趙濱，陰亞坤

（1.河南省直第三人民醫(yī)院，河南鄭州450000；2.鄭州大學第一附屬醫(yī)院，河南鄭州450000）

皮膚黑色素瘤（Cutaneous malignant melanoma，CMM）又稱皮膚惡性黑色素瘤，是一種發(fā)生于皮膚黑色素細胞或痣細胞的惡性腫瘤，有惡性程度高、易發(fā)生遠處轉移、患者預后差、死亡率高等特點[1]。亞洲地區(qū)CMM的發(fā)病率低于歐洲、美澳等地區(qū)，但由于我國人口基數大，罹患CMM的總人數較多[2]。近年來我國CMM發(fā)病率逐年增長，且趨于年輕化[3]。目前，有關CMM發(fā)生機制尚不完全明確，因此，探究CMM發(fā)生、發(fā)展機制，對改善患者預后有重要因此意義。垂體同源框1（Pituitary homeobox 1，PITX1）作為一種轉錄因子，參與抑制細胞中端粒逆轉錄酶的轉錄激活，影響細胞增殖和細胞分化[4]。研究表明，PITX1在腫瘤細胞中表達下調或基本不表達，引起Ras等癌基因異常表達，導致腫瘤細胞異常增殖[5]。因此本研究采用免疫組織化學法檢測CMM組織和正常皮膚組織中PITX1的表達情況，以探討PITX1表達與CMM臨床病理特征及預后的相關性。

1 資料與方法

1.1 一般資料

1.1.1 臨床資料 回顧性分析2012年1月—2014年2月我院診治的43例CMM患者臨床資料，均經組織病理學檢查確診為CMM。其中男25例，女18例；平均年齡（55.47±13.51）歲。按照Clark分級標準對CMM腫瘤細胞浸潤皮膚的深度進行判斷[6]，按照美國癌癥分期聯合會制定的第7版TNM分期系統(tǒng)對CMM病理分化進行分期[7]。

納入標準：①首次確診為CMM患者；②經病灶切除活檢確診為CMM患者；③均具備完整的病例資料。

排除標準：①排除CMM復發(fā)患者；②術前行放化療或合并其它惡性腫瘤轉移患者；③排除確診前治療情況不明患者；④合并皮膚病或免疫缺陷疾病，合并糖尿病、高血壓、冠心病等其他疾病患者；⑤排除眼脈絡膜、口鼻腔等部位的黏膜黑色素腫瘤患者；⑥排除臨床或隨訪資料不完整患者。

選取同期在因外傷在本院進行整形手術的皮膚正?；颊?7例作為對照，其中男21例，女16例，平均年齡（53.14±14.80）歲，均未合并皮膚病、心腦血管疾病、糖尿病、其他惡性腫瘤轉移等。2組患者一般資料比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），有可比性。本研究經醫(yī)院倫理委員會審查并批準，標本的采集、研究過程均不違背赫爾辛基宣言。見表1。

表1 CMM患者一般資料 例

1.1.2 主要試劑與儀器 Trizol試劑，購自Invitrogen公司；AceQ qPCR SYBR?Green Mix，購自上海英駿生物公司；一抗（anti-PITX1）、二抗、免疫組化SP試劑盒及蘇木素染色劑，購自福建邁新生物公司；qRT-PCR儀，MJ RESEARCH-MiniCycler；超低溫冰箱：海爾；普通光學顯微鏡，購自日本Olympus公司；石蠟切片機等，購自德國MICROM公司，等。

1.2 方法

1.2.1 標本采集 均于術中收集皮膚組織，做好標記，切成小塊（1.0×1.0×1.0 cm3/塊），置于10%甲醛溶液中固定，制備石蠟切片。

1.2.2 免疫組織化學法檢測PITX1表達 石蠟切片進行脫蠟、水化處理，采用免疫組化法檢測PITX1蛋白水平，嚴格按照操作說明進行實驗。①加入0.3%H2O2，孵育20 min；②修復組織；③加入PITX1一抗抗體稀釋液，1∶200，4℃冰箱內過夜反應；④磷酸鹽緩沖液（PBS）沖洗3次，10 min/次；⑤加入稀釋后帶有生物素標記的二抗（1∶2 300），常溫環(huán)境中孵育40 min；⑥PBS沖洗3次，加入鏈霉素抗生物蛋白-過氧化物酶溶液，常溫環(huán)境中孵育30 min；⑦PBS沖洗3次，加入二氨基聯苯胺（DAB）試劑，直至顯色至預期深淺；⑧加入哈瑞（Harris）蘇木素染色劑進行免疫熒光染色；⑨進行梯度脫水、透明處理，中性膠封片。采用光學顯微鏡下分析染色結果。

PITX1染色結果判斷：每張切片隨機選取10個高倍鏡視野（×200）進行觀察，陽性染色表現為細胞核中出現黃色或棕黃色顆粒，采用評分方法：①按細胞的染色程度分級評分：未著色計0分，呈淺黃色計1分，呈棕黃色計2分，呈棕褐色計3分；②按陽性細胞面積/陰性細胞面積比值進行評分：≤10%的視野計1分，11%～50%的視野計2分，51%～75%的視野計3分，＞75%的視野計4分。采用積分法，最終得分=染色得分×（陽性細胞面積/陰性細胞面積比值），對染色結果進行判定：1～3分評定為陰性或弱陽性，記作“-”；＞3分評定為陽性，記作“+”。染色結果由2位資深病理師判定。

1.2.3 隨訪 電話隨訪3年，隨訪截止時間：2017年4月30日，以死亡為隨訪終止。

1.3 統(tǒng)計學分析 計量資料以均數±標準差表示，2組間比較采用t檢驗；計數資料采用率表示，2組間比較使用卡方檢驗；采用Log-rank檢驗比較PITX1不同表達水平患者的生存率差異，借助GraphPad Prism繪制Kaplan-Meier生存曲線；CMM患者預后的獨立危險因素采用COX回歸模型分析。當P＜0.05時表示差異有統(tǒng)計學意義。采用SPSS 22.0進行統(tǒng)計學分析。

2 結果

2.1 不同皮膚組織中PITX1蛋白表達情況 免疫組化結果顯示，PITX1蛋白位于組織細胞核，陽性染色呈棕黃色見圖1 A。CMM患者皮膚組織中PITX1陽性表達率為25.58%，顯著低于正常皮膚組織中PITX1陽性表達率97.30%，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見表2。

圖1 PITX1蛋白在不同皮膚組織中的表達情況（免疫組織化學法染色×200）

表2 不同皮膚組織中PITX1蛋白表達水平比較結果 例

2.2 PITX1表達與CMM患者臨床參數之間的關系PITX1相對表達水平與患者腫瘤潰瘍情況、壞死情況、Breslow厚度、Clark分級、TNM分期、淋巴結轉移等有關，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），PITX1蛋白陽性患者與陰性患者年齡、性別對比差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表3。

表3 PITX1表達與患者臨床參數之間的關系 例

2.3 PITX1表達與患者生存率之間的關系 PITX1表達陽性者3年存活率為90.91%（10/11），顯著高于PITX1表達陰性者3年存活率46.88%（16/32），差異有統(tǒng)計學意義（χ2=0.022，P＜0.05）。見圖2。

圖2 PITX1表達與患者生存率之間的關系

2.4 影響CMM患者預后的COX單因素分析 本研究將患者PITX1表達、性別、年齡、腫瘤潰瘍狀態(tài)、壞死情況、Breslow厚度、Clark分級、TNM分期、淋巴結轉移等因素，納入影響CMM患者預后COX回歸分析模型。單因素分析發(fā)現，PITX1表達、腫瘤壞死情況、Clark分級、TNM分期、淋巴結轉移均是影響CMM患者預后的危險因素。見表4。

2.5 影響CMM患者預后的COX多因素分析 以CMM患者死亡為因變量，將2.4中差異顯著的5個因素PITX1表達、壞死情況、Clark分級、TNM分期、淋巴結轉移作為自變量，COX多因素分析顯示，TNM分期、PITX1表達是影響患者死亡的獨立危險因素。見表5。

表4 影響皮膚患者預后COX單因素分析結果

表5 影響皮膚患者預后COX多因素分析結果

3 討論

黑色素瘤是一種惡性程度較高的腫瘤，在亞洲人群中，約50%～70%黑色素瘤原發(fā)于皮膚。近年來，隨著醫(yī)療檢測水平的提高，我國CMM的發(fā)病率逐年增加，每年增加高達2萬例以上[8]。晚期CMM出現病灶局部浸潤和遠處轉移，嚴重影響擴大切除術治療療效，對免疫療法和放化療耐受，患者死亡率較高[9]。因此，探索CMM的發(fā)病機制，尋找有效生物分子標記，可為CMM的臨床治療提供新思路。

腫瘤發(fā)病機制復雜，遺傳、環(huán)境等因素均可影響其發(fā)病。有研究指出，機體接觸致癌物后，某一細胞在基因水平上生長調控失常，使細胞增殖與凋亡出現異常，導致細胞惡化，從而引發(fā)癌變[10]。PITX1位于是一種與黑素細胞皮質素原基因表達有關的基因，參與肢體發(fā)育過程[11]。研究發(fā)現，PITX1作為一種特殊的轉錄調節(jié)因子，不僅有抑制細胞中端粒逆轉錄酶轉錄激活，影響細胞增殖和細胞分化的作用，而且有抑制癌基因Ras轉錄活性的作用[12]，提示PITX1可能參與腫瘤的發(fā)生過程。Libório等[13]采用原位雜交技術檢測發(fā)現，PITX1在口腔鱗狀細胞癌組織中表達下調，與腫瘤惡性程度有關。何文武等[14]發(fā)現，非小細胞肺癌組織PITX1基因陽性表達率為24.18%，明顯低于良性肺組織PITX1基因陽性表達率66.67%，且與腫瘤組織分化和淋巴結轉移情況有關，推測PITX1可能參與非小細胞肺癌的發(fā)生和發(fā)展，表明PITX1可能作為抑癌基因參與惡性腫瘤的發(fā)病過程。本研究對43例CMM患者皮膚組織標本進行檢測，發(fā)現僅有11例PITX1表達陽性者，陽性表達率為25.58%，顯著低于正常皮膚組織中PITX1陽性表達率97.30%，表明PITX1在CMM組織中表達下調，與Osaki等[15]發(fā)現一致，提示PITX1可能作為抑癌基因參與CMM的發(fā)生，與PITX1在其他惡性腫瘤中作用模式一致。進一步研究發(fā)現，有淋巴結轉移、有潰瘍發(fā)生和有壞死情況的患者PITX1表達陽性率顯著低于無淋巴結轉移、無潰瘍發(fā)生和無壞死情況的患者；PITX1在腫瘤組織中陽性表達率隨患者TNM分期、Clark分級及Breslow厚度的升高而逐漸降低，表明PITX1表達與患者TNM分期、Clark分級、Breslow厚度、淋巴結轉移、潰瘍狀態(tài)和壞死情況有關，提示PITX1參與CMM疾病的發(fā)展，與疾病的惡性程度有關。

CMM的診斷和治療方法雖取得一定進步，但死亡率仍較高[16]。因此，尋找有效生物標志物判斷CMM患者預后情況，對指導臨床治療有一定意義。Kn?sel等[17]發(fā)現，PITX1在結直腸癌腫瘤組織中表達下調，與患者生存期縮短獨立相關，可作為判斷預后的指標。Nakabayashi等[18]發(fā)現，PITX1低表達的口腔上皮發(fā)育不良患者惡性轉化的發(fā)生率顯著高于PITX1高表達患者，可作為預測口腔上皮異常增生預后的生物標志物。Kong等[19]發(fā)現，PITX1在骨肉瘤組織中相對表達量顯著低于正常骨組織，其表達水平與骨肉瘤患者的生存時間、肺轉移密切相關，進一步分析發(fā)現，PITX1高表達是骨肉瘤患者預后的有利因素。Takenobu等[20]發(fā)現，頭頸鱗狀細胞癌患者中PITX1高表達者的化療有效率明顯高于PITX1低表達者，提示PITX1表達可作為預測多種惡性腫瘤預后情況的生物標志。本研究發(fā)現PITX1陽性表達的CMM患者3年存活率顯著高于PITX1表達陰性者3年存活率。本研究發(fā)現發(fā)現，PITX1表達、腫瘤壞死情況、Clark分級、TNM分期、淋巴結轉移均是影響CMM患者死亡的危險因素。將PITX1表達、壞死情況、Clark分級、TNM分期、淋巴結轉移作為自變量，以患者死亡為因變量，COX多因素分析結果，PITX1表達、TNM分期是影響患者預后的獨立危險因素。表明PITX1低表達是影響CMM患者的生存率下降的重要因素，是導致CMM患者死亡的獨立危險因素。據此推測，檢測CMM組織中PITX1表達情況可用于評估患者預后。

綜上所述，PITX1在CMM患者中低表達，與CMM患者TNM分期、Clark分級、Breslow厚度、淋巴結轉移、潰瘍狀態(tài)和壞死情況有關，對患者3年生存率有一定影響。推測PITX1表達水平可用于評估CMM惡性程度和患者預后，為有效的生物標志物。