張世昌 鄭 江

長江大學附屬第一醫(yī)院，湖北省荊州市 434000

前列腺癌(Prostate cancer,PCa)具有高度激素敏感性, 是男性泌尿系統(tǒng)常見的惡性腫瘤，發(fā)生骨轉(zhuǎn)移和復發(fā)的概率較高, 患者預后不良，前列腺癌的發(fā)病率和死亡率正逐年升高[1]。微小RNA(microRNA,miRNA)是一類長度約為22個核苷酸(nt)的非編碼RNA,miRNA可通過與靶mRNA的3’端非翻譯區(qū)(3’-UTR)互補配對,在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因的表達, 導致mRNA的降解或翻譯抑制[2], 通過參與細胞增殖、凋亡等多種生理過程，對疾病發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用，與多種腫瘤的發(fā)生關系密切[3]。有研究表明[4],miR-221可以調(diào)控前列腺癌細胞的凋亡、生長、侵襲等多種生物過程，可能與其激活JAK/STAT信號通路有關，說明miR-221與前列腺癌的發(fā)生關系密切。

GEO數(shù)據(jù)庫[5]是物種基因表達的在線數(shù)據(jù)庫。本研究在GEO數(shù)據(jù)庫獲得了數(shù)據(jù)集GSE45627[4]，該數(shù)據(jù)集包括兩種樣本，一是過表達的miR-221前列腺癌細胞樣本，二是正常表達miR-221的前列腺癌細胞樣本。通過對這兩個樣本數(shù)據(jù)的分析和比較，得到miR-221調(diào)控前列腺癌的重要靶點。對基因進行功能富集分析、蛋白—蛋白質(zhì)互作(PPI)網(wǎng)絡和模塊分析。本研究結果可以為以后的基礎實驗提供可靠的作用靶點基因。

1 材料和方法

1.1 基因芯片數(shù)據(jù) GSE45627基因表達數(shù)據(jù)來源于GEO數(shù)據(jù)庫(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo)，研究類型為expression profiling by array，在GPL570平臺上表達(Affymetrix Human Genome U133 Plus 2.0 Array)。GSE45627數(shù)據(jù)集為前列腺癌細胞，物種是人，其中過表達miR-221前列腺癌細胞2例(n=2)，正常表達miR-221的前列腺癌細胞2例(n=2)。

1.2 識別DEG 利用Morpheus軟件(https://software.broadinstitute.org/morpheus/)制作熱圖對基因芯片數(shù)據(jù)進行分析，觀察基因表達的情況。利用在線分析工具GEO2R[6]對表達的差異基因進行分析和篩選，篩選的條件為P<0.01和|log2FC|≥1。利用Graphpad Prism軟件制作火山圖，觀察篩選的差異基因。

1.3 差異基因功能和通路富集分析 用DAVID數(shù)據(jù)庫(https://david.ncifcrf.gov/)進行差異基因的注釋?；蚬δ芨患ǚ肿庸δ芎蜕镞^程以及細胞組分。信號通路的富集分析主要是用到KEGG數(shù)據(jù)庫，KEGG(http://www.genome.jp/)是一個包含KEGG信號通路的數(shù)據(jù)庫，用于檢查基因簇的路徑和相關功能。

1.4 PPI網(wǎng)絡的建立和模塊的分析 利用String[7]數(shù)據(jù)庫(http://www.string-db.org/)的檢索工具可以檢索已知和預測的蛋白質(zhì)之間的關聯(lián)，并且通常用于預測分子生物學中的PPI信息。將差異基因?qū)隨tring數(shù)據(jù)庫，得到差異基因相互作用的數(shù)據(jù)。Cytoscape3.5.0(http://www.cytoscape.org/)用于顯示差異基因互作關系的結果。對PPI網(wǎng)絡的結果進行了模塊分析，采用了與Cytoscape相關的Mcode聚類算法進行模塊分析，模塊分析可以用來識別更多的連接基因群。

2 結果

2.1 篩選基因結果 用Morpheus軟件制作的熱圖觀察所有基因的表達情況，如圖1所示。并且鑒定了過表達miR-221前列腺癌細胞與正常表達miR-221前列腺癌細胞基因表達的差異。利用在線分析工具GEO2R篩選出108個基因，其中18個基因上調(diào)，90個基因下調(diào)，如圖2所示。

圖1 所有樣品前50個基因的表達情況

注：根據(jù)旁邊色階柱，越往下的顏色代表基因表達量下降。

圖2 所有基因的火山圖

注：紅色：上調(diào)基因，綠色：下調(diào)基因，黑色：不受調(diào)控的基因。

2.2 基因功能富集分析 篩選出來的基因大多數(shù)位于細胞質(zhì)、細胞核。這些基因通過雙鏈RNA結合、螺旋酶活性、雙鏈DNA結合、蛋白結合、單鏈RNA結合等發(fā)揮分子功能。此外，這些基因還通過參與調(diào)節(jié)Ⅰ型干擾素信號通路、對病毒的防御反應、病毒基因組復制的負調(diào)控、先天免疫反應等參與miR-221調(diào)控前列腺癌的發(fā)病過程?；蚬δ芨患治鼋Y果如圖3所示。

2.3 KEGG信號通路分析 篩選出來的基因通過單純皰疹感染信號通路、甲型H1N1流感信號通路、麻疹信號通路、RIG-I樣受體信號通路、Toll樣受體信號通路、乙型肝炎信號通路等途徑參與了miR-221調(diào)控前列腺癌細胞的過程。KEGG分析結果如圖4所示。

圖3 差異基因功能富集分析

圖4 差異基因KEGG信號通路分析

2.4 PPI網(wǎng)絡和模塊分析 基于PPI網(wǎng)絡的分析之后，在Cytoscape中識別出75個節(jié)點和2 236個相互作用關系，如圖5所示。其中相互作用關系較多的基因是中樞基因，因為相互作用關系多的基因與疾病的關系更加密切。其中信號轉(zhuǎn)導和轉(zhuǎn)錄激活因子1-α/β(STAT1)、干擾素調(diào)節(jié)因子7(IRF7)、干擾素誘導的螺旋酶c結構域蛋白1(IFIH1)、干擾素誘導的GTP結合蛋白(MX1)、干擾素誘導的四肽重復序列3蛋白(IFIT3)、寡腺苷酸合酶2(OAS2)、泛素樣蛋白15(ISG15)、依賴ATP的RNA解旋酶(DDX58)、鳥苷酸結合蛋白1(GBP1)、寡腺苷酸合酶1(OAS1)為前十位。 通過mcode分析，選擇了1個模塊，已經(jīng)在圖中圈出，這些基因具有一些共同的表達特征，值得我們進一步去研究，如圖5所示。

圖5 差異基因蛋白相互作用網(wǎng)絡

3 討論

前列腺癌是一種臨床較為常見的疾病, 發(fā)病機制十分復雜, 當人體免疫力下降, 細胞內(nèi)遺傳物質(zhì)DNA發(fā)生異常變化后, 細胞就會不受正常調(diào)節(jié)機制控制而出現(xiàn)異常生長, 產(chǎn)生癌變[8-9]。有研究表明[9-10]，前列腺癌的發(fā)生與結核桿菌和HPV病毒關系密切。本研究對miR-221過表達調(diào)控前列腺癌細胞差異表達的基因進行了篩選，共篩選出差異基因108個，其中18個上調(diào)基因，90個下調(diào)基因，對這些基因進行了基因功能和信號通路的富集分析結果表明，這些基因主要的功能有與雙鏈RNA結合、雙鏈DNA結合、蛋白結合、單鏈RNA結合，這些基因還通過參與調(diào)節(jié)Ⅰ型干擾素信號通路、對病毒的防御反應、病毒基因組復制的負調(diào)控、先天免疫反應，說明miR-221主要通過調(diào)控基因的這些功能，來參與前列腺癌的形成過程。這些基因主要富集在單純皰疹感染信號通路、甲型H1N1流感信號通路、Toll樣受體信號通路、乙型肝炎信號通路上，說明這些基因參與了病毒感染的調(diào)節(jié)過程。

構建了差異之間相互關系的PPI網(wǎng)絡，其中STAT1、IRF7、IFIH1、MX1、IFIT3、OAS2、ISG15、DDX58、GBP1、OAS1為前10個樞紐基因。STAT1是信號轉(zhuǎn)導和轉(zhuǎn)錄激活劑，介導細胞對干擾素(IFN)及其他生長因子的反應。隨著Ⅰ型干擾素(IFN-α和IFN-β)與細胞表面受體的結合，通過蛋白激酶的信號傳導導致JAK激酶的激活，磷酸化的細胞二聚體與ISGF3G/IRF-9結合形成一個復合物，稱為ISGF3轉(zhuǎn)錄因子，進入細胞核。ISGF3與IFN刺激反應元件結合，激活IFN刺激基因的轉(zhuǎn)錄，使細胞處于抗病毒狀態(tài)[11]。IRF7是Ⅰ型干擾素(IFN)依賴免疫應答的關鍵轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，在對DNA和RNA病毒的天然免疫應答中起著至關重要的作用。Ⅰ型干擾素基因(IFN-α和IFN-β)和IFN-刺激基因(ISG)的轉(zhuǎn)錄通過與其啟動子中的干擾素刺激反應元件(ISRE)結合來調(diào)控?？梢杂行У丶せ領FN-β和IFN-α基因，并通過病毒激活的myd 88非依賴性途徑和TLR激活的MYD88依賴途徑介導它們的誘導[12]。IFIH1作為病毒核酸的細胞質(zhì)傳感器的天然免疫受體，在傳感病毒感染和包括誘導第Ⅰ型干擾素和促炎細胞因子在內(nèi)的一系列抗病毒反應的活化中起重要作用。MX1作為干擾素誘導的GTP酶結合蛋白，具有抗病毒活性，對RNA病毒和DNA病毒均有作用，它主要的作用目標病毒是負鏈RNA病毒和乙型肝炎病毒，作用方式通過核糖核衣殼結合和滅活[13-14]。IFIT3是干擾素誘導的抗病毒蛋白，可以抑制病毒復制。增強MAVS介導的宿主抗病毒反應，進入細胞核促進抗病毒基因轉(zhuǎn)錄[15]。OAS2和OASI是干擾素誘導的雙鏈RNA激活的抗病毒酶，在細胞固有抗病毒反應中起著關鍵作用，它還可能在細胞凋亡、細胞生長、分化和基因調(diào)控等其他細胞過程中發(fā)揮作用[16]。ISG15作為泛素樣蛋白，它在病毒感染的天然免疫反應中起著關鍵作用，DDX58作為天然免疫受體及病毒核酸的細胞質(zhì)傳感器，在檢測病毒感染和激活一系列抗病毒反應中起著重要作用，包括誘導Ⅰ型干擾素和促炎細胞因子[17]。GBP1在兩個連續(xù)的裂解反應中將GTP水解成GMP。具有抗流感病毒活性。促進氧化殺滅和提供抗菌肽自噬瘤小體，提供廣泛的宿主保護對不同的病原體類別[18]。

差異基因的深入分析有助于確定miR-221調(diào)控前列腺癌發(fā)病機制中有用的靶點和途徑。這些結果可為臨床治療靶點的研究提供理論依據(jù)。本研究篩選的中樞基因需要進一步驗證，這可能成為未來研究的重點。