盧雪蘭 劉 娟 嚴(yán)景全 王春玲 藍(lán)云翠 林占洲

廣東省惠州市中心人民醫(yī)院肝病內(nèi)科 516001

肝癌是全世界最常見的惡性腫瘤之一，其具有高發(fā)、易復(fù)發(fā)、危害大等特點(diǎn)[1]，死亡率占所有惡性腫瘤死亡率的第二位[2]。目前肝癌主要采用手術(shù)聯(lián)合放化療進(jìn)行治療，術(shù)后死亡主要因肝癌復(fù)發(fā)。因此，研究肝癌術(shù)后復(fù)發(fā)的機(jī)制成為降低肝癌死亡率的重要突破口。凝集素受體是一類高特異性的糖蛋白，已有研究證實(shí)凝集素受體表達(dá)量可作為肝癌診斷的輔助標(biāo)準(zhǔn)之一[3]。此外，研究表明凝集素受體陽性可作為急性淋巴細(xì)胞性白血病的易復(fù)發(fā)標(biāo)志之一。然而，凝集素受體是否能預(yù)測肝癌復(fù)發(fā)尚不確定。C型凝集素受體12B(CLEC12B)作為凝集素受體超家族的一員，與肝癌易感性相關(guān)[4]。因此，本研究利用TCGA公共數(shù)據(jù)庫，分析CLEC12B在肝癌中的表達(dá)情況，探討CLEC12B在肝癌發(fā)生發(fā)展及預(yù)后中的作用。

1 資料和方法

1.1 資料數(shù)據(jù)來源 從TCGA官方網(wǎng)站下載數(shù)據(jù)，包括肝癌數(shù)據(jù)集的mRNA表達(dá)數(shù)據(jù)以及對應(yīng)的臨床資料數(shù)據(jù)。臨床資料包括生存時(shí)間、生存狀態(tài)、年齡；病理資料包括組織學(xué)分型、TNM分期等。TCGA肝癌數(shù)據(jù)集樣本數(shù)為424例，其中癌組織樣本374例，癌旁組織樣本50例。

1.2 數(shù)據(jù)庫篩選和分組 利用R軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行預(yù)處理，篩選生存資料完整的370例進(jìn)行相關(guān)性分析和生存分析。利用肝癌與癌旁配對樣本(50例)比較CLEC12B在癌及癌旁組織的表達(dá)。利用Survminer包計(jì)算CLEC12B表達(dá)量最佳截?cái)嘀?，并依?jù)最佳截?cái)嘀祵颖痉譃楦弑磉_(dá)組和低表達(dá)組。

1.3 基因富集分析 利用clusterProfiler包進(jìn)行基因富集分析，分析CLEC12B的表達(dá)水平對其他功能集的影響，參照基因集為h.all.v6.2.entrez.gmt數(shù)據(jù)集，設(shè)置隨機(jī)組合次數(shù)1 000次。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 所有數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計(jì)分析利用R 3.4.0完成。癌組織和癌旁組織表達(dá)量比較用單因素方差分析。生存分析采用Kaplan-Meier曲線，顯著性分析采用Log-rank檢驗(yàn)。利用Cox回歸模型分析臨床特征與肝癌預(yù)后的關(guān)系，將單因素分析中P<0.1的參數(shù)納入多因素分析。

2 結(jié)果

2.1 癌組織與癌旁組織中CLEC12B的表達(dá) 在同一個(gè)患者中，與癌旁組織相比，癌組織中CLEC12B表達(dá)量明顯較低(P<0.001)。提示肝癌的發(fā)生過程中CLEC12B表達(dá)被抑制，見圖1。

圖1 CLEC12B在配對的癌組織和癌旁組織的表達(dá)水平

2.2 CLEC12B表達(dá)量對肝癌預(yù)后的影響 將CLEC12B表達(dá)≥5.75定義為高表達(dá)組，<5.75定義為低表達(dá)組。CLEC12B表達(dá)與總體生存顯著相關(guān)，高表達(dá)患者總體生存期優(yōu)于低表達(dá)患者，見圖2。在單因素COX回歸模型中，TNM分期、年齡、CLEC12B表達(dá)狀態(tài)能夠影響患者的預(yù)后(P<0.05),性別、病理分期對預(yù)后沒有明顯影響(見表1)。將以上P<0.1的因素納入多因素分析，TNM分期、年齡、CLEC12B表達(dá)狀態(tài)是影響肝癌患者預(yù)后的獨(dú)立因素，見表1。

圖2 CLEC12B表達(dá)狀態(tài)與肝癌患者預(yù)后的關(guān)系

2.3 CLEC12B表達(dá)與臨床病理學(xué)參數(shù)相關(guān)性 相關(guān)性分析顯示CLEC12B表達(dá)與年齡、性別、TNM分期以及病理分期均無關(guān)，見表2。

2.4 基因富集化分析 基因富集分析示，CLEC12B高表達(dá)樣本富集到DNA修復(fù)相關(guān)的基因集(P<0.05,FDR=0.012)，低表達(dá)樣本富集到炎癥反應(yīng)相關(guān)的基因集(P<0.05,FDR=0.002)，見圖3。

表1 影響肝癌預(yù)后的因素

表2 CLEC12B表達(dá)與臨床病理學(xué)參數(shù)相關(guān)性

圖3 GSEA分析CLEC12B表達(dá)相關(guān)富集分析

A：DNA修復(fù) B：炎癥反應(yīng)

3 討論

CLEC12B是C型凝集素受體超家族的一員[5]。本研究顯示，相比癌旁組織，CLEC12B在癌組織中呈現(xiàn)低表達(dá)，CLEC12B高表達(dá)組總體生存期明顯優(yōu)于低表達(dá)組。這些結(jié)果提示CLEC12B與肝癌的發(fā)生發(fā)展呈負(fù)相關(guān)，可以作為肝癌預(yù)后的預(yù)測指標(biāo)。基因富集分析提示CLEC12B高表達(dá)與炎癥反應(yīng)、DNA修復(fù)相關(guān)，提示CLEC12B可能通過影響肝臟炎癥反應(yīng)以及DNA修復(fù)調(diào)節(jié)了腫瘤的發(fā)生發(fā)展。

研究發(fā)現(xiàn)CLEC12B主要表達(dá)在骨髓細(xì)胞表面，能夠抑制單核細(xì)胞來源的免疫細(xì)胞的活性，從而參與機(jī)體的炎癥調(diào)控[6-7]。肝癌的發(fā)生發(fā)展與肝臟炎癥密切相關(guān)[8]，基因富集分析提示CLEC12B高表達(dá)與炎癥反應(yīng)有關(guān)。因此，我們推測CLEC12B可能通過影響肝臟的炎癥，進(jìn)而影響肝癌的發(fā)生。此外，DNA損傷是肝癌發(fā)生的重要機(jī)制之一[9]，基因富集分析提示CLEC12B高表達(dá)與DNA修復(fù)有關(guān)，因此推測CLEC12B可能通過上調(diào)DNA修復(fù)相關(guān)的基因，從而抑制肝癌的發(fā)生發(fā)展[10]。

本研究有一定不足之處。首先，TCGA數(shù)據(jù)庫提供的是CLEC12B的mRNA表達(dá)水平，無法完全代表CLEC12B的蛋白質(zhì)表達(dá)水平。其次，本研究的結(jié)論來源于在線數(shù)據(jù)庫分析，分析結(jié)果具有一定的提示作用，但還需要臨床以及基礎(chǔ)研究進(jìn)一步證實(shí)。

綜上所述，CLEC12B可能通過炎癥及DNA修復(fù)等影響肝癌發(fā)生發(fā)展及預(yù)后。該結(jié)果將為深入研究CLEC12B在肝癌中的作用提供線索和依據(jù)。