坤杜孜阿依·阿布都沙拉木，姜志強(qiáng)，劉婭菲，熊靜璠，娜斯拜·阿卜杜瓦哈普，李江偉

(新疆大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院/省部共建新疆生物資源基因工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，烏魯木齊 830046)

0 引 言

【研究意義】1993年發(fā)現(xiàn)在駱駝科動(dòng)物中存在天然缺失輕鏈的重鏈抗體(Heavy Chain Antibodies, HCAbs)以來(lái)[1]，但研究者對(duì)于HCAbs自身的功能和特性、其在駱駝體液免疫系統(tǒng)中的作用、與疾病的關(guān)系等研究較欠缺、鮮有文獻(xiàn)報(bào)道。研究駱駝HCAbs的功能及性質(zhì)，對(duì)分析駱駝免疫系統(tǒng)的功能，研究更有效的疾病預(yù)防和治療手段，開(kāi)發(fā)和利用這類(lèi)抗體具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】 駱駝科現(xiàn)存3屬6種動(dòng)物。在所有這些動(dòng)物中，除具有由2條重鏈和2條輕鏈組成的IgG1型常規(guī)抗體外，還存在天然缺失輕鏈和CH1結(jié)構(gòu)域的IgG2和IgG3型重鏈抗體。在自然界中，缺失輕鏈的HCAbs目前僅見(jiàn)于駱駝科動(dòng)物和幾種軟骨魚(yú)類(lèi)。當(dāng)前，大量針對(duì)重鏈抗體的研究主要集中在納米抗體的功能特性及應(yīng)用方面。納米抗體除了具有完全的抗原結(jié)合活性外，還具有常規(guī)抗體所不具備的諸多優(yōu)勢(shì)[2]，包括如組織穿透能力強(qiáng)、穩(wěn)定性極高、免疫原性低、易與蛋白裂隙中的隱蔽表位結(jié)合[3]、對(duì)酶活性具有抑制作用[4-6]等?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】盡管納米抗體的研究和應(yīng)用受到了極大的重視，但對(duì)于HCAbs自身的功能和特性、其在駱駝體液免疫系統(tǒng)中的作用、與疾病的關(guān)系等研究、鮮有文獻(xiàn)報(bào)道。當(dāng)前對(duì)駱駝HCAb的物理化學(xué)性質(zhì)的研究，主要集中在對(duì)其可變區(qū)即納米抗體的溫度穩(wěn)定性方面，發(fā)現(xiàn)納米抗體普遍具有比常規(guī)抗體更高的溫度耐受性[2-6]，然而其在體內(nèi)的天然形式，即重鏈抗體是否也具有與納米抗體一樣的溫度穩(wěn)定性，重鏈抗體是否比常規(guī)抗體溫度穩(wěn)定性更高，尚缺乏研究。研究比較納米抗體、HCAbs與常規(guī)抗體之間在溫度穩(wěn)定性方面的差異?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】 研究HCAbs與常規(guī)抗體及納米抗體之間在穩(wěn)定性的特點(diǎn)，對(duì)采用3種不同抗原免疫的新疆雙峰駝，以及免疫血清中的IgG1常規(guī)抗體與IgG2和IgG3重鏈抗體及其對(duì)應(yīng)的納米抗體，在不同溫度處理下的抗原結(jié)合活性進(jìn)行比較，分析其溫度穩(wěn)定性的差異，為研究HCAb的功能特性和駱駝適應(yīng)極端環(huán)境的免疫特點(diǎn)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材 料

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：3只健康新疆雙峰駝(Camelus bactrianus)，年齡均在3.5年，雌性2只，雄性1只，由新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)第十二師提供。

菌種和質(zhì)粒：大腸桿菌 DH5α、BL21(DE3)和重組質(zhì)粒 pET30a-spaA-N，pET30a/Lys-23，pET30a/Spa-G26和pET30a/Ali-A4由本室保存。Lys-23、Ali-A4 和Spa-G26為研究組通過(guò)噬菌體展示技術(shù)從VHH駱駝免疫文庫(kù)中篩選獲得的分別結(jié)合溶菌酶、蒜氨酸酶和丹毒絲菌表面抗原A(spaA)的納米抗體[7-8]。

主要試劑：溶菌酶(12650-88-3)購(gòu)自 Sigma-Aldrich公司，Protein A Resin FF(L00464)和Protein G Resin FF(L00664)購(gòu)自南京金斯瑞公司, HRP conjugated Goat anti-Llama IgG(H&L)購(gòu)自ImmunoReagents公司，Ni-sephorase 6 FF(17-5318-01)購(gòu)自GE公司。

1.2 方 法

1.2.1 駱駝免疫

溶菌酶、蒜氨酸酶和spaA 3種抗原分別與弗氏完全佐劑(初免)和不完全佐劑(加強(qiáng))等體積充分混勻乳化作為免疫原，分別對(duì)雙峰駝進(jìn)行頸部皮下注射，免疫劑量為 600 μg/次，每2周加強(qiáng)1次，共進(jìn)行5次免疫。每次免疫前和終免7 d后，頸靜脈采血，分離血清，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 血清IgG抗體不同亞型的分離和純化

按Hamers-Casterman[1]方法，分離駱駝免疫血清中的IgG1、IgG2和IgG3抗體亞型。簡(jiǎn)述如下：將駱駝免疫血清2 mL以PBS稀釋2倍后，加入到 Protein G Resin層析柱中，結(jié)合10 min，收集與Protein G未結(jié)合的流出液備用，分別以洗脫緩沖液 A(0.15 mol/L NaCl、0.58%乙酸、pH 3.5)和洗脫緩沖液 B(0.1 mol/L 甘氨酸，pH 2.7)先后洗脫獲得 IgG1 及 IgG3組分。將收集的 Protein G 未結(jié)合的流出液，加入到 Protein A Resin層析柱中，結(jié)合10 min，以洗脫緩沖液 C(0.1 mol/L 甘氨酸，pH 2.0)洗脫獲得 IgG2組分。洗脫的各組分立即中和至 pH 值7.4，在還原條件下對(duì)分離的各個(gè)亞型 IgG 抗體進(jìn)行SDS-PAGE 檢測(cè)。

1.2.3 納米抗體的表達(dá)與純化

提取納米抗體重組質(zhì)粒，鑒定正確后轉(zhuǎn)化至BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)菌。選取陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子誘導(dǎo)表達(dá)蛋白。在0.2 mmol/mL IPTG，16℃，150 r/min的條件下過(guò)夜誘導(dǎo)表達(dá)。誘導(dǎo)后的菌液進(jìn)行離心處理，超聲后再12 000 r/min離心取上清，使用Ni柱親和層析純化重組納米抗體，15%SDS-PAGE檢測(cè)納米抗體蛋白的表達(dá)及純化。

1.2.4 ELISA測(cè)定免疫血清不同亞型抗體效價(jià)

免疫血清、分離純化的IgG各亞型抗體以及納米抗體與抗原的結(jié)合采用間接ELISA測(cè)定。檢測(cè)設(shè)立3個(gè)平行重復(fù)，終數(shù)據(jù)取平均值。在96孔板上分別包被1 μg/mL溶菌酶、蒜氨酸酶和spaA 3種抗原。BSA封閉后，加入系列稀釋的免疫血清和納米抗體，孵育后加入羊抗美洲駝IgG(H&L)-HRP抗體，稀釋比例為1∶3 000。加入顯色底物TMB，在酶標(biāo)儀中測(cè)定450 nm 吸光值。

1.2.5 免疫血清不同亞型抗體與納米抗體溫度穩(wěn)定性測(cè)定

將純化的各亞型IgG及納米抗體分別在25、37、50、60、70、80和90℃水浴孵育0.5 h，平衡到室溫，在96孔板上包被1 μg/mL各抗原，加入稀釋至5 μg/mL的各亞型IgG及納米抗體，通過(guò)ELISA測(cè)定其剩余結(jié)合活性大小。二抗分別為羊抗美洲駝IgG(H&L)-HRP抗體和鼠抗His-HRP，加入顯色底物TMB，在酶標(biāo)儀中測(cè)定450 nm 吸光值。

采用ELISA測(cè)定各抗體在不同溫度處理下剩余抗原結(jié)合活性，每組設(shè)立3個(gè)平行重復(fù)孔，以室溫(25℃)處理后的結(jié)合值作為100%結(jié)合對(duì)照，計(jì)算每組重復(fù)測(cè)定樣品的平均吸光度值，計(jì)算各抗體的相對(duì)剩余結(jié)合活性：RT Binding =(OD450heat treated/ OD45025℃treated)×100%。

2 結(jié)果與分析

2.1 新疆雙峰駝免疫血清效價(jià)的測(cè)定

采用ELISA測(cè)定溶菌酶、蒜氨酸酶和spaA 3種抗原第5次免疫駱駝的血清抗體效價(jià)。在最后1次(5次)免疫后，3種抗原均能激發(fā)明顯的抗體反應(yīng)，抗體效價(jià)均在1∶10 000以上。圖1

圖1 溶菌酶、蒜氨酸酶和spaA第5次免疫雙峰駝抗體效價(jià)

Fig.1 Camel serum titers of immunization with lysome，alliinase and spaA

2.2 血清IgG抗體不同亞型的分離和純化

基于駱駝IgG1、IgG2和IgG3與蛋白G和蛋白A的不同結(jié)合條件，通過(guò)蛋白G+A進(jìn)行分離。還原條件下 SDS-PAGE顯示經(jīng)蛋白G+A純化后，先后洗脫獲得3種不同分子量的 IgG 抗體，分別為43 KD(重鏈)的IgG3，50 KD(重鏈)和25KD(輕鏈)的IgG1和46 KD(重鏈)的IgG2，與Hamers-Casterman[1]報(bào)道的大小基本相符。圖2

圖2 還原條件下 SDS-PAGE 分析 protein G 和protein A 純化的雙峰駝免疫血清中 各IgG亞型

Fig.2 SDS-PAGE analysis of different IgG isotype fractions purified by protein G and protein A chromatography from immune cserum of.bactrianus under reduced condition

2.3 納米抗體的表達(dá)與純化

保存的pET30a/Lys-23，pET30a/Spa-G26和pET30a/Ali-A4三種質(zhì)粒轉(zhuǎn)化BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)菌后，挑取陽(yáng)性轉(zhuǎn)化菌，在0.2 mmol/mL IPTG誘導(dǎo)下，三種表達(dá)菌均可以表達(dá)重組納米抗體Lys-23，Spa-G26和Ali-A4。大量誘導(dǎo)表達(dá)后，在Ni柱親和層析中均獲得了較高純度的納米抗體，3種納米抗體表觀分子量在28Kd(Lys-23和Spa-G26)和23Kd(Ali-A4)附近，與預(yù)期大小相符。圖3

圖3 SDS-PAGE 分析采用Ni離子親和色譜純化BL21菌表達(dá)的3種納米抗體Lys-23，Spa-G26和Ali-A4

Fig.3 SDS-PAGE analysis of purified nanobodies of Lys-23 ,Spa-G26 and Ali-A4 by Ni ion affinity chromatography fromE.coliBL21(DE3)

2.4 免疫血清不同亞型抗體和對(duì)應(yīng)納米抗體溫度穩(wěn)定性的比較

研究表明，3種納米抗體都表現(xiàn)出較高的溫度穩(wěn)定性，其中納米抗體Lys-23 和Spa-G26即使在90℃處理下，仍然保留90%的結(jié)合活性。而納米抗體Ali-A4穩(wěn)定性稍差，90℃處理下，可以保留50%的結(jié)合活性。對(duì)于3種抗原特異的IgG1常規(guī)抗體來(lái)說(shuō)，對(duì)溫度的敏感性表現(xiàn)出一致性。在60℃溫度處理下，抗原結(jié)合活性只有50%或更低，而在更高溫度下處理，抗原結(jié)合活性下降很快。在80℃以上，只有10%的結(jié)合活性。對(duì)于IgG2和IgG3重鏈抗體來(lái)說(shuō)，在60℃以上的溫度處理下，其抗原結(jié)合活性比IgG1常規(guī)抗體明顯要高，其中，IgG3似乎比IgG2對(duì)溫度更穩(wěn)定。但不同的抗原特異的重鏈抗體，其溫度敏感性具有較多差異。在實(shí)驗(yàn)中，溶菌酶特異的IgG2和IgG3重鏈抗體具有更高的穩(wěn)定性，而蒜氨酸酶結(jié)合的IgG2和IgG3重鏈抗體的穩(wěn)定性較低。另外，在測(cè)定的3個(gè)納米抗體溫度穩(wěn)定性中，2個(gè)納米抗體Lys-23 和Spa-G26在80℃處理下，表現(xiàn)出比室溫更高的結(jié)合活性，其相對(duì)剩余結(jié)合活性分別為105%和110%.顯示出這2個(gè)納米抗體極高的溫度耐受性。圖4

圖4 不同亞型抗體和對(duì)應(yīng)納米抗體溫度穩(wěn)定性的比較

Fig.4 Comparison of thermal stability among nanobodies，conventional antibodies and HCAbs

3 討 論

通過(guò)親和色譜方法分離和純化得到雙峰駝免疫血清中的IgG1、IgG2和IgG3 3種亞型抗體，采用這些抗體和原核表達(dá)純化得到的相應(yīng)納米抗體，首次全面比較了同一抗原結(jié)合的重鏈抗體、常規(guī)抗體和納米抗體在溫度穩(wěn)定性方面的差異。在3種抗體類(lèi)型中，納米抗體具有最高的溫度穩(wěn)定性，重鏈抗體與常規(guī)抗體相比具有一定的溫度穩(wěn)定性，而由重鏈和輕鏈組成的常規(guī)抗體對(duì)較高溫度的耐受性較差。

經(jīng)典的IgG抗體由2條相同的重鏈(H)和2條相同的輕鏈(L)組成，由H鏈和L鏈的可變區(qū)(V)共同構(gòu)成抗體的抗原結(jié)合位區(qū)。在B細(xì)胞的成熟過(guò)程中，通過(guò)克隆選擇和VDJ重排以及體細(xì)胞突變和親和力成熟等機(jī)制，形成了高度多樣性的抗體庫(kù)(repertoire)。盡管這個(gè)過(guò)程在不同脊椎動(dòng)物有所不同，但最后都組裝形成H2L2結(jié)構(gòu)的雙價(jià)分子，顯示出IgG結(jié)構(gòu)在進(jìn)化中的高度穩(wěn)定性。HCAbs大約在2 500萬(wàn)年前才在駱駝科出現(xiàn)，屬于進(jìn)化上較新的事件[9]。與常規(guī)抗體由12個(gè)免疫球蛋白折疊域(immunoglobulin fold domains)組成結(jié)構(gòu)不同，HCAbs只包含6個(gè)免疫球蛋白折疊域，而納米抗體僅有1個(gè)免疫球蛋白折疊域。因此，在應(yīng)對(duì)溫度等變性條件時(shí)，理論上具有較少折疊形式的蛋白片段具有更高的耐受性。本研究取得的試驗(yàn)結(jié)果支持該假說(shuō)。圖5

圖5 常規(guī)抗體和重鏈抗體結(jié)構(gòu)域比較

Fig.5 Comparison of immunoglobulin fold domainsbetween conventional and heavy-chain antibodies

以往對(duì)駱駝抗體穩(wěn)定方面的研究主要集中在納米抗體上，很少開(kāi)展針對(duì)HCAbs穩(wěn)定方面的研究。抗體穩(wěn)定性除了與免疫球蛋白折疊域數(shù)量相關(guān)外，還受Fc結(jié)構(gòu)、鉸鏈長(zhǎng)度、鏈間和鏈內(nèi)二硫鍵、可變區(qū)CDR序列的影響[10-18].通常情況下，抗體在高于65 ℃溫度下就會(huì)喪失變性后的可逆性復(fù)性作用[12-13]，檢測(cè)的駱駝IgG1符合多數(shù)抗體的復(fù)性特征。而對(duì)于駱駝HCAbs，在檢測(cè)的溶菌酶和spaA2種抗原特異的IgG2和IgG3重鏈抗體中，其在65℃溫度下的耐受性表現(xiàn)與常規(guī)抗體不一樣，而與其對(duì)應(yīng)的納米抗體一致。另外，在試實(shí)驗(yàn)中，IgG3具有比IgG2更高的溫度穩(wěn)定性趨勢(shì)，這可能與2種抗體鉸鏈長(zhǎng)短不同有關(guān)。IgG3屬于短鉸鏈抗體，只有12個(gè)氨基酸，而IgG2擁有由36個(gè)氨基酸組成的長(zhǎng)鉸鏈。因此，從鉸鏈長(zhǎng)度來(lái)看，IgG3比IgG2在變性條件下更容易復(fù)性。納米抗體溫度穩(wěn)定性的機(jī)制主要有二相穩(wěn)態(tài)和疏水內(nèi)核等學(xué)說(shuō)[19-22]。對(duì)于納米抗體來(lái)說(shuō)，其小分子和單域?qū)傩允瞧淠褪軠囟鹊闹饕獧C(jī)制[23]，然而并不是所有的納米抗體都具有很好的溫度穩(wěn)定性。在以往研究的多個(gè)納米抗體中，大約有1/3在高于65 ℃處理下，不具有可逆的復(fù)性活性，最近Kunz P等[15]通過(guò)對(duì)近70個(gè)納米抗體的溫度穩(wěn)定性研究中也發(fā)現(xiàn)有相當(dāng)數(shù)量的納米抗體在65 ℃處理下發(fā)生了不可逆的聚集。2個(gè)納米抗體Lys-23 和Spa-G26即使在90℃處理下，仍然保留90%的結(jié)合活性，具有極高的溫度穩(wěn)定性。而納米抗體Ali-A4穩(wěn)定性稍差，在65℃下，大約可以保留70%的結(jié)合活性。這些差異可能與這些納米抗體中的二硫鍵有關(guān)。Govaert J[18]對(duì)二硫鍵在納米抗體中的作用進(jìn)行的研究表明，鏈內(nèi)二硫鍵具有穩(wěn)定納米抗體結(jié)構(gòu)并有助于CDR3發(fā)揮剛性結(jié)構(gòu)作用。Lys-23 和Spa-G26都具有一對(duì)鏈內(nèi)二硫鍵，而Ali-A4不具有鏈內(nèi)二硫鍵。其穩(wěn)定性符合二硫鍵在納米抗體中的作用。

4 結(jié) 論

駱駝抗體中的重鏈抗體、常規(guī)抗體和納米抗體在對(duì)高溫條件的變性作用下，其可逆性復(fù)性作用不盡相同，其中納米抗體由于小分子和單域?qū)傩詫?duì)溫度處理最耐受，重鏈抗體IgG2和IgG3由于減少的免疫球蛋白折疊域數(shù)量，也表現(xiàn)出一定的對(duì)高溫變性條件的耐受性，而代表常規(guī)抗體的IgG1型抗體表現(xiàn)出與其他哺乳動(dòng)物相似的對(duì)高溫變性條件的敏感性。了解這些抗體的穩(wěn)定性特征，可以為理解HCAb的功能特性和駱駝適應(yīng)極端環(huán)境的免疫特點(diǎn)提供線索。另外，在納米抗體的應(yīng)用中，穩(wěn)定性和可溶性都將影響到納米抗體的工業(yè)化生產(chǎn)和在體內(nèi)的效應(yīng)。為了延長(zhǎng)代謝時(shí)間，納米抗體通常以Fc片段連接的形式在體內(nèi)作用。