鄭愛芳, 吳甘霖, 李偉娟, 張貴鳳

(1. 安慶師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，安慶 246133； 2. 安慶師范大學(xué) 水生生物保護(hù)與水生態(tài)修復(fù)安徽省高校工程技術(shù)研究中心, 安慶 246133)

重金屬污染嚴(yán)重影響了人們的生活。銅離子是動(dòng)物或植物生長(zhǎng)的必需元素。人體銅元素缺乏會(huì)引發(fā)貧血，導(dǎo)致毛發(fā)、骨骼等發(fā)生異常，甚至引起腦障礙；但如過(guò)剩，會(huì)引起肝硬化、腹瀉、嘔吐、運(yùn)動(dòng)和知覺神經(jīng)障礙[1]。土壤中銅的濃度過(guò)高時(shí)，植物會(huì)出現(xiàn)缺鐵失綠癥狀[2]，水體中銅濃度過(guò)高會(huì)導(dǎo)致蝌蚪死亡[3]。近年來(lái)，由于工業(yè)采礦、城市污水的排放和含銅殺菌劑的長(zhǎng)期大量使用[4]，周圍水體含銅量迅速增加，遠(yuǎn)遠(yuǎn)超出了環(huán)境標(biāo)準(zhǔn),銅污染逐漸引起了人們的重視。金屬冶煉加工和電鍍工廠所排廢水含銅量最高，每升廢水含銅幾十到幾百毫克，這些廢水會(huì)導(dǎo)致周圍土壤的污染，造成其中生長(zhǎng)的植物重金屬超標(biāo)，如我國(guó)中藥材中重金屬銅的污染率高達(dá)16.09%[5]。水體中銅含量超過(guò)3 mg/L就會(huì)有異味，超過(guò)15 mg/L就不能作為飲用水[6]。

物理、化學(xué)法去除重金屬離子成本比較高[7-8]容易造成二次污染[9],而生物法處理相對(duì)成本低，無(wú)二次污染[10]，因而成為一種有前景的污水處理方式。生物法可以利用細(xì)菌的吸附，還原礦化等作用對(duì)水體和土壤中的重金屬進(jìn)行處理，用于吸附銅離子的細(xì)菌有Pseudomonasveronii[11]、Eichhorniaspp.[12]、Pseudomonassp.[13]、硫酸鹽還原菌 (Sulfate-Reducing Bacteria，SRB)[14]、Providenciaalcalifaciens[15]等種屬的細(xì)菌。

大型真菌對(duì)重金屬離子的處理效果也較為明顯，Sutherland[16]研究了FomesFasciatus對(duì)銅離子的去除效果。莫瑜[17]等研究了毛木耳和白木耳子實(shí)體對(duì)重金屬離子的吸附，Akar等[18]研究了Ganodermacarnosum對(duì)鉛離子的去除，Das 等[19]研究了Pleurotusplatypus對(duì)銀離子的吸附，Mittal等[20]利用Fomitopsiscarnea陽(yáng)離子染料導(dǎo)致的污染，目前利用大型真菌對(duì)Cu2+吸附作用研究的較少，本文旨在分離大型抗銅真菌來(lái)用以處理銅離子引起的水污染。

1 材料和方法

1.1 材料

菌株：2015年從安慶郊區(qū)朽木上采集的一株野生大型真菌，命名為L(zhǎng)GBS菌株。主要儀器：PinAAcle 900T美國(guó)PE原子吸收光譜儀，顯微鏡；培養(yǎng)基(g/L)：PDA培養(yǎng)基；重金屬母液：濃度為2000 mg/L、20 000 mg/L的硫酸銅母液。

1.2 方法

1.2.1 野生大型真菌的分離

分離方法[21]：用75 %乙醇浸泡的酒精棉球?qū)w表面消毒，然后將菌體用酒精燈灼燒表面，再用解剖刀切取黃豆大小的子實(shí)體，將其放置在PDA平板上，28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中避光培養(yǎng)1 ～3 d，用接種鉤鉤取無(wú)菌菌絲PDA斜面中培養(yǎng)，長(zhǎng)滿斜面后置于4 ℃冰箱保存。

1.2.2 菌株抗銅能力試驗(yàn)[22]

用無(wú)菌硫酸銅母液和無(wú)菌PDA培養(yǎng)基制備含有硫酸銅濃度分別為0、20、40、60、80、100、200、300、400、500和600 mg/L的固體平板。用打孔器在平板菌種的菌絲前端打取直徑為6 mm的菌絲塊，將有菌絲的一面朝下，置于上述含有不同銅離子濃度的PDA平板的中央，每個(gè)濃度做3個(gè)平行，將接菌的平板放在28 ℃避光的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待其中一個(gè)平板長(zhǎng)滿菌絲后停止培養(yǎng)，垂直方向測(cè)定菌落的直徑，取兩者的均值。

1.2.3 LGBS菌株在不同Cu2+平板生長(zhǎng)后菌絲的顯微觀察

分別用解剖針挑取空白對(duì)照及生命明顯受銅離子抑制后的菌絲用顯微鏡觀察其菌絲形態(tài)，并拍照。

1.2.4 菌絲球的制備[23]

用打孔器在長(zhǎng)滿菌絲體的PDA平板上打取直徑為6 mm的菌餅，接種至裝有100 mL無(wú)菌馬鈴薯葡萄糖水液體培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，每個(gè)三角瓶中裝有15個(gè)玻璃珠，每瓶接種10個(gè)菌餅，置于溫度為28 ℃，轉(zhuǎn)速為150 r/min的搖床上培養(yǎng)5 d，過(guò)濾收集菌絲球，并用去離子水沖洗3次，洗去有機(jī)培養(yǎng)液，用濾紙吸附明水，制成濕菌絲球，經(jīng)試驗(yàn)濕菌絲球相當(dāng)于干質(zhì)量的二十分之一。

1.2.5 不同因素對(duì)菌絲銅離子吸附的影響

所有反應(yīng)的溶液體積都為20 mL，每個(gè)實(shí)驗(yàn)做3個(gè)平行。分別吸附后用原子吸收光譜儀(美國(guó)AAS-900T)測(cè)定溶液的吸光度，計(jì)算金屬離子吸附量和吸附率。為防止金屬離子被吸附到器皿壁上，所有器皿均用20%的硝酸浸泡12 h左右。

金屬離子吸附量和吸附率計(jì)算[24]：

q=V(c0-ce)/mr(%)=(c0-ce)/c0×100%

式中：q為吸附容量(單位：mg/g)；r為吸附率；V為溶液體積(L)；c0為對(duì)照濃度(mg/L)；ce為剩余濃度(mg/L)；m為投加吸附劑質(zhì)量(g)。

1)菌絲球投加量對(duì)Cu2+吸附的影響(g)。菌絲球投加量為0.2、0.4、0.6、0.8和1.0，溶液pH 5，溫度為25 ℃，振蕩時(shí)間60 min，轉(zhuǎn)速為150 r/min，初始銅離子濃度為20 mg/L。2)pH對(duì)Cu2+吸附的影響。調(diào)整溶液pH 為 3、4、5、6，振蕩時(shí)間60 min，溫度28 ℃,轉(zhuǎn)速為150 r/min，初始銅離子濃度為20 mg/L，菌絲球投加量為0.5 g。3)溫度對(duì)Cu2+吸附的影響(℃)。溫度為15、20、28、30和35，溶液pH 5，振蕩60 min，轉(zhuǎn)速為150 r/min，初始銅離子濃度為20 mg/L,菌絲球投加量為0.5 g。4)時(shí)間對(duì)Cu2+吸附的影響(min)。時(shí)間為30、60、90、120，溶液pH 5，溫度25 ℃,轉(zhuǎn)速為150 r/min，菌絲球投加量為0.5 g,初始銅離子濃度為20 mg/L。5)轉(zhuǎn)速對(duì)Cu2+吸附的影響(r/min)。轉(zhuǎn)速為50、100、150、200和250，溶液pH 5，溫度25 ℃,振蕩60 min，菌絲球投加量為0.5 g，初始銅離子濃度為20 mg/L。6)初始Cu2+濃度對(duì)菌絲球吸附的影響(mg/L)。Cu2+濃度為20、40、60和80，溶液pH 5，溫度25 ℃,振蕩60 min，菌絲球投加量為0.5 g，轉(zhuǎn)速為150 r/min。

1.2.6 具抗銅能力真菌基因組DNA的提取及鑒定

將低溫保藏真菌菌種轉(zhuǎn)接到PDA平板上, 28 ℃培養(yǎng)。長(zhǎng)滿平板后，由上海凌恩生物科技有限公司提取DNA并測(cè)序。測(cè)得的序列在 NCBI 網(wǎng)站上核酸數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行基因序列比對(duì)，以確定其種屬。

2 結(jié)果與分析

2.1 抗銅菌株的篩選及其銅抗性分析

真菌LGBS在含Cu2+的PDA平板中生長(zhǎng)情況如圖1所示。從圖1中可以看出，菌株LGBS隨著Cu2+濃度的增加菌落大小呈遞減趨勢(shì)，具體菌落直徑大小見表1。當(dāng)Cu2+濃度為300 mg/L時(shí)，菌落開始顯著變??；濃度為500 mg/L時(shí)，菌餅周圍僅有約2 mm菌絲長(zhǎng)出；而濃度為600 mg/L時(shí)，LGBS菌株完全被抑制。Cu2+濃度為0 mg/L時(shí)，平板上菌落背面顏色為白色，Cu2+濃度不斷增加菌落背面顏色發(fā)黃，并且濃度越高菌落顏色相對(duì)也越深，在Cu2+濃度為400和500 mg/L的平板上能看到菌落周圍有明顯的透明圈，是Cu2+被吸附后形成的，說(shuō)明該菌株具有吸附Cu2+的能力。

2.2 LGBS菌株在不同Cu2+平板生長(zhǎng)后菌絲的顯微觀察

分別用解剖針挑取Cu2+濃度為0和300 mg/L PDA平板上的菌絲顯微觀察，菌絲在Cu2+濃度為0 mg/L時(shí)菌絲平滑，順直，內(nèi)含物也不多；而菌絲在Cu2+濃度為300 mg/L時(shí)，菌絲變粗，菌絲也發(fā)生扭曲變形，內(nèi)含物增多，內(nèi)部顏色發(fā)藍(lán)，結(jié)合平板菌落的顏色，可能是在菌絲內(nèi)部富集了Cu2+。

表1 LGBS菌株在含不同Cu2+濃度PDA平板上菌落直徑(接種菌絲塊為0.6 cm)

平板上的數(shù)字表示培養(yǎng)基中Cu2+的濃度(mg/L)圖1大型真菌LGBS菌株在含有不同濃度Cu2+的PDA平Cu2+板上生長(zhǎng)6d的菌落背面形態(tài)Figure1ColonialdorsalmorphologyofamacrofungistrainLGBSonPDAplatecontainingdifferentlevelsofCu2+for6days圖片中1、2分別表示Cu2+濃度為0和300mg/L圖2大型真菌LGBS菌株在含有不同濃度PDA平板上生長(zhǎng)6d后的菌絲顯微圖片(1000×)Figure2MuceliaofamacrofungistrainLGBSonPDAplatecontainingdifferentlevelsofCu2+for6days(1000×)

圖3菌絲球投加量對(duì)Cu2+吸附的影響

Figure 3 Effects of different dosages of mycelial pellet on the adsorption rate and quantity of Cu2+

2.3 不同因素對(duì)菌絲銅離子吸附的影響

2.3.1 菌絲球投加量對(duì)Cu2+吸附的影響 在初始Cu2+濃度為20 mg/L時(shí)，當(dāng)吸附劑從0.5達(dá)到2.5 g/L時(shí)，吸附率由20.8%上升到42.5%多。然而吸附容量卻正好相反，呈遞減的趨勢(shì)，吸附容量由8.33 mg/g降至3.40 mg/g。導(dǎo)致這種現(xiàn)象的原因可能是當(dāng)溶液中Cu2+濃度一定時(shí)，吸附劑越多，能夠提供的吸附位點(diǎn)就越多，溶液中的Cu2+被大量吸附后，溶液中的Cu2+濃度自然降低，表現(xiàn)為吸附率提高。由于微生物細(xì)胞間有靜電學(xué)效應(yīng)，會(huì)影響吸附劑對(duì)離子的吸附[25],菌絲細(xì)胞間距離增大時(shí)，靜電效應(yīng)減弱，可以增加對(duì)離子的吸附量。當(dāng)吸附劑大量增加后會(huì)競(jìng)爭(zhēng)性吸附金屬離子，導(dǎo)致吸附容量的降低，因此在溶液中的Cu2+與生物體比率提高時(shí)，生物體的吸收能力會(huì)相對(duì)增強(qiáng)。

圖4 不同pH值對(duì)Cu2+吸附的影響

2.3.2 pH值對(duì)Cu2+吸附的影響 很多實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，pH值是影響重金屬吸附的一個(gè)重要因素[26]。重金屬離子在不同的pH值溶液中的存在狀態(tài)會(huì)發(fā)生變化，金屬陽(yáng)離子在酸性條件下容易呈離子狀態(tài)，在堿性條件下易形成沉淀。本實(shí)驗(yàn)中Cu2+在pH 7時(shí)有絮狀沉淀產(chǎn)生，為保證其離子狀態(tài)，實(shí)驗(yàn)的最高pH 6。從圖4中可以看出，pH值在3～6范圍內(nèi)，菌絲球?qū)u2+的吸附容量及吸附率都呈現(xiàn)拋物線狀，兩個(gè)曲線基本平行，這是因?yàn)樗袑?shí)驗(yàn)樣品菌絲投加量都一致，所以吸附率和吸附容量呈正相關(guān)。pH 3 時(shí)，吸附容量為4.13 mg/g；pH 4時(shí)，吸附容量為最大，達(dá)到5.20 mg/g；pH 5時(shí)為3.61 mg/g，pH值越高吸附容量越低。這可能是因?yàn)閜H 值不僅影響了Cu2+的存在狀態(tài)，也會(huì)影響具有活性的菌絲細(xì)胞的表面電荷，而細(xì)胞表面的負(fù)電荷決定了對(duì)重金屬陽(yáng)離子的吸附能力[27],從而影響了菌絲的吸附效果。從多位學(xué)者報(bào)道的實(shí)驗(yàn)結(jié)果來(lái)看，金屬陽(yáng)離子在酸性條件下pH 3～5時(shí)易于被生物體吸附[28]，如劉理等[29]研究一株微桿亞鐵氧化菌Microbacteriumsp.W5對(duì)水中銅離子的吸附行為時(shí)發(fā)現(xiàn)：在pH值為5.0時(shí),吸附劑對(duì)Cu2+離子的吸附量最大。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果也得到同樣的結(jié)論。

2.3.3 溫度對(duì)Cu2+吸附的影響 從圖5中可以看到，該菌在15 ℃條件下吸附效果較好，吸附容量為5.47 mg/g，當(dāng)溫度提高到20 ℃時(shí)吸附效果開始降低至2.23 mg/g左右，溫度繼續(xù)升高時(shí)，吸附率及容量變化不明顯，差異不顯著。

圖5 溫度對(duì)Cu2+ 吸附的影響

2.3.4 時(shí)間對(duì)Cu2+吸附的影響 圖6 的結(jié)果顯示，吸附時(shí)間開始30 min到60 min吸附容量由2.27 mg/g上升到 3.3 mg/g，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)略有降低，降低不明顯。開始短時(shí)間內(nèi)，吸附劑沒有達(dá)到最大吸附量，隨著時(shí)間的增加，吸附不斷達(dá)到飽和，趨于穩(wěn)定。

圖6 吸附時(shí)間對(duì)Cu2+吸附的影響(min)

2.3.5 轉(zhuǎn)速對(duì)Cu2+吸附的影響 當(dāng)溶液處于靜止?fàn)顟B(tài)時(shí)，菌絲的吸附容量較低(圖7)，為2.26 mg/g，轉(zhuǎn)速為50 r/min時(shí)最高，為5.73 mg/g，隨著轉(zhuǎn)速的進(jìn)一步提高，吸附容量略有降低，趨于穩(wěn)定。這是因?yàn)榻饘匐x子被生物體的吸附時(shí)，溶液的界面與菌絲球表面間的滯流層存在傳質(zhì)阻力[30]。當(dāng)溶液處于靜止?fàn)顟B(tài)時(shí)阻力大，金屬離子不易與菌絲球的吸附位點(diǎn)有效結(jié)合，不能被牢固的吸附。隨著轉(zhuǎn)速增加吸附速率將隨之提高，并趨于不變，但轉(zhuǎn)速過(guò)高時(shí)，會(huì)增加成本另外效果并不理想，同時(shí)造成液體飛濺，影響吸附的效果。

圖7 轉(zhuǎn)速對(duì)Cu2+吸附的影響(r/min)

2.3.6 初始Cu2+濃度對(duì)菌絲球吸附Cu2+的影響 圖8顯示隨著初始Cu2+濃度的增加，菌體對(duì)Cu2+的吸附容量不斷提高，當(dāng)Cu2+為20 mg/L時(shí)，吸附容量為3.87 mg /L，當(dāng)Cu2+濃度提高到80 mg/L時(shí)，吸附容量增至17.21 mg/L。Cu2+為40 mg/L時(shí)吸附率最大為27%，Cu2+濃度增加后吸附率降低至18.54%，因?yàn)槲絼┫嗤瑫r(shí)，結(jié)合位點(diǎn)沒有達(dá)到飽和時(shí)，離子濃度越大吸附的離子越多，自然吸附容量越高。在吸附劑投加量相同的情況下,初始離子濃度越高,吸附劑的吸附量越高[29]；當(dāng)位點(diǎn)趨于飽和時(shí)，吸附容量將達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài)，溶液中離子濃度越高，吸附后剩余的金屬離子濃度就越大，因而吸附率會(huì)逐漸降低。

圖8 不同初始Cu2+濃度對(duì)吸附的影響

2.4 具抗銅能力真菌的鑒定 用真菌通用引物ITS1F 和ITS4R引物對(duì)大型真菌LGBS菌株進(jìn)行PCR 擴(kuò)增后，瓊脂糖凝膠電泳后發(fā)現(xiàn)該菌株的PCR產(chǎn)物條帶位于600～700 bp之間(圖9)。經(jīng)過(guò)上海凌恩生物科技有限公司測(cè)序后知道該ITS 序列為679 bp，將該序列提交到GenBank (Accession No:KY889146)。Blast 比對(duì)結(jié)果顯示，菌株LGBS與GenBank 中Irpexlacteus( KX588111.1, KX588108.1, JX311924.1, FJ462768.1, EU301643.1, KX588107.1) 等40余個(gè)菌株的ITS 序列覆蓋度在100%, 相似性達(dá)到99%，根據(jù)此分子生物學(xué)特性，將其初步鑒定為Irpexlacteus，即白耙齒菌。

M：marker；S：菌株LGBS；CK：陰性對(duì)照

圖9真菌ITSrDNAPCR產(chǎn)物鑒定結(jié)果

Figure 9 PCR products of Fungus ITS rDNA PCR

3 討論

目前研究人員在利用細(xì)菌處理銅離子污染方面取得了較好地處理效果。Vullo等[11]利用Pseudomonasveronii2E去除銅離子，去除率達(dá)到40%，Andreazza等[13]研究發(fā)現(xiàn)Pseudomonassp. NA通過(guò)生物吸附和還原作用在初始濃度為300 mg/L時(shí)，能處理掉110 mg/L的銅離子。王國(guó)倩[14]研究了一株硫酸鹽還原菌(Sulfate-Reducing Bacteria，SRB)電路板廢水中銅的吸附作用。李蘭松等[15]研究發(fā)現(xiàn)Providenciaalcalifaciens對(duì)Cu2+最高吸附率達(dá)85.84%,李哲等[31]利用株碳酸鹽礦化菌Achromobacterxylosoxidans菌體通過(guò)細(xì)胞吸附、生物礦化和化學(xué)沉淀對(duì)溶液中 Cu2+的去除率為93%。

在利用真菌處理銅離子引起的水體污染方面的研究較少。Sutherland和Venkobachar[16]研究了FomesFasciatus對(duì)銅的去除率達(dá)到17.5%；莫瑜[17]等實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示毛木耳和白木耳子實(shí)體對(duì)銅離子的吸附量分別為18.69和20.15 mg/g；張丹等[24]利用毛木耳凍干菌絲體對(duì)銅離子進(jìn)行吸附研究，吸附值在2 mg/g左右。本研究中利用的野生白耙齒菌對(duì)銅離子的吸附容量最高可以達(dá)到17.21 mg/g，吸附力相對(duì)較強(qiáng)，另外白耙齒菌在脫色方面也有重要的應(yīng)用[32]，說(shuō)明該菌不僅在處理金屬方面，在其他水體環(huán)境污染中也有重要的研究前景。在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中，將進(jìn)一步優(yōu)化該菌株處理Cu2+的條件，研究對(duì)其他重金屬如鎘、鉻以及染料等環(huán)境污染物的處理效果，以期能夠應(yīng)用到實(shí)際污水處理中。

4 結(jié)論

1)在銅離子濃度為200 mg/L時(shí)，菌株LGBS受到抑制，當(dāng)超過(guò)銅離子濃度≥300 mg/L時(shí)，菌株生長(zhǎng)受到明顯抑制，菌落直徑相對(duì)對(duì)照組減小了約50%；超過(guò)600 mg/L時(shí)生長(zhǎng)基本停止，菌株的最高耐銅濃度為500 mg/L 。2)菌絲球的投加量增加對(duì)銅離子的吸附容量呈遞減趨勢(shì)，當(dāng)吸附劑從0.5達(dá)到2.5 g/L時(shí)，吸附容量由8.33 mg/g降至3.40 mg/g，吸附率由20.8%上升到42.5%多，吸附率不斷增加；在初始Cu2+濃度為20 mg/L時(shí)，吸附劑為0.5 g/L時(shí)吸附容量為8.33 mg/g；在pH 4時(shí)，菌體的吸附容量最高；溫度為15℃ 時(shí)吸附效果最好，溫度增加，吸附率略有下降，繼續(xù)升高溫度，對(duì)吸附的效果影響不大；轉(zhuǎn)速為50 r/min時(shí)，吸附效果較好，靜置或增加轉(zhuǎn)速之后不能提高吸附效果。初始本實(shí)驗(yàn)中Cu2+濃度80 mg/L時(shí)，吸附容量可達(dá)17.21 mg/g；吸附時(shí)間為60 min較好，增加時(shí)間不能增強(qiáng)吸附效率。3)本研究篩選的野生大型真菌初步鑒定為白耙齒菌。