謝 穎，金志紅，朱 靖，韓兆玉

（1.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，南京 210095；2.江蘇神力特生物科技股份有限公司，盱眙 211700）

在奶牛泌乳早期，由于產(chǎn)奶量的增加和采食量的限制，機(jī)體必須分解體內(nèi)脂質(zhì)來保持營養(yǎng)平衡，從而導(dǎo)致奶牛的能量負(fù)平衡，進(jìn)而導(dǎo)致奶牛脂肪肝的發(fā)生。同理，泌乳后期奶牛的營養(yǎng)過剩，將導(dǎo)致肥胖和高膽固醇血癥[1]。高膽固醇水平可降低泌乳效率，給肝臟帶來過氧化損傷[2]。因此，在奶牛生產(chǎn)中，降低其血液膽固醇水平，提高抗氧化能力極具重要意義。

植物甾醇(phytosterol, PS)是一種結(jié)構(gòu)與膽固醇相似的甾體化合物，其不能在動(dòng)物或人體內(nèi)合成，卻廣泛存在于蔬菜產(chǎn)品以及油、豆類、谷物和干果中[3,4]。研究表明，植物甾醇在降低血液膽固醇水平中起著重要作用[5]。另一方面，植物甾醇可用作動(dòng)植物的抗氧化劑[6]。當(dāng)機(jī)體補(bǔ)充分離的植物甾醇時(shí)，能夠顯著降低肝臟脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物和血漿丙二醛(malondialdehyde,MDA)水平[7]。此外，也有研究顯示植物甾醇具有抗炎特性，可作為免疫調(diào)節(jié)劑[8]。也有研究證實(shí)，植物甾醇對(duì)結(jié)腸癌、乳腺癌和前列腺癌等的癥狀改善具有積極作用[9,10]。

然而，關(guān)于植物甾醇在反芻動(dòng)物中的使用和其在瘤胃環(huán)境中的生理作用的報(bào)道很少。因此，本試驗(yàn)通過在日糧中添加植物甾醇，探討植物甾醇對(duì)奶牛的產(chǎn)奶性能、血液膽固醇和抗氧化能力的影響，為降低奶牛血液膽固醇水平和發(fā)掘潛在的抗氧化劑提供生產(chǎn)依據(jù)。

1 材料與方法

1．1 試驗(yàn)材料

本試驗(yàn)使用的植物甾醇于市場購得，其純度約91%，其中含谷甾醇40.95%、菜油甾醇24.57%、豆甾醇21.84%、菜籽甾醇3.64%。植物甾醇呈白色粉末狀，不溶于水，微溶于油。

1．2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與飼養(yǎng)管理

本試驗(yàn)選取33頭中國荷斯坦牛作為研究對(duì)象（27頭初產(chǎn)牛和6頭經(jīng)產(chǎn)牛），根據(jù)年齡、胎次、泌乳天數(shù)和產(chǎn)奶量相近的原則進(jìn)行配對(duì)，隨機(jī)分為3組，即對(duì)照組、試驗(yàn)Ⅰ組、試驗(yàn)Ⅱ組。對(duì)照組飼喂牛場TMR，試驗(yàn)Ⅰ、Ⅱ組在對(duì)照組日糧基礎(chǔ)上分別添加200mg/d、800mg/d的植物甾醇。牛場TMR中植物甾醇平均含量≤20mg/d。每天早晨一次性投喂到試驗(yàn)牛日糧中，試驗(yàn)期日糧組成及營養(yǎng)水平如表1所示。

表1 日糧組成及營養(yǎng)水平（干物質(zhì)基礎(chǔ)）

試驗(yàn)在江蘇省某奶牛場進(jìn)行，預(yù)試期7d，試驗(yàn)期50d。試驗(yàn)?zāi)膛２捎盟┫凳斤曫B(yǎng)，統(tǒng)一管理。試驗(yàn)期間奶牛每天飼喂三次，擠奶三次，自由飲水。

試驗(yàn)動(dòng)物的飼養(yǎng)和管理，按照我國的法律法規(guī)以及《南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物條例》執(zhí)行，并符合國際上公認(rèn)的動(dòng)物飼養(yǎng)原則和農(nóng)業(yè)實(shí)驗(yàn)室指導(dǎo)方針。

1．3 樣品的采集

每周三下午14:30采集奶樣品（每個(gè)樣品50mL），與重鉻酸鉀混合后置于4℃保存。試驗(yàn)期間的第10、30、50天，進(jìn)行尾靜脈采血（10mL），靜置1h后，經(jīng)4 000r/min離心20min，收集血清在-20℃保存待測(cè)。

1．4 產(chǎn)奶量及乳品質(zhì)指標(biāo)測(cè)定

每周測(cè)定兩次每頭奶牛產(chǎn)奶量；取50mL混合奶樣（早∶中∶晚= 4 : 3 : 3），使用全自動(dòng)乳成分分析儀進(jìn)行乳品質(zhì)測(cè)定。測(cè)定指標(biāo)有乳脂率、乳蛋白率、乳糖含量、乳總固體含量、體細(xì)胞數(shù)和乳尿素氮濃度。

1．5 血清指標(biāo)測(cè)定

測(cè)定指標(biāo)有：總膽固醇、高密度脂蛋白膽固醇、低密度脂蛋白膽固醇、游離脂肪酸、雌激素、生長激素、谷草轉(zhuǎn)氨酸、丙二醛、超氧化物歧化酶、谷胱甘肽過氧化物酶、脂蛋白脂酶、肝酯酶。

1．6 統(tǒng)計(jì)與分析

試驗(yàn)所得數(shù)據(jù)經(jīng) Excel 初步處理后，用SPSS 20.0進(jìn)行顯著性統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示。

2 結(jié)果與分析

2．1 植物甾醇對(duì)產(chǎn)奶量及乳品質(zhì)的影響

由表2可知，各組間乳脂率、乳蛋白率、乳糖含量、無脂固形物含量、總固形物含量、體細(xì)胞數(shù)無顯著差異(P＞0.05)；試驗(yàn)Ⅰ組平均產(chǎn)奶量比對(duì)照組高出1.71kg/d（P＜0.05），而試驗(yàn)Ⅱ組平均產(chǎn)奶量與對(duì)照組相比沒有顯著性差異（P＞0.05）。結(jié)果表明，日糧中添加適量的植物甾醇可顯著提高奶牛的產(chǎn)奶量，但對(duì)乳品質(zhì)沒有顯著性影響。

表2 植物甾醇對(duì)產(chǎn)奶量及乳品質(zhì)的影響

2．2 植物甾醇對(duì)血液膽固醇及激素的影響

表3 植物甾醇對(duì)血漿膽固醇和激素水平的影響

由表3可知，試驗(yàn)Ⅰ、Ⅱ組總膽固醇（TC）、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C )和低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）含量均低于對(duì)照組。試驗(yàn)期間各時(shí)間點(diǎn)試驗(yàn)I組TC含量均顯著低于對(duì)照組。試驗(yàn)Ⅱ組第10天TC極顯著低于對(duì)照組（P＜0.01）。試驗(yàn)Ⅰ組HDL-C含量在第30天極顯著低于對(duì)照組（P＜0.01），試驗(yàn)Ⅱ組第50天顯著低于對(duì)照組（P＜0.05）。試驗(yàn)Ⅰ組LDL-C在第30天（P＜0.05）、第50天（P＜0.01）低于對(duì)照組，試驗(yàn)Ⅱ組LDL-C僅在第10天低于對(duì)照組（P＜0.01）。試驗(yàn)兩組的游離脂肪酸(NEFA)含量在第10、50天極顯著高于對(duì)照組（P＜0.01）。試驗(yàn)Ⅱ組雌激素（E2）含量顯著低于對(duì)照組（P＜0.05）。試驗(yàn)兩組生長激素（GH）水平與對(duì)照組相比無顯著性差異（P＞0.05）。結(jié)果表明，日糧中添加適量的植物甾醇可顯著降低TC、HDL-C、LDL-C和E2水平，但極顯著提高NEFA的含量。

2．3 植物甾醇對(duì)酶活性的影響

由表4可知，試驗(yàn)Ⅱ組超氧化物歧化酶（SOD）各時(shí)間點(diǎn)活性均高于對(duì)照組。試驗(yàn)兩組谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）活性均不同程度高于對(duì)照組。各組間丙二醛（MDA）含量無顯著性差異（P＞0.05）。試驗(yàn)Ⅱ組谷草轉(zhuǎn)氨酶（GOT）含量在第10天顯著高于對(duì)照組（P＜0.05）。試驗(yàn)兩組脂蛋白酯酶(LPL)含量在第50天極顯著低于對(duì)照組（P＜0.01）。試驗(yàn)兩組肝酯酶(HL)含量顯著低于對(duì)照組（第10天P＜0.01，第50天P＜0.05）。結(jié)果表明，植物甾醇可增加SOD和GSHPx的活性。

表4 植物甾醇對(duì)酶活性的影響

3 討論

3．1 植物甾醇對(duì)產(chǎn)奶量及乳品質(zhì)的影響

奶牛的產(chǎn)奶量受日糧中營養(yǎng)物質(zhì)的組成與含量的影響。植物甾醇能提高動(dòng)物對(duì)日糧中氮和蛋白質(zhì)的利用率。Hristov等[11]指出，干物質(zhì)采食量（DMI）在提高奶牛產(chǎn)奶量中起主導(dǎo)作用，且奶牛泌乳的發(fā)動(dòng)與維持由催乳素（PRL）及其他多種激素調(diào)控[12]，呂潤全等[13]研究證明，蛋白質(zhì)的利用率與乳蛋白質(zhì)合成率的增高可促進(jìn)PRL的分泌，從而使泌乳量增加，且植物甾醇與類固醇激素在結(jié)構(gòu)上相似，則可能協(xié)同PRL促進(jìn)機(jī)體泌乳。本研究發(fā)現(xiàn)，在飼料組成成分相同的奶牛日糧中添加適量的植物甾醇，可顯著提高奶牛的產(chǎn)奶量。謝心美[14]等研究發(fā)現(xiàn)，添加不同水平植物甾醇（200、400和800mg/d）均可使奶牛產(chǎn)乳量增高，這與本試驗(yàn)研究結(jié)果一致。

除品種、年齡、飼養(yǎng)管理因素外，飼料營養(yǎng)成分也是影響乳成分組成的重要因素[15]，乳品質(zhì)的高低與乳成分的組成密切相關(guān)，梁辛[16]等研究發(fā)現(xiàn)，添喂不同水平的植物甾醇可不同程度提高泌乳水牛乳蛋白率、乳脂率、總固形物率、非脂乳固體率、乳糖率，但各組無明顯的差異，這與本試驗(yàn)研究結(jié)果相一致，本研究發(fā)現(xiàn)在日糧中添加植物甾醇，乳成分沒有顯著性變化，乳脂和乳蛋白比率在一個(gè)合理的范圍內(nèi)。牛奶體細(xì)胞數(shù)是反映奶牛產(chǎn)奶量和乳品質(zhì)的重要指標(biāo)，且可預(yù)測(cè)奶牛乳房炎發(fā)病率[17]，本研究發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，試驗(yàn)組牛奶體細(xì)胞數(shù)(SCC)雖無顯著差異，但有明顯下降趨勢(shì)。因此，日糧中添加一定量的植物甾醇可顯著提高奶牛的產(chǎn)奶量，且不會(huì)顯著性降低乳品質(zhì)。

3．2 植物甾醇對(duì)血液膽固醇及激素的影響

泌乳晚期的奶牛通常會(huì)營養(yǎng)過剩，導(dǎo)致血漿或肝臟中的膽固醇濃度升高，進(jìn)而影響奶牛健康和引起降低泌乳效率的疾病，并且在奶牛分娩后容易產(chǎn)生脂肪肝，抑制卵巢活動(dòng)，進(jìn)而影響繁殖性能。研究表明[18]，膽固醇和植物甾醇的代謝與脂質(zhì)有關(guān)，在瘤胃發(fā)酵過程中，微生物可以將不飽和脂肪酸氫化并轉(zhuǎn)化為飽和脂肪酸。Moreau等[19]證實(shí)大多數(shù)植物甾醇具有一個(gè)或兩個(gè)C-C雙鍵，常以共軛形式出現(xiàn)，其中3β-羥基團(tuán)可以被酯化成脂肪酸或羥基肉桂酸，也可以與葡萄糖或6-脂肪酸?；禾前l(fā)生糖基化反應(yīng)。在瘤胃發(fā)酵過程中，植物固醇可以通過第5位的雙鍵氧化而轉(zhuǎn)化為植物甾醇。然而，Heinemann等[20]研究發(fā)現(xiàn)，植物甾醇和植物甾醇酯(PSE)比植物固醇能更有效抑制膽固醇的吸收，且植物甾醇的攝入不僅干擾膽固醇的吸收，還影響血清甾醇的吸收，同時(shí)能降低血清中LDL-C水平。

本研究結(jié)果顯示，在日糧中添加一定量的植物甾醇可使血液中TC、HDL-C和LDL-C的含量顯著下降，而TG的含量有所升高。Hallikainen等[21]研究報(bào)道，商用降膽固醇散劑和富含甾醇補(bǔ)充劑每天推薦攝入量為300mg。Gylling等[22]研究發(fā)現(xiàn)，2g植物甾醇可以明顯降低8%～10% LDL-C濃度。顧莞婷等[23]研究表明，添加植物甾醇均降低了肉鴨血漿中TC和LDL-C的含量，且添加量為20mg/kg時(shí)，達(dá)到顯著性水平，這與本研究結(jié)果相似，本試驗(yàn)在日糧中添加適量的植物甾醇可降低血液膽固醇及其相關(guān)代謝激素的含量。

NEFA是機(jī)體一種重要的能量物質(zhì)，能夠通過氧化釋放比血漿葡萄糖更多的能量。通常血液中葡萄糖濃度變化很小，但NEFA含量每小時(shí)的變化卻很大，這可以反映動(dòng)物的營養(yǎng)狀態(tài)和體力活動(dòng)。本研究表明每天補(bǔ)充200mg、800mg植物甾醇可使NEFA的含量極顯著增高。

植物甾醇屬于甾體化合物，化學(xué)結(jié)構(gòu)與雌激素類似，具備類激素活性。本研究發(fā)現(xiàn)，試驗(yàn)兩組E2含量顯著低于對(duì)照組，但GH水平均無顯著性差異，結(jié)果表明，植物甾醇具有雌激素作用，但對(duì)GH的活性沒有影響。Nakari等[24]研究表明，植物甾醇對(duì)動(dòng)物的生殖系統(tǒng)功能有一定影響。有研究者[25]補(bǔ)充報(bào)道說明，植物甾醇對(duì)機(jī)體生理影響特別是在雌激素效應(yīng)方面的影響更顯著。也有研究證實(shí)[26～27]，β-谷甾醇可以在動(dòng)物體內(nèi)積累，還可以改變?nèi)祟惻c生殖相關(guān)的固醇類激素水平。據(jù)報(bào)道[7]，β-谷甾醇和β-谷甾醇葡萄糖可以刺激雌激素依賴性人乳腺癌細(xì)胞的生長，無卵巢及胸腺的小鼠攝取β-谷甾醇能抑制E2對(duì)人乳腺癌細(xì)胞（MCF-7）腫瘤生長的誘導(dǎo)；另外，植物甾醇可使血漿E2水平下降，在0.001～100mol/L的濃度范圍內(nèi)，豆甾醇不影響MCF-7細(xì)胞的增殖，而且每種植物甾醇具有的雌激素效應(yīng)有所差別。因此，植物甾醇可能通過調(diào)節(jié)分泌模式與激素分泌相關(guān)，在不同情況下表現(xiàn)出雌激素或抗雌激素的作用。

3．3 植物甾醇對(duì)酶活性的影響

動(dòng)物機(jī)體通常是通過體內(nèi)的酶和非酶機(jī)制消除自由基，致使體內(nèi)到達(dá)自由基穩(wěn)態(tài)，主要相關(guān)的酶為SOD和GSH-Px。自由基可引發(fā)體內(nèi)脂質(zhì)過氧化，損壞細(xì)胞完整性并致使代謝紊亂。B?singer等[28]對(duì)接受25-羥基膽固醇放射性標(biāo)記猴子的研究表明，氧化型低密度脂蛋白主要以極低密度和低密度脂蛋白形式運(yùn)輸，這可能導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化性疾病。Pie等[29]認(rèn)為膽固醇的氧化產(chǎn)物能引起動(dòng)脈硬化性病變或壞死，并抑制細(xì)胞生長。

本研究發(fā)現(xiàn)，植物甾醇能夠增強(qiáng)SOD和GSH-Px的活性。試驗(yàn)Ⅱ組第10、30天SOD極顯著高于對(duì)照組，第50天明顯高于對(duì)照組。試驗(yàn)組GSH-Px在試驗(yàn)第30、50天時(shí)顯著高于對(duì)照組。各組間MDA含量無顯著性差異。Award等[10]、Gu等[30]在肉雞和肉鴨上的兩項(xiàng)研究均發(fā)現(xiàn)，每千克飼料添加40或80mg植物甾醇可明顯增加SOD活性，減少血清中TC和LDL-C含量，本研究結(jié)果與之相似。本研究表明，低水平的植物甾醇可以用作抗氧化劑來改善某些氧化酶的活性和減少其氧化產(chǎn)物，最終維持奶牛的健康并改善生產(chǎn)性能。

GOT普遍存在于各組織細(xì)胞的線粒體中，尤其是肝細(xì)胞中，其活性可反映出受損肝臟中的肝細(xì)胞壞死情況。若肝臟受損，血清中GOT活性會(huì)顯著增加。本研究發(fā)現(xiàn)，在第10天試驗(yàn)II組GOT含量顯著高于對(duì)照組，結(jié)果表明，日糧中添加植物甾醇有保護(hù)肝細(xì)胞、維持肝臟活力的作用，但是其作用機(jī)制需進(jìn)一步的研究來證實(shí)。

LPL和HL是調(diào)節(jié)脂蛋白代謝的關(guān)鍵酶。LPL是一種?；视退饷?，可以將富含甘油三酯的脂蛋白分解，包含乳糜微粒和極低密度脂蛋白（VLDL）。低活性LPL可增加血漿甘油三酯，降低從VLDL轉(zhuǎn)化而來的高密度脂蛋白膽固醇含量。HL與LPL具有一樣的功能，但它對(duì)低密度脂蛋白（LDL）的代謝具有更高的親和力。Trautwein等[31]提出，植物甾醇可以抑制脂肪酶、酯酶和其他與固醇吸收過程有關(guān)的酶活性，結(jié)果表明，膽固醇酯必須水解為游離膽固醇，才能通過某些酯酶被腸道細(xì)胞吸收。Krause等[32]通過對(duì)ACAT抑制劑對(duì)大鼠膽固醇吸收的影響的研究證明，植物甾醇可以抑制ACAT活性，從而降低腸道膽固醇攝取。本研究表明，植物甾醇可顯著降低LPL和HL的活性。Moghadasian等[33]將小鼠敲除載脂蛋白E基因，其結(jié)果與本試驗(yàn)相似，研究發(fā)現(xiàn)普羅布考和植物甾醇混合物能顯著降低LPL和HL的活性和VLDL/LDL膽固醇的濃度，但是HDL和TC的濃度無改變，揭示高密度脂蛋白含量較低導(dǎo)致LPL降低。因此，植物甾醇降低膽固醇濃度可能是由于LPL和HL活性降低所致。

4 結(jié)論

日糧中添加適量的植物甾醇有益于泌乳后期的奶牛。本研究結(jié)果表明，在奶牛日糧中添加200mg/d的植物甾醇可有效提高產(chǎn)奶量。植物甾醇還能提高某些氧化酶活性，減少氧化產(chǎn)物，這對(duì)保護(hù)奶牛肝臟的健康很重要。此外，E2的分泌也受植物甾醇的影響?？傊占Z中補(bǔ)充200mg植物甾醇對(duì)降低血液膽固醇水平至關(guān)重要，植物甾醇抗氧化劑的作用有助于維持奶牛的健康。