜法具有快速、無(wú)損、可在線(xiàn)檢測(cè)等特點(diǎn)，已廣泛應(yīng)用于食品、農(nóng)業(yè)、化工和制藥領(lǐng)域中[8-12]。近紅外光譜技術(shù)屬于間接分析方法，需要通過(guò)多元校正方法建立光譜信息與待測(cè)成分間的關(guān)聯(lián)，由于儀器性能、外界環(huán)境、自身特性等因素影響，使得光譜數(shù)據(jù)中往往含有共線(xiàn)性、噪聲及外界干擾信息等，導(dǎo)致建模結(jié)果誤差較大甚至無(wú)法使用，故此需要優(yōu)化條件。目前，在乳蛋白質(zhì)檢測(cè)中主要開(kāi)展了3 個(gè)方面的研究：1）通過(guò)不同測(cè)量方式檢測(cè)乳品中蛋白質(zhì)含量，對(duì)于含有懸浮顆粒的液體，多采用漫透射[13]或漫反射[14-15]方式進(jìn)行測(cè)量；2）選擇不同特征波段開(kāi)展蛋白質(zhì)含量檢測(cè)[16]，如短波段（780～1 100 nm）、中波段（1 100～1 700 nm）和長(zhǎng)波段（1 700～2 500 nm）等，以此剔除冗余信息，增強(qiáng)檢測(cè)的針對(duì)性；3）確定蛋白質(zhì)檢測(cè)的最佳化學(xué)計(jì)量學(xué)方法，包括預(yù)處理方法[17-18]和建模方法[19-20]。由于牛乳介質(zhì)中存在顆粒不均勻性，使其對(duì)近紅外光譜有很強(qiáng)的散射作用，多采用正交信號(hào)校正、多元散射校正、求導(dǎo)等對(duì)光譜進(jìn)行處理。在已有的建模條件研究中往往只考慮某一方面的優(yōu)化，而實(shí)際問(wèn)題中各因素完全獨(dú)立的情況極為少見(jiàn)。因此，本實(shí)驗(yàn)針對(duì)各因素間存在相互作用影響的情況，在單一建模條件研究的基礎(chǔ)上，運(yùn)用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)對(duì)建模條件進(jìn)行優(yōu)化，建立一個(gè)準(zhǔn)確度高、重復(fù)性好、適用于牛乳蛋白質(zhì)含量分析的優(yōu)化檢測(cè)體系。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

實(shí)驗(yàn)所用的牛乳均來(lái)自廠(chǎng)家直營(yíng)店。為使蛋白質(zhì)含量在較大范圍內(nèi)變化，采取添加蛋白粉的方式，并對(duì)樣品進(jìn)行均質(zhì)操作以保證樣品的均勻性和穩(wěn)定性，共得到180 個(gè)樣本。通過(guò)K-S方法選取135 個(gè)樣本的光譜數(shù)據(jù)作為校正集，其余45 個(gè)樣本的光譜數(shù)據(jù)作為驗(yàn)證集。

1.2 儀器與設(shè)備

XDS型近紅外光譜儀 丹麥FOSS公司；ZS90粒度電位分析儀 英國(guó)Malvern公司；AH-Pilot高壓均質(zhì)機(jī)德國(guó)APV公司。

1.3 方法

1.3.1 蛋白質(zhì)含量的測(cè)定

參考GB 5009.5ü2016《食品中蛋白質(zhì)的測(cè)定》測(cè)定。

1.3.2 近紅外光譜檢測(cè)

采用XDS型近紅外光譜儀對(duì)樣品的吸收光譜進(jìn)行測(cè)試，光譜采集范圍780～2 500 nm，掃描次數(shù)32 次，分辨率2 nm，檢測(cè)器為硅（780～1 100 nm）和硫化鉛（1 100～2 500 nm）。

1.3.3 光譜數(shù)據(jù)處理

以蛋白質(zhì)含量為外部微擾，進(jìn)行二維相關(guān)同步譜和自相關(guān)譜解析，尋找與蛋白質(zhì)含量相關(guān)的敏感波段。具體過(guò)程：1）依據(jù)蛋白質(zhì)含量的真實(shí)值，從小到大順序均勻選取10 個(gè)代表性樣品用于一維近紅外牛乳光譜的測(cè)量；2）采用正交信號(hào)校正對(duì)測(cè)得的光譜進(jìn)行預(yù)處理，消除與被測(cè)成分無(wú)關(guān)的光譜信息；3）根據(jù)二維相關(guān)光譜理論，對(duì)處理后的一維光譜進(jìn)行分析、計(jì)算，獲得其二維相關(guān)同步譜及自相關(guān)譜；4）通過(guò)解析二維相關(guān)同步譜和自相關(guān)譜，確定與蛋白質(zhì)含量相關(guān)的最佳光譜波段。上述二維相關(guān)光譜計(jì)算過(guò)程利用Matlab R2018a軟件完成。

利用CAMO公司的Unscrambler 10.5軟件對(duì)光譜進(jìn)行預(yù)處理，分別建立多元線(xiàn)性回歸（multiple linear regression，MLR）、主成分回歸（principal component regression，PCR）、偏最小二乘（partial least squares，PLS）法和支持向量機(jī)（support vector regression，SVR）校正模型，模型性能通過(guò)決定系數(shù)（R2）、校正均方根誤差（root mean square error of calibration，RMSEC）和預(yù)測(cè)均方根誤差（root mean square error of prediction，RMSEP）評(píng)價(jià)。

1.3.4 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選取檢測(cè)波段、預(yù)處理方法和建模方法為考察因素，以目標(biāo)函數(shù)F[21]為評(píng)價(jià)指標(biāo)，采用L16（45）正交表進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì)，確定蛋白質(zhì)含量最佳的建模條件。

表1 正交試驗(yàn)因素與水平Table 1 Code and level of independent variables used for orthogonal array design

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

采用Matlab R2018a、Origin 9.0軟件和Excel 2016軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)和圖表繪制，利用SPSS 22.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 牛乳近紅外光譜及二維相關(guān)分析

圖1 牛乳的近紅外光譜圖Fig. 1 NIR spectra of milk samples

如圖1所示，脂肪、蛋白質(zhì)和乳糖等成分近紅外吸收分布于整個(gè)光譜區(qū)域，且相互重疊。在1 460、1 974 nm波長(zhǎng)附近有2 個(gè)主要吸收峰，分別為牛乳中水、蛋白質(zhì)、脂肪和乳糖等成分的結(jié)構(gòu)和組成信息。其中，1 460 nm波長(zhǎng)處與—OH、—NH2等基團(tuán)的倍頻吸收有關(guān)[22]，1 974 nm波長(zhǎng)處為水的吸收信息。為確定蛋白質(zhì)的主要吸收位置，以蛋白質(zhì)含量為外擾，對(duì)牛乳近紅外光譜進(jìn)行同步二維相關(guān)分析，結(jié)果如圖2所示。

圖2 牛乳二維近紅外光譜相關(guān)同步譜（a）和自相關(guān)譜（b）Fig. 2 Two-dimensional correlation spectra of samples (a) and autocorrelation spectrum (b)

圖2 a中的峰有自相關(guān)峰和交叉峰兩類(lèi)，位于對(duì)角線(xiàn)上的峰為自相關(guān)峰，位于對(duì)角線(xiàn)外為交叉峰。自相關(guān)峰的強(qiáng)度反映了不同波長(zhǎng)下光譜信號(hào)隨外部擾動(dòng)變化的程度[23-25]，即對(duì)蛋白質(zhì)含量變化的敏感程度，其值均為正；交叉峰則表示不同波長(zhǎng)下光譜強(qiáng)度變化的相似性，其值有正有負(fù)。自相關(guān)譜是由對(duì)角線(xiàn)上自相關(guān)峰構(gòu)成的譜圖（圖2b）。由圖2可以看出，在波長(zhǎng)978、1 164、1 420、1 524、1 659、1 860 nm和2 238 nm處存在較強(qiáng)的自相關(guān)峰，其中2 238 nm處的自相關(guān)峰與蛋白質(zhì)有關(guān)；在主對(duì)角線(xiàn)以外，在（1 420 nm，1 860 nm）、（1 860 nm，2 238 nm）、（1 420 nm，2 238 nm）、（1 524 nm，2 238 nm）位置處存在明顯正交叉峰，表明波長(zhǎng)1 420、1 524、1 860 nm和2 238 nm處的吸收峰來(lái)源相同，均是由蛋白肽鍵和氨基中NüH鍵對(duì)光譜吸收形成[26]?？梢?jiàn)，1 400～2 300 nm波段的光譜隨蛋白質(zhì)含量變化極顯著。該波段與Kalinin等[27]牛乳蛋白質(zhì)測(cè)量所用的光譜區(qū)域（800～1 065 nm）有所不同，這可能與測(cè)量方式、儀器硬件等有關(guān)，本實(shí)驗(yàn)采用了漫反射方式測(cè)量牛乳蛋白質(zhì)含量，而文獻(xiàn)[27]中利用了透射方式。雖然短波區(qū)域（780～1 100 nm）的光透射性強(qiáng)，但吸收系數(shù)較小[28]，與長(zhǎng)波相比蛋白質(zhì)含量信息量相對(duì)較少（圖2b），增加了數(shù)據(jù)分析和建模的難度，結(jié)合二維相關(guān)分析，本研究選擇波段1 400～2 300 nm作為蛋白質(zhì)檢測(cè)的研究區(qū)域。

2.2 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 預(yù)處理方法的對(duì)比

為降低干擾信息的影響和提升模型預(yù)測(cè)精度，分別采用矢量歸一化、多元散射校正（multiplicative scatter correction，MSC）、一階導(dǎo)數(shù)（1st）、二階導(dǎo)數(shù)（2nd）、標(biāo)準(zhǔn)正態(tài)變量變換（standard normal variate，SNV）方法對(duì)原始光譜進(jìn)行預(yù)處理后建立PLS模型，結(jié)果如表2所示。除2nd方法外，矢量歸一化、MSC、1st、SNV方法處理后模型的相關(guān)系數(shù)和預(yù)測(cè)準(zhǔn)確性均有明顯提高，表明這4 種方法能夠扣除光譜中與待測(cè)成分無(wú)關(guān)的干擾信號(hào)，保留有用信息。其中，經(jīng)SNV法處理后的蛋白質(zhì)模型的預(yù)測(cè)效果最佳，其次為MSC法。與預(yù)處理前相比，經(jīng)SNV法和MSC法處理后模型的RMSEP分別降低了31.1%和27.8%。通過(guò)粒徑分析可知，均質(zhì)后牛乳中脂肪球的粒徑分布于0.2～1.0 μm之間，存在明顯脂肪球分布的不均勻性，這使其對(duì)近紅外光有較強(qiáng)的散射作用[29]，由于MSC法和SNV法能夠消除顆粒大小及均勻性變化對(duì)光譜的影響，所以經(jīng)MSC法和SNV法處理后可有效消除散射作用引起的干擾。相反，2nd法在去除背景干擾、提高靈敏度的同時(shí)放大了噪聲，降低了信噪比，使得模型的預(yù)測(cè)能力下降，導(dǎo)致RMSEP升高了91.9%。可見(jiàn)，預(yù)處理方法的選擇對(duì)蛋白質(zhì)檢測(cè)結(jié)果有較大影響，其中MSC和SNV是較為理想的預(yù)處理方法。

表2 預(yù)處理方法的比較Table 2 Comparison of results obtained with different preprocessing methods

2.2.2 波段選擇的影響

圖3 不同波段牛乳中蛋白質(zhì)含量的預(yù)測(cè)Fig. 3 Effect of different wavelength regions on prediction of protein concentration in milk

選擇與待測(cè)組分相關(guān)的特征波段，既能降低計(jì)算量、提高模型的預(yù)測(cè)能力和穩(wěn)健性，又能避免光譜數(shù)據(jù)間相關(guān)性導(dǎo)致的過(guò)擬合現(xiàn)象。本實(shí)驗(yàn)在1 400～2 300 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)研究不同波段對(duì)蛋白質(zhì)含量檢測(cè)的影響。如圖3所示，3 個(gè)波段1 400～2 300、1 400～1 800 nm和1 800～2 300 nm的RMSEP分別為0.146、0.142和0.125，其中1 800～2 300 nm波段的預(yù)測(cè)結(jié)果明顯好于其他波段，這與Tsenkova等[30]的研究結(jié)果基本一致，可見(jiàn)1 800～2 300 nm波段內(nèi)含有較強(qiáng)的蛋白質(zhì)含量信息。雖然1 400～1 800 nm波段也含有蛋白質(zhì)相關(guān)的光譜信息，但是由于存在脂肪較強(qiáng)的散射作用和水的強(qiáng)吸收作用，加之牛乳中水的含量（＞87%）遠(yuǎn)大于蛋白質(zhì)，使得此波段存在復(fù)雜的背景干擾。因此，1 800～2 300 nm是蛋白質(zhì)理想的檢測(cè)波段。

2.2.3 建模方法比較

圖4 不同建模方法牛乳中蛋白質(zhì)含量的預(yù)測(cè)結(jié)果Fig. 4 Effect of different modeling methods on prediction of protein concentration in milk

采用MLR、PCR、PLS和SVR對(duì)同一牛乳樣本進(jìn)行定量分析，結(jié)果如圖4所示。4 種建模方法中線(xiàn)性校正方法明顯好于非線(xiàn)性，且線(xiàn)性建模方法中PLS法和PCR法對(duì)蛋白質(zhì)的預(yù)測(cè)性能均優(yōu)于MLR法。這可能是因?yàn)? 800～2 300 nm范圍內(nèi)自變量（光譜數(shù)據(jù)）與被測(cè)目標(biāo)（蛋白質(zhì)含量）間不僅有較強(qiáng)的線(xiàn)性關(guān)系，同時(shí)光譜數(shù)據(jù)內(nèi)部存在多重共線(xiàn)性的現(xiàn)象，使得MLR建模方法失效。而PLS和PCR法能夠?qū)庾V數(shù)據(jù)進(jìn)行分解和篩選，剔除多重相關(guān)信息和無(wú)解釋意義信息的干擾；SVR法作為非線(xiàn)性定量校正方法，其原理是通過(guò)升維方式使原樣本空間中的非線(xiàn)性問(wèn)題轉(zhuǎn)化為特征空間中的線(xiàn)性關(guān)系進(jìn)行建模，但是對(duì)于樣本空間中線(xiàn)性問(wèn)題使用SVR法會(huì)增加計(jì)算的復(fù)雜性，甚至引起“維數(shù)災(zāi)難”，導(dǎo)致模型的預(yù)測(cè)精度降低。由圖4可知，PLS法和PCR法建立的蛋白質(zhì)校正模型的預(yù)測(cè)結(jié)果相差不大，RMSEP分別為0.125和0.132。因此，PLS法和PCR法均適合作為蛋白質(zhì)檢測(cè)的建模方法。

2.3 正交試驗(yàn)結(jié)果

在實(shí)際應(yīng)用中，由于近紅外吸收光弱且易受外界干擾，光譜中夾雜許多無(wú)用信息（包括噪聲、背景等），為提高信噪比、建立穩(wěn)定的校正模型，需要對(duì)光譜數(shù)據(jù)進(jìn)行波段、預(yù)處理和建模方法的優(yōu)選組合。本實(shí)驗(yàn)選取預(yù)處理方法、檢測(cè)波段和建模方法3 個(gè)因素進(jìn)行正交試驗(yàn)，以F值作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，F(xiàn)值越大表明模型的性能越好。經(jīng)方差分析，以上3 個(gè)因素對(duì)模型的預(yù)測(cè)精度存在一定交互作用的影響。由表3可知，影響蛋白質(zhì)模型預(yù)測(cè)精度的主次因素為建模方法＞檢測(cè)波段＞預(yù)處理方法；根據(jù)極值分析結(jié)果，得到各因素的較好水平組合為A2B3C1，即建模方法為PCR法、檢測(cè)波段為1 800～2 300 nm、預(yù)處理方法為MSC法，這與單因素試驗(yàn)結(jié)果并不完全一致，且A2B3C1沒(méi)有出現(xiàn)于正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案中，這可能與預(yù)處理方法、建模方法2 個(gè)因素間的交互作用影響有關(guān)。為了確定最佳建模條件，分別在A2B3C1、單因素試驗(yàn)以及正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)中最優(yōu)建模條件下對(duì)未知樣品進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明A2B3C1條件下的預(yù)測(cè)效果最好，其R2、RMSEP分別為0.993、0.106。可見(jiàn)，經(jīng)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)確定的建模條件能夠進(jìn)一步提高蛋白質(zhì)模型的準(zhǔn)確度，也表明正交設(shè)計(jì)能夠有效優(yōu)化復(fù)雜背景下的近紅外建模條件。

表3 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 3 Orthogonal array design with results

3 結(jié) 論

建模條件的選擇直接影響近紅外光譜分析結(jié)果。本實(shí)驗(yàn)以復(fù)雜背景條件下的蛋白質(zhì)為研究對(duì)象，采用近紅外光譜技術(shù)對(duì)牛乳中蛋白質(zhì)含量進(jìn)行檢測(cè)，通過(guò)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化近紅外建模條件，即預(yù)處理方法、檢測(cè)波段和建模方法。結(jié)果表明，與傳統(tǒng)方法對(duì)比，該方法不僅避免了各建模條件存在交互作用的影響，覆蓋了主要因素的各種組合，而且以較少實(shí)驗(yàn)次數(shù)得到了預(yù)測(cè)準(zhǔn)確度較高的分析模型，為近紅外蛋白質(zhì)含量建模條件優(yōu)選提供了一條有效的途徑。