張來軍，李曉梅，陳永敢

(海南熱帶海洋學(xué)院 生命科學(xué)與生態(tài)學(xué)院 兩棲爬行動物研究省級重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，三亞 572022)

1 構(gòu)建生態(tài)毒理學(xué)綜合實(shí)驗(yàn)課程的必要性

生態(tài)毒理學(xué)是研究環(huán)境中有害有毒因子對生態(tài)系統(tǒng)中非人類生物的危害及其機(jī)制的課程。隨著沿海經(jīng)濟(jì)的迅速發(fā)展，海洋開發(fā)利用程度的加強(qiáng)，大量農(nóng)業(yè)廢水、養(yǎng)殖廢水和生活污水排入海洋，使得海洋近岸富營養(yǎng)化程度和有毒有害物質(zhì)污染日趨嚴(yán)重，造成生態(tài)環(huán)境破壞和退化現(xiàn)象。我校是一所以海洋、生態(tài)為特色的應(yīng)用型本科院校，為了適應(yīng)當(dāng)前社會經(jīng)濟(jì)建設(shè)的需要，順應(yīng)堅(jiān)持應(yīng)用技術(shù)型人才培養(yǎng)的科學(xué)發(fā)展觀，“以學(xué)生全面發(fā)展為目標(biāo)”，加強(qiáng)素質(zhì)教育，參考辦學(xué)條件和學(xué)生培養(yǎng)目標(biāo)，對在生物科學(xué)以及生態(tài)學(xué)專業(yè)開設(shè)具有“海洋”特色的生態(tài)毒理學(xué)綜合實(shí)驗(yàn)教學(xué)課程做架構(gòu)設(shè)計，以期為以海洋為特色的辦學(xué)目標(biāo)提供參考。

在本科學(xué)習(xí)階段，各門理論課程及其實(shí)驗(yàn)教學(xué)內(nèi)容在教學(xué)過程中自成體系，很少會將各門理論知識在教學(xué)中融為一體。由于對本專業(yè)知識不能融會貫通，學(xué)生難以提高學(xué)習(xí)興趣，教學(xué)效果不理想。針對具體學(xué)校具體專業(yè)，將生態(tài)毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)課程與其它各課程進(jìn)行有機(jī)整合，不僅達(dá)到該課程的教學(xué)目標(biāo)，也提高了學(xué)生學(xué)習(xí)的興趣和探索精神，培養(yǎng)學(xué)生的創(chuàng)新意識、創(chuàng)新精神和開拓能力，以滿足高等教育培養(yǎng)應(yīng)用型人才、創(chuàng)新型人才，實(shí)現(xiàn)素質(zhì)教育目標(biāo)的客觀要求。

2 生態(tài)毒理學(xué)綜合實(shí)驗(yàn)教學(xué)課程的內(nèi)容框架

2.1 選擇合適的實(shí)驗(yàn)材料

指示生物法是生物監(jiān)測中最主要的方法。作為指示海洋污染的受試動物需要具備幾個基本條件：能累積一定的污染物而不會死亡；能代表污染海域的生物群落；種群密度大，易于采集和在實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)存活；較長的壽命；個體足夠大，能提供組織細(xì)胞供分析；不同條件下，所有動物個體內(nèi)污染物濃度與環(huán)境的平均濃度表現(xiàn)一致的相關(guān)性[1]。合格的實(shí)驗(yàn)動物是保證毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)質(zhì)量的基本要求，也是作為環(huán)境危害評估參考的基本條件。目前國內(nèi)外科研人員進(jìn)行海洋環(huán)境生物監(jiān)測研究時，常用到的實(shí)驗(yàn)動物是魚類[2-6]和軟體動物[7-11]。參考國內(nèi)外的研究資料[12-14]，以及本實(shí)驗(yàn)室?guī)啄甑膶?shí)踐積累[15-16]，認(rèn)為海洋多毛類沙蠶完全具備上述實(shí)驗(yàn)動物的特征，是一種優(yōu)良的實(shí)驗(yàn)材料，可以滿足生態(tài)毒理學(xué)科研以及實(shí)驗(yàn)教學(xué)的需要。

沙蠶棲息于河口、沿海灘涂、潮間帶的沙泥中，成蟲以腐殖質(zhì)為食。相較于魚類和軟體動物，個體小，易于存活，便于在實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)，作為休閑垂釣的誘餌可在漁具商店或水產(chǎn)養(yǎng)殖場購買得到。提取沙蠶體腔細(xì)胞的方法簡單，所需組織少，細(xì)胞數(shù)量多且純凈，能滿足多個實(shí)驗(yàn)的需要[15]。所以沙蠶是對河口，沿海灘涂進(jìn)行污染監(jiān)測的理想研究材料。我們將生態(tài)毒理學(xué)綜合實(shí)驗(yàn)教學(xué)的實(shí)驗(yàn)材料確定為沙蠶。

2.2 綜合實(shí)驗(yàn)教學(xué)內(nèi)容構(gòu)架

生物對環(huán)境變化的反應(yīng)是多層次的，從基因、生物大分子到組織、器官、個體，直至種群、群落和生態(tài)系統(tǒng)。我們選擇的實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目，包括從沙蠶個體水平、細(xì)胞水平、分子水平等動物有機(jī)體各層次對外界環(huán)境的反應(yīng)(表1)。

實(shí)驗(yàn)教學(xué)內(nèi)容可以分為三部分。第一部分為基礎(chǔ)性實(shí)驗(yàn)，包括沙蠶體腔細(xì)胞的提取，細(xì)胞大小測定及計數(shù)、細(xì)胞死活鑒定。第二部分為綜合實(shí)驗(yàn)，需要在第一部分實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上進(jìn)行，包括中性紅保留實(shí)驗(yàn)，彗星電泳，微核實(shí)驗(yàn)以及抗氧化酶活性分析。所提取的沙蠶體腔細(xì)胞，在鑒定完存活率后，用于中性紅保留實(shí)驗(yàn)和彗星電泳實(shí)驗(yàn)；固定后的細(xì)胞用于微核實(shí)驗(yàn)；剩余的沙蠶組織妥善保存，用于抗氧化酶活性分析。這樣就通過對同一批實(shí)驗(yàn)材料的不同處理將一系列實(shí)驗(yàn)串在一起，用多個實(shí)驗(yàn)手段解決一個研究課題，成為一個相對系統(tǒng)的實(shí)驗(yàn)，使學(xué)生從不同的層次理解沙蠶這種生物在受到外界環(huán)境影響后產(chǎn)生的反應(yīng)。第三部分為設(shè)計性實(shí)驗(yàn)，是在綜合性實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上進(jìn)行的探索性實(shí)驗(yàn)，可以聯(lián)系當(dāng)前熱點(diǎn)問題，與一些科研項(xiàng)目相結(jié)合，構(gòu)建成一個連續(xù)的研究型生態(tài)毒理學(xué)綜合實(shí)驗(yàn)；如被重金屬、油類或殺蟲劑等各類污染物污染的河口，碼頭或?yàn)┩繉ι承Q的生態(tài)毒理效應(yīng)實(shí)驗(yàn)，并可進(jìn)一步分析這些地方的海洋環(huán)境壓力。

不同實(shí)驗(yàn)內(nèi)容彼此之間具有相關(guān)性及連續(xù)性。這些實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目既是國內(nèi)外生態(tài)毒理學(xué)研究常規(guī)的實(shí)驗(yàn)技術(shù)，也緊密聯(lián)系于動物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、遺傳學(xué)及生物化學(xué)等本科期間必修課程的內(nèi)容，需將各門課程有機(jī)聯(lián)系起來。學(xué)生連續(xù)完整地體驗(yàn)了以同一種實(shí)驗(yàn)動物為研究對象，通過其個體、細(xì)胞、DNA分子及蛋白質(zhì)分子方方面面，認(rèn)識海洋環(huán)境中的污染物對生物個體各個層次可能產(chǎn)生的影響。

通過系列實(shí)驗(yàn)，學(xué)生系統(tǒng)地學(xué)習(xí)和掌握了海洋環(huán)境污染生物監(jiān)測中常用的實(shí)驗(yàn)技術(shù)方法，又從生物整體角度對實(shí)驗(yàn)內(nèi)容進(jìn)行理解和分析，強(qiáng)化了相關(guān)課程的基礎(chǔ)理論知識，成為既懂理論又精通設(shè)計綜合性實(shí)驗(yàn)方案，并具備獨(dú)立工作能力和科技創(chuàng)新能力的人才。

表1 生態(tài)毒理學(xué)綜合實(shí)驗(yàn)內(nèi)容構(gòu)架

3 生態(tài)毒理學(xué)綜合實(shí)驗(yàn)課程的教學(xué)安排

3.1 教學(xué)安排

基礎(chǔ)性實(shí)驗(yàn)部分的細(xì)胞計數(shù)，細(xì)胞大小測定都是細(xì)胞生物學(xué)課程傳統(tǒng)的實(shí)驗(yàn)內(nèi)容，只是所用的實(shí)驗(yàn)材料各有特色，一般選用動物血細(xì)胞、培養(yǎng)的單胞藻、原生動物或者是細(xì)胞的永久裝片作為實(shí)驗(yàn)材料。所以，這個綜合性實(shí)驗(yàn)順利開展的關(guān)鍵在于實(shí)驗(yàn)材料的選擇；確定以沙蠶作為實(shí)驗(yàn)材料，提取沙蠶體腔細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)，細(xì)胞測量及細(xì)胞存活率的測定?；A(chǔ)性實(shí)驗(yàn)開設(shè)之后，綜合性實(shí)驗(yàn)的開展就得心應(yīng)手了，尤其是中性紅保留實(shí)驗(yàn)，微核實(shí)驗(yàn)，這些實(shí)驗(yàn)操作步驟不多，只需要仔細(xì)觀察和計數(shù)。綜合性實(shí)驗(yàn)?zāi)K順利進(jìn)行面臨的另一個教學(xué)改革是需要實(shí)驗(yàn)室全天開放。以全天候開放、教師指導(dǎo)、學(xué)生獨(dú)立完成實(shí)驗(yàn)的研究項(xiàng)目方式進(jìn)行，參考學(xué)時為18。

基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)?zāi)K可以在大學(xué)二年級，與動物學(xué)及細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)課程結(jié)合進(jìn)行；綜合實(shí)驗(yàn)?zāi)K放在大學(xué)三年級，與學(xué)年論文結(jié)合開展，以及大學(xué)四年級與畢業(yè)設(shè)計結(jié)合。從教學(xué)內(nèi)容上和教學(xué)時間上都不與其他課程相沖突，沒有對學(xué)生造成額外的學(xué)習(xí)負(fù)擔(dān)。

3.2 考核方式

本實(shí)驗(yàn)的教學(xué)內(nèi)容互相關(guān)聯(lián)，是一個綜合實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目，可以以科研項(xiàng)目的形式展開，學(xué)生在進(jìn)入實(shí)驗(yàn)室前，提交預(yù)習(xí)報告，明確實(shí)驗(yàn)方案、實(shí)驗(yàn)計劃及預(yù)期實(shí)驗(yàn)結(jié)果；完成每一項(xiàng)實(shí)驗(yàn)后，需要記錄實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，大多數(shù)實(shí)驗(yàn)還必須照相，保留照片，書寫實(shí)驗(yàn)報告；系列實(shí)驗(yàn)完成后，對數(shù)據(jù)統(tǒng)計整理成研究論文的形式，以提交學(xué)年論文及完成畢業(yè)論文。

3.3 教學(xué)效果和存在的問題

生態(tài)毒理學(xué)綜合實(shí)驗(yàn)已經(jīng)完整運(yùn)行了一屆學(xué)生，歷時兩年，取得了良好效果。學(xué)生通過這個實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｊ絽⑴c科研項(xiàng)目，所取得的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)和結(jié)果經(jīng)過整理被核心期刊認(rèn)可和接受[15-16]。

所選擇的實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目中，內(nèi)容所涉及的理論課程都是學(xué)生的必修課，使學(xué)生易于理解實(shí)驗(yàn)原理。但是個別實(shí)驗(yàn)操作上具有一定難度，如彗星電泳。在眾多的檢測DNA鏈損傷的實(shí)驗(yàn)中，彗星電泳具有其他實(shí)驗(yàn)技術(shù)，如微核實(shí)驗(yàn)、姊妹染色體交換無法替代的優(yōu)勢，微核檢測是在DNA鏈損傷后，產(chǎn)生的染色體斷片獨(dú)立于子細(xì)胞核外成為較小的細(xì)胞核或微核；姊妹染色單體交換實(shí)驗(yàn)也是在DNA鏈損傷后，對姊妹染色單體之間的染色體片段交換進(jìn)行了評估，這兩種檢測都是在DNA鏈損傷之后造成下游畸變的計數(shù)。而彗星電泳能夠測量單個細(xì)胞的DNA損傷；只需要少量細(xì)胞進(jìn)行檢測(<10 000)；幾乎可以對任何真核細(xì)胞類型進(jìn)行檢測；而且是一種非常敏感的DNA損傷檢測方法[17]。但是常規(guī)的彗星實(shí)驗(yàn)步驟中的 “三明治”鋪膠方法[18]操作難度高，學(xué)生不易掌握而難以普及。運(yùn)用專利技術(shù)[19-20]對彗星電泳的鋪膠過程進(jìn)行了改良，簡化步驟，避免操作過程中繁瑣費(fèi)時及脫膠率高等不足，學(xué)生在短時間內(nèi)可以快速掌握，熟練應(yīng)用。

4 小結(jié)

由于這個綜合性實(shí)驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)內(nèi)容相互關(guān)聯(lián)，對同一批實(shí)驗(yàn)材料沙蠶用不同實(shí)驗(yàn)技術(shù)處理反映了問題的不同方面，容易引起學(xué)生的探索和求知欲；并且大多數(shù)實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目是以真實(shí)的圖像，直觀生動地呈現(xiàn)在學(xué)生面前，提高了學(xué)生做實(shí)驗(yàn)的興趣。所以將這些實(shí)驗(yàn)課程融入常規(guī)的教學(xué)中，不僅培養(yǎng)了學(xué)生的動手能力和創(chuàng)新能力，也給學(xué)生們提供了充分展示自己運(yùn)用知識和才能的空間。