楊玉龍，周亞竟

(江蘇大學(xué) 生命科學(xué)研究院，鎮(zhèn)江 212013)

真核細胞中具有16種已知的DNA依賴性聚合酶，PrimPol是最新的DNA聚合酶成員，屬于古真核生物酶家族，而其他15種聚合酶分屬于A、B、X和Y 4個家族[1]，其中，B家族的Pol α、Pol δ和Pol ε是負責(zé)染色體DNA復(fù)制的3種主要聚合酶，而其他家族的成員則主要參與DNA的損傷修復(fù)過程。

在眾多的DNA聚合酶中，Pol δ是最保守的聚合酶，具有5′-3′聚合酶活性和獨特的3′-5′核酸外切酶活性。Pol δ在染色體DNA復(fù)制過程中具有核心作用，當(dāng)DNA復(fù)制啟動時，在復(fù)制叉的滯后鏈上，首先由Pol α-引發(fā)酶重復(fù)合成小段RNA-DNA引物，隨后復(fù)制因子C(Replication Factor C, RFC)取代Pol α-引發(fā)酶并緊密連接在引物3′末端，通過募集增殖細胞核抗原(Proliferating cell nuclear antigen, PCNA)和Pol δ形成RFC-PCNA-Pol δ復(fù)制復(fù)合物，從而啟動新生的岡崎片段DNA合成[2]。而在前導(dǎo)鏈上，引物僅需合成一次，再由高度復(fù)制性復(fù)合物RFC-PCNA-Pol ε置換Pol α-引發(fā)酶并繼續(xù)DNA的合成[2-3]，但也有證據(jù)表明，Pol δ同時也參與了前導(dǎo)鏈DNA的合成[4]。除了維持基因組穩(wěn)定性和避免遺傳變異的作用外，Pol δ也參與了細胞中的諸多DNA修復(fù)途徑，例如：Pol δ通過鏈置換合成的能力協(xié)同相關(guān)酶參與了錯配修復(fù)途徑，這種鏈置換修復(fù)主要是通過Pol δ的p68亞基介導(dǎo)而完成[5]。近期的研究發(fā)現(xiàn)，Pol δ在BER(Base excision repair, BER)中也扮演著重要角色，它通過亞基的調(diào)節(jié)而轉(zhuǎn)變自身結(jié)構(gòu)，從而在修復(fù)中發(fā)揮作用[6]。在跨損傷修復(fù)途徑中，Pol δ能夠通過某種聚合酶交換機制和其他的跨損傷聚合酶進行轉(zhuǎn)換，來完成跨損傷合成[7]。此外，Pol δ還與腫瘤及其他疾病發(fā)生存在著密切聯(lián)系，例如：Pol δ的變異導(dǎo)致的修復(fù)功能缺陷是許多自發(fā)性腫瘤和遺傳性癌癥綜合征的主要特征之一[8-10]，而未修復(fù)的DNA損傷積累則與早(衰)老癥及老年性疾病相關(guān)。

哺乳動物Pol δ是由催化亞基p125和小亞基p50以及另外兩個輔助亞基p68和p12組成的異源四聚體，與裂殖酵母(Schizosaccharomycespombe,S.pombe)Pol δ的4個亞基Pol3、Cdc1、Cdc27和Cdm1相對應(yīng)。而在釀酒酵母(S.cerevisiae)中，Pol δ是由前3個單獨編碼的亞基組成的異源三聚體，即Pol3p、Pol31p和Pol32p，缺少第4個亞基的對應(yīng)物。也有文章表明，從S.pomb分離的Pol δ可能含有第5個亞基[11]，但是目前并未得到驗證和廣泛的認可。

迄今為止，對真核生物Pol δ的結(jié)構(gòu)和功能研究主要是通過酵母Pol δ來進行，而對哺乳動物Pol δ的研究相對滯后，其主要原因之一是從哺乳動物中分離純化Pol δ天然酶的過程極其復(fù)雜和困難。我們將詳細介紹哺乳動物Pol δ的分離純化歷程及其多亞基復(fù)合體制備的研究進展。

1 天然DNA聚合酶Pol δ的分離純化

1.1 硫酸銨鹽析結(jié)合多次柱層析的分離純化方法

DNA聚合酶δ最早由Byrnes等[12]于1976年從兔骨髓紅細胞中分離純化。Byrnes等通過注射苯肼誘導(dǎo)新西蘭兔紅細胞增生，將其骨髓細胞裂解上清經(jīng)過硫酸銨分級沉淀以及磷酸纖維素柱、DEAE-Sephadex A-25柱、羥基磷灰石柱等三個柱層析純化，以Poly[d(A-T)]為模板測定聚合酶活性，最終得到Pol δ。值得注意的是，DNA聚合酶和核酸外切酶活性組分在純化過程中不能通過各種層析方法分離，即使在低離子和高離子強度下的蔗糖密度梯度沉降中共沉降，也未能被分離，這表明3′-5′核酸外切酶活性是Pol δ固有的特性。

1980年由Lee等[13]從小牛胸腺中也分離得到了Pol δ。Lee等將胎牛胸腺裂解上清同樣通過硫酸銨分級沉淀結(jié)合多個層析柱，從1 kg胎牛胸腺中分離得到0.033 mg的Pol δ，其比活性為28 000 U/mg。隨后，Lee等又通過改進的方法對小牛胸腺中Pol δ進行純化(表1)，該方法的關(guān)鍵步驟是在早期純化過程中利用了苯基瓊脂柱層析，去除了樣品中大部分鈣依賴性蛋白酶，最后酶的純化倍數(shù)達到2280倍，比活性高達47 900 U/mg。通過凝膠電泳等實驗，Lee等初步鑒定Pol δ是由一個125 ku催化亞基和一個48 ku亞基組成的異二聚體[14]。

表1 小牛胸腺Pol δ的分離純化

1.2 免疫親和柱層析和快速蛋白液相層析(FPLC)系統(tǒng)

1995年Jiang等[15]對上述傳統(tǒng)的分離純化方法進行了優(yōu)化，其關(guān)鍵點在于利用了一個將抗p125單克隆抗體偶聯(lián)到 AvidChrom 酰肼凝膠柱上制備而成的免疫親和層析柱，再結(jié)合傳統(tǒng)的層析柱，最終從750 g的小牛胸腺中獲得了高達0.3 mg的 Pol δ(如表2所示)。該方法可以快速有效地分離由125 ku和50 ku亞基組成的Pol δ二聚體復(fù)合物，且得率比傳統(tǒng)方法有很大的提升，但該制備方法的缺陷是多次洗脫過程容易導(dǎo)致酶的失活，且Pol δ純化產(chǎn)物中通常含有許多多肽組分，純度依然不理想。

早期對于Pol δ研究的主旨是嚴(yán)格分離酶組分，而這些分離過程存在一些問題，例如：獲取的蛋白量少，利用眾多純化步驟增大蛋白水解的可能性。所以，過去一直認為Pol δ是由p125和p50兩個亞基所構(gòu)成，但隨著蛋白分離技術(shù)的發(fā)展，科研人員在傳統(tǒng)方法的基礎(chǔ)上結(jié)合Jiang等的免疫親和層析和FPLC快速層析系統(tǒng)相繼分離純化出Pol δ，并鑒定出另外兩個亞基，進一步解析了Pol δ的亞基組成。

表2 小牛胸腺Pol δ的免疫親和純化

Mo等[16]研究了通過Jiang等[5]方法分離出的小牛胸腺Pol δ的性質(zhì)，經(jīng)過凝膠過濾測定和甘油梯度超速離心，發(fā)現(xiàn)Pol δ與一個大小為68～70 ku的多肽密切相關(guān)，該68 ku多肽與PCNA緊密捆綁，測序結(jié)果顯示該蛋白對應(yīng)于某未知蛋白KIAA0039序列，同源比對發(fā)現(xiàn)此蛋白與S.pomb和S.cerevisiae的第三亞基Cdc27、Pol32p具有顯著的同源性，因此，提出該蛋白是Pol δ的第三亞基，命名為p68。幾乎同時期，Hughes等[17]利用重組S.pombePCNA制備了PCNA親和柱，用小鼠FM3A細胞的純化組分進行親和層析，發(fā)現(xiàn)親和柱保留的Pol δ組分中含有新的66 ku蛋白，通過N-末端測序和同源性檢索比對分析，也提出了該66 ku 蛋白是哺乳動物DNA聚合酶δ的第三亞基，命名為p66。

隨著哺乳動物Pol δ分離純化研究的深入，Liu等[18]設(shè)計了一種新的純化方案，以求盡量保留Pol δ核心酶的相關(guān)蛋白。該方案使用了含Mono Q 、Mono S、Source Q15和Superdex 200 4個層析柱的FPLC快速純化系統(tǒng)，具有柱容量大、回收率高且不易使生物大分子失活等特點，所得Pol δ產(chǎn)物活性可達8900 U/mg?？捡R斯染色分析顯示，Pol δ產(chǎn)物的組分中有6個主要條帶，即125 ku、50 ku、約25 ku的雙條帶和約12 ku的雙條帶，LC/MS/MS質(zhì)譜分析表明，25 ku的雙條帶均被鑒定為KIAA0039的蛋白水解產(chǎn)物，即p68的水解產(chǎn)物，而12 ku序列與EST AA402118的開放閱讀框相匹配，通過tBlastn檢索，發(fā)現(xiàn)其為酵母Pol δ Cdm1亞基的人同源物，因此，p12被鑒定為哺乳動物Pol δ的第四亞基。至此，哺乳動物Pol δ的4個亞基全部被鑒定，為將來深入分析哺乳動物Pol δ各亞基的功能奠定了基礎(chǔ)。

雖然利用FPLC快速層析系統(tǒng)提高了Pol δ的純化效率，但其過程仍費時費力，而且利用眾多的層析柱其成本偏高，產(chǎn)量較低，難以開展大規(guī)模制備，因此，開發(fā)更高效經(jīng)濟的方法制備高純度Pol δ成為當(dāng)前急需解決的迫切任務(wù)。

2 利用重組桿狀病毒共感染昆蟲細胞制備四亞基DNA聚合酶Pol δ

成功分離天然的四亞基Pol δ復(fù)合物面對諸多挑戰(zhàn)，雖然已在酵母中分離出天然Pol δ多亞基復(fù)合物，但這在哺乳動物組織中非常困難[14-15, 17]，而且在純化過程中，p68亞基容易暴露蛋白水解位點，進而被降解[16, 18]。此外，通過常規(guī)方法從人源細胞或胎牛胸腺中純化天然的Pol δ，通常僅產(chǎn)生含有p125和p50蛋白雙亞基的制備產(chǎn)物，難以獲得全酶。這些問題都嚴(yán)重阻礙了對Pol δ的結(jié)構(gòu)和功能的深入研究。

昆蟲桿狀病毒表達系統(tǒng)是一種以桿狀病毒為外源基因的載體，在昆蟲細胞或幼蟲體內(nèi)表達外源蛋白的真核表達系統(tǒng)，桿狀病毒表達系統(tǒng)具有與哺乳動物細胞相似的翻譯和翻譯后修飾功能，還能表達多蛋白復(fù)合物，而且成本低廉、安全性好[19-20]。為了獲取Pol δ全酶，Xie等[21]通過桿狀病毒表達系統(tǒng)構(gòu)建了編碼p125、p50、p68和p12亞基的4個重組桿狀病毒，將重組桿狀病毒共感染Sf-9昆蟲懸浮細胞并檢測蛋白表達，再利用Source15Q、Mono Q HR 5/5和Superdex 200等多個層析柱的FPLC純化系統(tǒng)，從昆蟲細胞裂解物中分離純化出幾乎均一的Pol δ異源四聚體。對純化的Pol δ的理化性質(zhì)與高純度的天然小牛胸腺Pol δ進行對比，發(fā)現(xiàn)重組聚合酶在功能上與天然Pol δ幾乎是一致的。類似的，Podust等[22]和Mertz等[8]利用重組桿狀病毒表達系統(tǒng)也構(gòu)建了含Pol δ 4個亞基的重組病毒，但他們所構(gòu)建的重組桿狀病毒帶有His標(biāo)簽，通過Ni-柱并結(jié)合多個層析柱進行分離純化，也獲得了高純度Pol δ四亞基復(fù)合物。

雖然利用該方法能夠快速獲取四亞基Pol δ復(fù)合物，但是仍有缺陷，因為是多病毒的共感染，所以各亞基的轉(zhuǎn)錄表達水平不均一，純度不理想，得到的不僅有Pol δ4-四亞基酶復(fù)合物，也有缺少p12亞基的三亞基蛋白復(fù)合物，由于過去對p12亞基的功能尚未明確，認為其對Pol δ功能研究無影響，但后來的研究證明p12對于Pol δ結(jié)構(gòu)和功能是必需的[23]；此外，Podust等構(gòu)建重組病毒時所用的標(biāo)簽可能會改變標(biāo)記蛋白質(zhì)的特性和功能[24]，這些不足之處仍有待解決。

3 利用新型 Multi Bac 系統(tǒng)制備DNA聚合酶Pol δ全酶

新型 Multi Bac 系統(tǒng)的應(yīng)用為DNA聚合酶δ的制備及分離純化帶來了新希望[25]。這是一種基于模塊化桿狀病毒的系統(tǒng)，專為真核多亞基蛋白表達而設(shè)計，使用含有可以嵌套的增殖模塊的轉(zhuǎn)移載體，便于組裝多順反子表達盒[26]。該桿狀病毒系統(tǒng)因為已經(jīng)消除了特定的病毒基因，具有改善的蛋白質(zhì)表達特征，能夠使感染的昆蟲細胞中外源蛋白的表達量成倍提高，同時也解決了多病毒共感染所導(dǎo)致蛋白表達不均一的問題。

本實驗室Zhou等[27]利用該Multi Bac 系統(tǒng)結(jié)合家蠶生物反應(yīng)器，成功大規(guī)模制備了Pol δ的多亞基蛋白復(fù)合物，通過該家蠶-桿狀病毒表達系統(tǒng)表達的重組蛋白具有很高的生物活性，且構(gòu)象也接近于天然的哺乳類蛋白。Zhou等通過圖1所示方案，首先將編碼Pol δ四亞基全長序列的4個cDNA片段，利用Multi Bac 系統(tǒng)構(gòu)建重組轉(zhuǎn)移載體pFBDM-[p125-p50-p68-p12]；然后，將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BmDH10Bac感受態(tài)細胞中，獲得重組BmNPV桿粒DNA；隨后，通過藍/白斑篩選，選定白色表型大腸桿菌分離出桿粒DNA，用于轉(zhuǎn)染家蠶BmN細胞以制備四亞基重組桿狀病毒；最后將病毒懸液注入五齡家蠶體內(nèi)，并監(jiān)測蛋白表達水平。收集幼蟲的血淋巴，進行免疫親和層析和FPLC Mono Q離子交換層析快速分離重組Pol δ，最終，從350頭家蠶血清中分離純化到4 mg的Pol δ，比活性高達25 000 U/mg。此外，Zhou等還利用同樣的方法從300 mL被感染的Sf-9昆蟲細胞中獲得了3～4 mg的Pol δ四亞基復(fù)合物[28]。

圖1 重組病毒的產(chǎn)生及其在家蠶幼蟲中的表達的示意圖[27]

為了確定與天然Pol δ是否具有功能一致性，Zhou等[28]嚴(yán)格鑒定和比較了所得酶的活性和同質(zhì)性，結(jié)果顯示重構(gòu)酶具有和天然來源 Pol δ相同的功能。此后，Liu等[29]和Wang等[30]也利用了此法制備的Pol δ復(fù)合物進行相關(guān)實驗，相繼獲得了良好的實驗結(jié)果，進一步驗證了該方法的可行性。后來，Sari[31]和Pelosse等[32]還對該表達系統(tǒng)進行了進一步的優(yōu)化和改善[31-32]。該方法是一種極具潛力的多蛋白復(fù)合物表達及制備方法，具有簡單、快速且可靠的優(yōu)點，已經(jīng)在生物、醫(yī)藥等諸多領(lǐng)域得以廣泛利用[31]。因此，可以利用該方法快速地制備高活性、高純度四亞基Pol δ復(fù)合物，極大地方便了今后對Pol δ詳細結(jié)構(gòu)以及其在生物體內(nèi)確切功能的研究。

4 小結(jié)與展望

哺乳動物Pol δ作為細胞內(nèi)多種生物過程中起重要作用的聚合酶，自1976年被發(fā)現(xiàn)以來，其結(jié)構(gòu)和功能得到了廣泛深入的研究。從早期分離得到由p125和p50組成的Pol δ異源二聚體，到相繼發(fā)現(xiàn)其第三和第四亞基，這些發(fā)現(xiàn)都有賴于蛋白質(zhì)分離純化技術(shù)的發(fā)展。盡管如此，從天然來源分離高純度、高活性的Pol δ仍然面臨著諸多挑戰(zhàn)，從而阻礙了對Pol δ結(jié)構(gòu)與功能的深入研究。盡管有研究報道了S.cerevisiaePol δ的亞基Pol3p以及哺乳動物Pol δ p50與p68亞基復(fù)合體的晶體三維結(jié)構(gòu)及其詳細功能分析[33-34]，然而，哺乳動物Pol δ全酶的晶體結(jié)構(gòu)仍未見報道。近年來隨著冷凍電鏡三維重構(gòu)技術(shù)的成熟，為Pol δ三維結(jié)構(gòu)的獲得帶來了希望，冷凍電鏡技術(shù)能夠在不需要樣品結(jié)晶，保持樣品的近生理狀態(tài)下解析生物大分子復(fù)合體的高分辨率三維結(jié)構(gòu)。如今，高純度Pol δ的制備為解析Pol δ全酶晶體結(jié)構(gòu)奠定了基礎(chǔ)，也為從原子水平研究Pol δ及各亞基在DNA復(fù)制和各種修復(fù)途徑中的作用提供了可能。鑒于Pol δ在DNA復(fù)制、修復(fù)和腫瘤發(fā)生中的重要作用，Pol δ可能成為某些小分子復(fù)制抑制劑的靶標(biāo)，而對于Pol δ全酶詳細功能的研究，闡明其在癌癥、老年性疾病和其他疾病中的作用機制，能夠為將來設(shè)計全新有效的腫瘤診斷和治療方法提供理論依據(jù)。